CN116515674A - 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用 - Google Patents

一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116515674A
CN116515674A CN202310123821.3A CN202310123821A CN116515674A CN 116515674 A CN116515674 A CN 116515674A CN 202310123821 A CN202310123821 A CN 202310123821A CN 116515674 A CN116515674 A CN 116515674A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enterococcus faecalis
product
composition
hyperuricemia
uric acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310123821.3A
Other languages
English (en)
Inventor
胡永飞
李德鹏
刘丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202310123821.3A priority Critical patent/CN116515674A/zh
Publication of CN116515674A publication Critical patent/CN116515674A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用。本发明首次分离出鸡源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CML390，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26208，其16S rRNA基因含有序列表中SEQ ID NO.1。实验证明，该粪肠球菌CML390具有降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平以及治疗/缓解小鼠高尿酸血症症状的作用，可应用于开发或制备治疗和/或缓解高尿酸血症或痛风或代谢性疾病的药物，进而降低痛风的发病率。

Description

一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的作用。
背景技术
高尿酸血症是人体由嘌呤代谢紊乱、尿酸排泄障碍导致的血清尿酸升高的一种代谢疾病。随着人类生活水平的提高，外源性嘌呤核苷的摄入增加和内源性嘌呤核苷的产生增多，高尿酸血症的发病在世界范围内已经变的很流行。高尿酸血症病程较长，病情易反复，很容易发展成痛风，给患者带来极大的损害。
目前，主要通过在饮食中添加芹菜素、木犀草素、益生菌和益生元等物质来缓解高尿酸血症。也有通过盐酸乙胺丁醇、别嘌呤醇等药物来缓解高尿酸血症，但是这些成效参差不齐，且部分会存在一定的副作用，对身体有不安全的因素，会诱发一些其他的问题。另外，还有通过添加抗生素，以抑制肠道细菌过度增殖和减少细菌易位来改变肠道菌群，减少有害细菌产物对肝脏肾脏的损伤，从而降低尿酸在体内的蓄积，但抗生素的使用容易引起菌群紊乱以及机体耐药性增强。
近年来，肠道微生物缓解疾病的途径引起了越来越多研究者的关注，高尿酸血症的发生发展与肠道微生物失调之间的联系被广泛认可。目前微生物作为一种新型的治疗方案已经在多种肠道疾病的治疗中取得了良好成效，且在代谢性疾病的治疗中逐渐体现出其优势。
由于高尿酸血症的影响因素较多且现存的治疗方法存在不足。因此，本领域迫切需要开发一种新的，无副作用的，用于治疗/缓解高尿酸血症的益生菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备治疗/缓解高尿酸血症的产品和/或如何制备治疗/缓解高尿酸血症的无毒副作用的产品和/或如何降低血清尿酸水平和/或如何降低血清肌酐水平和/或如何降低血清尿素氮水平和/或如何缓解肝脏损伤和/或如何降低肾脏损伤。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了粪肠球菌，所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其菌株号为CML390，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26208。
粪肠球菌CML390的最佳生长条件为37℃、厌氧，在GAM琼脂培养基上培养24h的菌落为浅白色，圆形，边缘呈不规则波状，直径约为1-2mm。粪肠球菌CML390 24小时的生长曲线为在4h进入对数生长期，12h进入平台期，24h开始出现下降。
上述粪肠球菌中，所述粪肠球菌的16S rRNA基因可含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
上述粪肠球菌的培养物也属于本发明的保护范围。所述培养物可为将上文所述的粪肠球菌在微生物培养基中培养得到的物质。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂可含有上文所述的粪肠球菌或/和上文所述的粪肠球菌的代谢物或/和上文所述的培养物。
上文所述菌剂可具有下述至少一种特性：
A1)降低血清尿酸水平；
A2)降低血清肌酐水平；
A3)降低血清尿素氮水平；
A4)缓解肝脏损伤；
A5)降低肾脏损伤。
