CN116515926A - 一种单链dna制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单链DNA制备方法，包括如下步骤：(1)准备具有粘性末端的双链DNA序列和茎环引物，所述茎环引物包括成环部分和非成环部分，所述非成环部分含有与所述粘性末端互补的互补序列，利用所述互补序列与双链DNA序列的所述粘性末端互补连接；(2)使用具有双链外切酶活性的DNA外切酶对步骤(1)获得的长茎环引物从5’端或3’端进行酶切，直至切割至茎环位置停止，获得单链DNA。本发明的单链DNA制备方法操作简便，无需复杂的操作流程，成本较低，使用试剂都是市场上较易购买的，不受序列长度限制，可制备小至几十个碱基、大至5‑10kb的单链产物。
Description
技术领域
本发明一种单链DNA制备方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
单链DNA是以单链状态存在的DNA，在生命科学研究领域是一个重要的工具，普通引物合成都是单链DNA，可以用于PCR扩增和基因的测序，另外在核酸杂交领域，单链DNA可以用作探针与靶基因杂交，相比双链探针，由于没有双链探针中互补链带来的探针封闭效应，检测灵敏度要高。
目前单链DNA通常采用化学合成法制备，但长度有限制，价格昂贵，产量也不高，也有一些通过酶促反应获得，例如通过转录酶合成RNA，进而反转录成cDNA单链；通过单引物扩增，然后去除双链模板获得单链等，但这些方法大都存在产量低，纯度低等特点。
申请公布号为CN110699407A的中国发明专利公开了一种长单链DNA的制备方法，该方法主要包括设计并构建重组噬菌粒，获得噬菌粒环状单链DNA步骤，同时采用I类脱氧核酶和II类脱氧核酶突变体切割环状单链DNA，纯化回收酶切得到长单链DNA。但是该方法需要设计并构建重组噬菌粒，存在操作流程复杂、不易大规模推广使用的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种单链DNA制备方法，已解决现有技术中单链DNA制备流程复杂、产量和纯度较低的问题。
为了实现上述目的，本发明中一种单链DNA制备方法的技术方案是：
一种单链DNA制备方法，包括如下步骤：
(1)准备具有粘性末端的双链DNA序列和茎环引物，所述茎环引物包括成环部分和非成环部分，所述非成环部分含有与所述粘性末端互补的互补序列，利用所述互补序列与双链DNA序列的所述粘性末端互补连接；
(2)使用具有双链外切酶活性的DNA外切酶对步骤(1)获得的长茎环引物从5’端或3’端进行酶切，直至切割至茎环位置停止，获得单链DNA。
上述技术方案的有益效果在于：本发明设计合成茎环引物，与含有目标单链DNA的双链DNA序列连接形成长茎环引物，利用双链外切酶只对双链DNA有活性，对单链DNA无活性，对形成长茎环引物从5’端或3’端进行酶切，获得单链DNA。该方法操作简便，无需复杂的操作流程，得率较高，且不受序列长度限制。
具体地，具有粘性末端的双链DNA序列可以从含有目的片段的质粒中酶切获得，也可以通过设计含有酶切位点(酶切后形成粘性末端)的引物，进行PCR扩增再进行酶切后获得。若不想最后获得的单链含有其他无关序列，可将目的序列的最后8-10个碱基作为茎环引物的成环序列，在后面添加最后8-10个碱基之前的反向互补序列，例如序列是a-b-c，a是400bp，b是20bp，c是8bp，单链制备时可分为长片段a和茎环引物b-c-b’，b’是b的反向互补序列。
作为进一步地改进，所述成环部分长度为8-10bp。
上述技术方案的有益效果在于：成环部分控制在上述长度可以减少不必要的二级结构，若成环序列过长，有可能会形成其他的二级结构，导致成环位置不唯一，会造成最后得到的单链不单一。
具体地，茎环引物的5’端磷酸化修饰。
作为进一步地改进，所述非成环部分包括互补臂和所述互补序列，互补臂的长度为18-22bp。
作为进一步地改进，所述茎环引物的成环部分和互补臂的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。
上述技术方案的有益效果在于：上述序列引物经过退火后，可以形成特定二级结构的茎环引物。
作为进一步地改进，所述互补序列的长度为2-4bp。
上述技术方案的有益效果在于：常用的内切酶产生的末端大多是4碱基和2碱基，在制备时可以根据需要选择适宜的内切酶，为实验提供更多选择。
作为进一步地改进，所述DNA外切酶为Exonuclease III酶，沿着长茎环引物3’端切割至茎环位置时，由于无双链DNA结构，切割即停止。
上述技术方案的有益效果在于：Exonuclease III酶只对双链DNA有活性，对单链DNA无活性，且易于购买，价格较低，制备单链DNA的成本较低。
作为进一步地改进，当目标的单链DNA为双链DNA序列的正义链时，茎环引物与双链DNA的3’端连接；当目标的单链DNA为双链DNA序列的反义链时，茎环引物与双链DNA的5’端连接。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
第一，操作简便，无需复杂的操作流程；
第二，成本较低，使用试剂都是市场上较易购买、价格较低的酶；
第三，得率较高，每次反应可得到10-30ug的单链产物；
第四，不受序列长度限制，可制备小至几十个碱基，大至5-10kb的单链产物。
附图说明
图1为本发明实施例1中单链DNA制备的流程图；
图2为本发明实施例1中Bsa I单酶切后电泳图(其中，M为marker DL5000(从上往下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100)，1为质粒Bsa I单酶切)；