上文所述粪肠球菌的培养物是将粪肠球菌在微生物培养基中培养得到的物质(如含有粪肠球菌和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有粪肠球菌和分泌到固体培养基内的物质)。
上述菌剂的活性成分可为粪肠球菌或/和粪肠球菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，粪肠球菌或/和粪肠球菌的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述粪肠球菌的代谢物可为粪肠球菌的发酵液。粪肠球菌的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养粪肠球菌，收集发酵液(含有粪肠球菌和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为粪肠球菌的代谢物。
上文所述菌剂可为活菌菌剂、巴氏灭活菌菌剂或冻干粉菌剂。所述菌剂中所述粪肠球菌的有效菌浓度可大于等于109CFU/mL。
上文所述粪肠球菌的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：
B1)在制备降低血清尿酸水平产品中的应用；
B2)在制备降低血清肌酐水平的产品中的应用；
B3)在制备降低血清尿素氮水平的产品中的应用；
B4)在制备缓解肝脏损伤的产品中的应用；
B5)在制备降低肾脏损伤的产品中的应用；
B6)在开发或制备治疗和/或缓解高尿酸血症或痛风或代谢性疾病的产品中的应用。
上文所述菌剂的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：
C1)在制备降低血清尿酸水平产品中的应用；
C2)在制备降低血清肌酐水平的产品中的应用；
C3)在制备降低血清尿素氮水平的产品中的应用；
C4)在制备缓解肝脏损伤的产品中的应用；
C5)在制备降低肾脏损伤的产品中的应用；
C6)在开发或制备治疗和/或缓解高尿酸血症或痛风或代谢性疾病的产品中的应用。
上述应用中，所述产品可为药物、动物饲料或动物饲料添加剂。上文所述代谢性疾病可包括高尿酸血症。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上文所述的菌剂的方法，包括将上述的粪肠球菌在微生物培养基中培养的步骤。
所述微生物培养基的配方可为：
月示胨15g、胰酪蛋白胨10g、大豆胨3g、酵母浸粉5g、牛肉粉2g、消化血清粉13.5g、牛肝浸粉1.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钾2.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉0.3g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸钠0.15g，调节PH值为7.2±0.1。
本发明发现了一种新的，无毒副作用的，可用于缓解高尿酸血症的粪肠球菌(Enterococcue faecalis)菌种CML390，该粪肠球菌菌种可以缓解高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平、血清肌酐水平、血清尿素氮水平、肝脏损伤和肾脏损伤，有望被开发成为一种新型有效的益生菌，在高尿酸血症人群中具有十分广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：粪肠球菌
拉丁名：Enterococcue faecalis
菌株编号：CML390
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年12月23日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26208
附图说明
图1为粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390的菌液PCR扩增序列在EzBioCloud数据库上比对的结果。
图2为粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390在培养24小时时的图片。
图3为是粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390在厌氧条件下绘制的生长曲线图。
图4为粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390降低小鼠血清尿酸的结果。纵坐标为小鼠血清尿酸浓度值。**代表P<0.01，***代表P<0.001。
图5为粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390降低小鼠血清肌酐的结果。纵坐标为小鼠血清肌酐浓度值。***代表P<0.001。
图6为粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390降低小鼠血清尿素氮的结果。纵坐标为小鼠血清尿素氮浓度值。*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图7为肝脏的病理切片图。标尺为200μm。
图8为肾脏的病理切片图。标尺为200μm。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中的实验均设置三个重复，实验数据使用SPSS 24.0软件进行统计分析,采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例1粪肠球菌(Enterococcue faecalis)CML390的分离、培养及鉴定
1.粪肠球菌的分离和培养
分离样本来自于一只健康肉鸡的盲肠食糜，采用10倍梯度稀释涂布平板法对微生物进行分离纯化，采用改良GAM培养基(北京百旺通达生物科技有限公司)，在37℃的恒温厌氧操作箱(Whitley DG250 Anaerobic Workstation，百徕普惠(北京)科技有限公司)中进行厌氧培养48h，厌氧的气体成分为N2:CO2:H2＝80:10:10，挑取单菌落进行平板划线分纯，获得每株单菌的纯培养。参照试剂盒(DNeasy○R Blood&Tissue Kit,QIAGEN)对分离出来的菌株进行基因组DNA的提取，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，无弥散或拖尾现象；并用紫外分光光度计对抽提的DNA进行质量检测和浓度测定。将A260/280比值在1.8～2.0，浓度不低于20ng/μL的DNA样品判为合格。最后，采用16S rDNA的通用引物对合格的菌株基因组DNA进行PCR扩增，引物是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体序列如下：
上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；
下游引物1492R：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
PCR扩增体系和程序设置：
PCR反应体系：30μL体系中含菌株基因组DNA模板1.5μL，上、下游引物各1.5μL，25.5μL金牌Mix(北京擎科新业生物技术有限公司)。
PCR反应程序如下：
Stage 1:98℃，10min
Stage 3:72℃,5min
4℃,∞
2.菌株16S rDNA的测序及鉴定
将获得的16S rDNA扩增产物进行1.5％的凝胶电泳检测，将检验合格的扩增序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得长度为1559bp的16S rDNA序列(SEQID NO.1)，将16S rDNA序列在韩国EzBioCloud数据库上(https://www.ezbiocloud.net/identify)进行序列比对，获得与该菌株同源性较高的菌是Enterococcue faecalis ATCC19433，相似度为100％(图1)。确认分离得到的菌株属于粪肠球菌(Enterococcuefaecalis)，将其命名为Enterococcue faecalis CML390，简称粪肠球菌CML390。
粪肠球菌CML390已于2022年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.26208。
测序结果如下所示：
SEQ ID NO.1：
5’-TATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAAGAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTTAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT-3’。
实施例2、粪肠球菌CML390的理化特性及降解尿酸的效果
本实施例主要考察粪肠球菌CML390的理化特性及降解尿酸的效果。
1.粪肠球菌CML390的菌落形态及特征
分离得到的粪肠球菌CML390菌株的最佳生长条件为37℃、厌氧，在GAM琼脂培养基上培养24h的菌落为浅白色，圆形，边缘呈不规则波状，直径约为1-2mm(图2)。
2.粪肠球菌CML390生长曲线的绘制
监测粪肠球菌CML390 24小时的生长曲线(图3)可以看出，粪肠球菌CML390在4h进入对数生长期，12h进入平台期，24h开始出现下降。具体过程如下：
1)将粪肠球菌CML390从-80℃冰箱取出，在平板上划线，将平板置于37℃厌氧操作箱中培养；
2)培养24h后从平板上挑取单个菌落接种至10mL改良GAM肉汤中，37℃厌氧培养24h；
3)准备三个相同的含10mL改良GAM肉汤的厌氧管，构成技术重复，将培养好的菌液按1％的接种量转接入三个10mL培养液中；
4)所有的培养液置于37℃厌氧操作箱中培养，每隔2h用酶标仪(Epoch2，美国BioTek公司)监测OD600nm值，直到OD600nm值不再上升，开始出现下降时，停止监测；以监测时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制粪肠球菌CML390的生长曲线(图3)。
3.粪肠球菌CML390在不同条件下降解尿酸的效果
实验操作如下：
1)菌富集培养：GAM培养基溶液用高压蒸汽锅灭菌后，加入1％-3％保存的菌液，之后放入37℃摇床中培养24h作一次纯化后，再接入到500mL培养基溶液中，放入37℃摇床24h后得到粪肠球菌CML390的培养物，进行下一步操作。
2)不同初始浓度尿酸溶液配制：分别在200mLPBS溶液中加入0.01g、0.016g和0.02g的尿酸，配制得到浓度分别为0.05g/L、0.08g/L和0.1g/L的尿酸溶液。
不同pH值尿酸溶液配制：在200mL PBS溶液中加入0.02g尿酸配制成0.1g/L尿酸溶液。分别调节pH值至6±0.1、7±0.1和8±0.1。
3)洗菌分装：把富集后的粪肠球菌CML390的培养物放在离心机中离心，4000rmp，10min，25℃，倒出上清液后，将步骤2)配制好的不同浓度的尿酸溶液和不同pH值的尿酸溶液分别加入含有菌沉淀的离心管中，吹打混匀，转移到100mL锥形瓶中。为了防止残留的尿酸在溶液中溶解，在对溶液进行分装时，要用注射器和过滤嘴先过滤后再与菌液混合，每个锥形瓶分装20mL。在探究不同温度下菌的降解效果时，一组放置在37℃摇床中，另外一组放置在41℃摇床中。