图3为本发明实施例1中引物退火后形成的茎环结构1；
图4为本发明实施例1中引物退火后形成的茎环结构2；
图5为本发明实施例1Exonuclease III酶切前后电泳结果(其中，M为markerDL5000(从上往下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250)，1为片段ExonucleaseIII酶切前，2为片段Exonuclease III酶切后)。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例的单链DNA制备方法，从含有目标基因序列的质粒中获取具有粘性末端的双链DNA序列，再与茎环引物连接后，使用ExonucleaseIII酶切消化，纯化后获得单链DNA，制备原理如图1所示，具体实施操作如下：
1、质粒DNA酶切
将含有SEQ ID NO 2所示目标序列的质粒使用Bsa I单酶切，酶切体系见表1。
表1 Bsa I单酶切体系
| 质粒DNA | ～2μg |
| BsaI-HF | 1μL |
| Cutsmart buffer | 5μL |
| ddH2O | to 50μL |
酶切条件：37℃2h，80℃20min。
酶切反应完成后，产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳，电泳图如图2所示。对目的片段(700bp)进行切胶，使用胶回收试剂盒对片段进行回收。
2、茎环引物退火
引物序列：ATGCgatcgatcttagtgatgcctaagcagtaaggcatcactaagatcgatc(SEQ IDNO 3所示)，引物5’端磷酸化修饰。
将上述100μM的引物溶液放置在沸腾的水溶液中，维持5min，转移至室温缓慢冷却，待恢复至室温后即可进行下一步实验。退火后茎环引物可以形成如图3所示的茎环结构1和/或如图4所示的茎环结构2。
3、酶切产物和茎环引物连接
由SEQ ID NO 2所示的序列可知，其中包含两个BsaI酶切位点，质粒用BsaI单酶切后，序列两端BsaI产生的粘性末端不同，上游为5’-CGTA-3’，下游为5’-ATGC-3’，因此茎环引物只能与靶序列的下游进行连接，形成长链茎环序列。
将步骤1的酶切产物和步骤2的茎环引物使用T4连接酶连接，连接体系见表2。
表2 T4连接酶连接体系
| 酶切产物 | 30μL |
| 茎环引物 | 10μL |
| T4连接酶 | 1μL |
| T4连接酶buffer | 5μL |
| ddH2O | to 50μL |
连接条件：16℃过夜。
连接产物使用产物纯化试剂盒进行回收。
4、ExonucleaseIII酶切消化
使用ExonucleaseIII酶对步骤3回收的连接产物进行酶切消化，酶切体系见表3。
表3 ExonucleaseIII酶切体系
| 连接产物 | 30μL |
| ExonucleaseIII | 1μL |
| 10×Exonuclease III buffer | 5μL |
| ddH2O | to 50μL |
酶切条件：37℃1h，70℃20min。
ExonucleaseIII酶只对双链DNA有活性，对单链DNA无活性，因此当外切酶沿着3’端切割至茎环位置时，由于无双链DNA结构，切割即可停止。
酶切反应完成后，取少量产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳，电泳图如图5所示，由图可以看出经ExonucleaseIII酶切后获得单一的DNA单链，无双链DNA的污染。剩余酶切产物使用产物纯化试剂盒回收，即获得单链DNA。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的专利保护范围以权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种单链DNA制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准备具有粘性末端的双链DNA序列和茎环引物，所述茎环引物包括成环部分和非成环部分，所述非成环部分含有与所述粘性末端互补的互补序列，利用所述互补序列与双链DNA序列的所述粘性末端互补连接；
(2)使用具有双链外切酶活性的DNA外切酶对步骤(1)获得的长茎环引物从5’端或3’端进行酶切，直至切割至茎环位置停止，获得单链DNA。
2.根据权利要求1所述的单链DNA制备方法，其特征在于：所述成环部分长度为8-10bp。
3.根据权利要求1所述的单链DNA制备方法，其特征在于：所述非成环部分包括互补臂和所述互补序列，互补臂的长度为18-22bp。
4.根据权利要求3所述的单链DNA制备方法，其特征在于：所述茎环引物的成环部分和互补臂的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
5.根据权利要求3所述的单链DNA制备方法，其特征在于：所述互补序列的长度为2-4bp。
6.根据权利要求1所述的单链DNA制备方法，其特征在于：所述DNA外切酶为Exonuclease III酶，沿着长茎环引物3’端切割至茎环位置时，由于无双链DNA结构，切割即停止。
7.根据权利要求6所述的单链DNA制备方法，其特征在于：当目标的单链DNA为双链DNA序列的正义链时，茎环引物与双链DNA的3’端连接；当目标的单链DNA为双链DNA序列的反义链时，茎环引物与双链DNA的5’端连接。
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