4)尿酸的测定：分别待24h，48h和72h后，取出锥形瓶，取1mL培养液加在离心管中，6000转速离心10min后，取上清液6μL加入到96孔板中，6μL蒸馏水作为空白对照，再在每个孔板中加入250μL尿酸检测试剂(南京建成尿酸检测试剂盒)，用移液枪吹打几次混匀，放入到37℃培养箱中10min后取出，用酶标仪测定OD值，波长设置为510nm，使用标准曲线法计算尿酸的含量。
实验结果如下：
1)粪肠球菌CML390在不同尿酸浓度下的降解效果
如表1所示，粪肠球菌CML390在24h的时候0.08g/L浓度的尿酸溶液中的尿酸降解率最高；在48-72h中，在0.05g/L浓度的尿酸溶液中的尿酸降解率最高。
表1.不同尿酸浓度下的降解率
2)粪肠球菌CML390在不同PH下尿酸的降解效果
如表2可知，粪肠球菌在初始酸碱值为pH＝6，pH＝7，pH＝8尿酸溶液中都能进行降解；在pH＝8时粪肠球菌CML390的尿酸降解率最高。
表2.不同PH下的尿酸降解率
3)粪肠球菌CML390在不同尿酸温度下尿酸的降解效果
如表3可知，在37℃和41℃下粪肠球菌CML390都能进行尿酸的降解，并且在41℃下尿酸降解率更高。
表3.不同温度下的尿酸降解率
实施例3粪肠球菌CML390具有治疗/缓解小鼠高尿酸血症的功能
本实施例所选取的小鼠模型为：在0.5mL日常饮水中添加1％的尿酸和4％的氧嗪酸钾诱导高尿酸血症，持续给小鼠灌胃造模试剂4周(每天灌胃1次，每只小鼠灌胃量为0.2mL)，得到高尿酸血症模型小鼠。期间予以灌胃粪肠球菌CML390。具体细节如下：
1.选用4周龄的昆明雄性小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)30只(体重22±2g)，随机分为3组，每组10只小鼠。在室温下饲养，自由饮食采食，经过一周适应饲养后，随机分成正常对照组(CON)、高尿酸血症模型组(HUA)、粪肠球菌组(CML390)。除正常对照组外，其他两组小鼠按照基础日粮1％的尿酸和4％的氧嗪酸钾进行灌胃，将尿酸和氧嗪酸钾溶解在0.5％的羧甲基纤维素钠中。此外，灌菌组小鼠按照109CFU/mL进行灌胃，每天灌胃1次，每只小鼠灌胃量为0.3mL，持续28天。
2.实验结果
1)粪肠球菌CML390可以降低小鼠血清尿酸水平
如图4所示，连续灌胃尿酸和氧嗪酸钾28天后，使用南京建成尿酸检测试剂盒对采集的小鼠血清进行尿酸含量的检测，结果发现高尿酸血症模型组的小鼠血清尿酸较正常对照组小鼠均显著升高，而通过灌胃粪肠球菌干预小鼠的血清尿酸较高尿酸血症模型组小鼠均显著降低。说明Enterococcus faecalis CML390可以降低小鼠血清尿酸水平。
2)粪肠球菌CML390可以降低小鼠血清肌酐水平
如图5所示，连续灌胃尿酸和氧嗪酸钾28天后，使用南京建成肌酐检测试剂盒对采集的小鼠血清进行肌酐含量的检测，结果发现高尿酸血症模型组的小鼠血清肌酐较正常对照组小鼠均显著升高，而通过灌胃粪肠球菌干预小鼠的血清肌酐较高尿酸血症模型组小鼠均显著降低。说明粪肠球菌CML390可以降低小鼠血清肌酐水平。
3)粪肠球菌CML390可以降低小鼠血清尿素氮水平
如图6所示，连续灌胃尿酸和氧嗪酸钾28天后，使用南京建成尿素氮检测试剂盒对采集的小鼠血清进行尿素氮含量的检测，结果发现高尿酸血症模型组的小鼠血清尿素氮较正常对照组小鼠均显著升高，而通过灌胃粪肠球菌干预小鼠的血清尿素氮较高尿酸血症模型组小鼠均显著降低。说明粪肠球菌CML390可以降低小鼠血清尿素氮水平。
4)粪肠球菌可以缓解小鼠高尿酸血症肝脏的损伤
采集小鼠肝脏组织，然后迅速浸泡在多聚甲醛溶液(碧云天生物公司，货号：P0099)中进行固定，然后进行脱水/包埋/切片/染色等组织病理切片过程。使用光学显微镜对肝脏切片进行观察的结果如图7，在对照组中，肝脏组织细胞大小均一，胞浆丰富，中央静脉结构正常，肝组织整体结构正常，未见病理改变。在模型组中，组织内可见大量肝细胞中胞浆淡染；组织部分中央静脉内大量炎性细胞聚集。在灌菌组中，组织内可见少量的肝细胞胞浆淡染，有轻微的炎性细胞浸润，并未见组织损伤和出血。说明粪肠球菌CML390可以缓解小鼠高尿酸血症肝脏的损伤。
采集小鼠肾脏组织，然后迅速浸泡在多聚甲醛溶液中进行固定，然后进行脱水/包埋/切片/染色等组织病理切片过程。使用光学显微镜对肾脏切片进行观察的结果如图8，在对照组，肾脏组织结构完整，未见病理变化。在模型组中，组织内可见部分肾小管上皮细胞水肿，胞浆淡染；肾小管上皮细胞刷状缘严重脱落，近曲小管管腔狭窄，肾小管间质有炎性细胞，；相邻近曲小管细胞之间边界不明显，肾小球呈现纤维化。在灌菌组中，肾脏中肾小管病理情况有所缓解，肾小球未见纤维化。说明粪肠球菌CML390可以缓解小鼠高尿酸血症肾脏的损伤。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.粪肠球菌，其特征在于，所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其菌株号为CML390，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26208。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌，其特征在于：所述粪肠球菌的16S rRNA基因含有序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
3.权利要求1或2所述的粪肠球菌的培养物，是将权利要求1或2所述的粪肠球菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2所述的粪肠球菌或/和权利要求1或2所述的粪肠球菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：
A1)降低血清尿酸水平；
A2)降低血清肌酐水平；
A3)降低血清尿素氮水平；
A4)缓解肝脏损伤；
A5)降低肾脏损伤。
6.权利要求1或2所述的粪肠球菌的下述至少一种应用：
B1)在制备降低血清尿酸水平产品中的应用；
B2)在制备降低血清肌酐水平的产品中的应用；
B3)在制备降低血清尿素氮水平的产品中的应用；
B4)在制备缓解肝脏损伤的产品中的应用；
B5)在制备降低肾脏损伤的产品中的应用；
B6)在开发或制备治疗和/或缓解高尿酸血症或痛风或代谢性疾病的产品中的应用。
7.权利要求4或5所述菌剂的下述至少一种应用：
C1)在制备降低血清尿酸水平产品中的应用；
C2)在制备降低血清肌酐水平的产品中的应用；
C3)在制备降低血清尿素氮水平的产品中的应用；
C4)在制备缓解肝脏损伤的产品中的应用；
C5)在制备降低肾脏损伤的产品中的应用；
C6)在开发或制备治疗和/或缓解高尿酸血症或痛风或代谢性疾病的产品中的应用。
8.根据权利要求5所述的菌剂或权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述产品为药物、动物饲料或动物饲料添加剂。
9.制备权利要求4或5所述的菌剂的方法，包括将权利要求1或2所述的粪肠球菌在微生物培养基中培养的步骤。
CN202310123821.3A 2023-02-16 2023-02-16 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用 Pending CN116515674A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310123821.3A CN116515674A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310123821.3A CN116515674A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116515674A true CN116515674A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87401877

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310123821.3A Pending CN116515674A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116515674A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108728382B (zh) 一株具降胆固醇及促进肠道短链脂肪酸产生能力的植物乳杆菌及其应用
CN114634901B (zh) 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌lc16及其培养方法与应用
CN112813003B (zh) 一株植物乳杆菌及其在制备缓解高血脂症引发的疾病的药物或食品中的应用
CN111676156B (zh) 一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌mrs及其发酵物和应用
CN111304119B (zh) 一种降解伏马毒素的饲用枯草芽孢杆菌及其应用
CN115927045B (zh) 具有降胆固醇、缓解由高脂血症引起肝损伤功能的唾液乳杆菌069及其应用
CN116083325B (zh) 一种改善幽门螺杆菌相关性胃肠疾病的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN116179440B (zh) 一株鸡源贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN114686402A (zh) 乳酸乳球菌乳酸亚种hfy14及其应用
CN113293118A (zh) 一种鼠李糖乳杆菌lr3001及其应用
CN113337428A (zh) 一株植物乳杆菌hnu082及其用途
CN117327608A (zh) 鼠李糖乳杆菌菌株及其用途
CN114561318B (zh) 一株鼠乳杆菌及其在治疗ii型糖尿病中的应用
CN113797232B (zh) 具有缓解胰岛素抵抗功能的组合物及其应用
CN116656573A (zh) 约氏乳杆菌及含该约氏乳杆菌的菌剂、后生元和药物
CN114921361B (zh) 具有改善酒精性肝损伤的植物乳杆菌zy08及其应用
CN116515674A (zh) 一种粪肠球菌及其在治疗或缓解高尿酸血症中的应用
CN113512559B (zh) 牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用
CN115418332A (zh) 一种具有预防和改善化学性肝损伤的植物乳杆菌
CN116042482B (zh) 一种鸟乳杆菌及其在制备治疗或缓解高尿酸血症的产品中的应用
CN108004181B (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用
CN115449490B (zh) 一种单形巨单胞菌及其应用
CN115975846B (zh) 一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法
CN114196575B (zh) 一株大熊猫源巴黎链球菌及其应用
CN112813009B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination