CN116509891A - L-N-异丁酰基半胱氨酸结合的金团簇Au15(L-NIBC)13及其组合物和应用 - Google Patents

L-N-异丁酰基半胱氨酸结合的金团簇Au15(L-NIBC)13及其组合物和应用 Download PDF

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Abstract

L‑N‑异丁酰基半胱氨酸结合的金团簇Au15(L‑NIBC)13，其在治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼中的应用，和其在制备用于治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼的药物中的应用。用于治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼的组合物和方法。

Description

L-N-异丁酰基半胱氨酸结合的金团簇Au15(L-NIBC)13及其组合 物和应用
技术领域
本发明涉及金团簇，尤其涉及L-N-异丁酰基半胱氨酸(L-NIBC)结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13，包含金团簇分子Au15(L-NIBC)13的组合物，使用所述金团簇分子Au15(L-NIBC)13制备治疗各种疾病的药物，以及使用所述金团簇分子Au15(L-NIBC)13治疗各种疾病的方法。
背景技术
金团簇(Gold clusters,AuCs)是指含有配体结合的金核且金核小于3nm的一类物质。由于能级分裂，金团簇表现出类分子特性，从而可用分子式来表述金团簇中的各个金团簇分子。但是，在金团簇中，金团簇分子的金原子数目可在2到1000之间变化，配体的数目也可在1-1000之间变化；让情形变得更加复杂的是，即使对具有相同金原子数目的金团簇，其配体的数目也会因配体种类及制备条件的不同而变化。因此，在同一配体结合的金团簇中，到底存在哪些特定金原子数目和特定配体数目的金团簇分子还是一个未知数。
发明内容
本发明提供L-N-异丁酰基半胱氨酸(L-NIBC)结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13，金团簇分子Au15(L-NIBC)13在制备治疗疾病药物中的应用，包含金团簇分子Au15(L-NIBC)13的组合物，以及应用金团簇分子Au15(L-NIBC)13治疗疾病的方法。
在本发明的一些实施方案中，本发明提供了L-NIBC结合的金团簇分子，包含金核和与金核结合的配体L-NIBC，其中所述L-NIBC结合的金团簇分子具有分子式Au15(L-NIBC)13。
在本发明的一些实施方案中，本发明提供了所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13在制备治疗疾病药物中的应用。疾病包括多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)和青光眼。
在本发明的一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病的组合物，所述组合物包含所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13。在本发明的一些实施方案中，当L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13作为金团簇分子混合物中的一个组份在所述组合物中使用时，其在所述混合物中的色谱含量至少是7％。在本发明的一些实施方案中，疾病包括多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)和青光眼。
在本发明的一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包含给予组合物；所述组合物包含所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13。在本发明的一些实施方案中，当L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13当作为金团簇分子混合物中的一个组份在所述组合物中应用时，其在所述混合物中的色谱含量至少是7％。在本发明的一些实施方案中，疾病包括多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)和青光眼。
附图说明
图1显示S2(Au15(L-NIBC)13)的质谱图。图1A为S2(Au15(L-NIBC)13)的ESI质谱图(大范围)；图1B-1D为不同质荷比(m/z)的质谱峰放大后所显示的质谱同位素峰，图1B中z＝-2；图1C中z＝-3；图1D中z＝-4。
图2显示S2的紫外可见吸收光谱图。
图3显示S2与单独配体L-NIBC的红外(IR)吸收光谱图。
图4显示S2随初始水溶液pH值的变化在水相和油相中分布的变化曲线图。
图5显示EAE模型药物测试行为学临床评分曲线图。
图6显示EAE小鼠模型中HE染色实验结果。图6A为炎症的组织学评分柱状图，###：相对于空白对照组，P<0.001；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9，P<0.05；图6B-6F分别是空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组和S9给药组的HE染色的代表性图片。
图7显示S2药物、S9药物和S9+S2混合药物的EAE模型小鼠的行为学临床得分曲线图。
图8显示S1、S2、S3和S9药物连续180天给药对雄性小鼠在Morris水迷宫测试中表现的影响的结果；图8A为在定位航行试验训练过程中的寻台潜伏期曲线图；图8B为穿台次数柱状图；图8C为目标象限游泳路程柱状图；图8D为目标象限停留时间柱状图。其中，#：相对于正常对照组，P<0.05；##：相对于正常对照组，P<0.01；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01。
图9显示S1、S2、S3和S9药物对APP/PS1双转基因AD模型小鼠脑内海马区和皮层中Aβ1-40斑块形成的影响效果柱状图。其中，*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01。
图10显示S1、S2、S3和S9药物对5xFAD转基因AD模型小鼠脑内Aβ斑块形成的影响效果；图10A为大脑皮层Aβ斑块数量的柱状图；图10B为海马区Aβ斑块数量的柱状图；图10C为海马下托内Aβ斑块数量的柱状图；图10D和10E分别为模型对照组和S2给药组小鼠大脑皮层内Aβ斑块的代表性染色图片；图10F和10G分别为模型对照组和S2给药组小鼠海马区内Aβ斑块的代表性染色图片；图10H和图10I分别为模型对照组和S2给药组小鼠海马下托内Aβ斑块的代表性染色图片。其中，*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9给药组，P<0.05。
图11显示S1、S2、S3和S9药物对5xFAD转基因AD模型小鼠大脑皮层和海马区内Iba1阳性细胞和GFAP阳性细胞计数的结果；图11A为大脑皮层内Iba1阳性细胞计数的柱状图；图11B为海马区内Iba1阳性细胞计数的柱状图；图11C为大脑皮层内GFAP阳性细胞计数的柱状图；图11D、海马区内GFAP阳性细胞计数的柱状图。其中，*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9，P<0.05。
图12显示S1、S2、S3和S9药物对CCl4造模肝硬化小鼠模型的小鼠血液指标的影响结果；图12A-12E分别为血液中ALT、AST、TBIL、MAO、ALB指标的柱状图。其中，#：相对于空白对照组，P<0.05；##：相对于空白对照组，P<0.01；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9给药组，P<0.05。
图13显示CCl4造模肝硬化小鼠模型的小鼠在不同给药条件下的肝组织HE染色代表性图片；图13A-13E分别为空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组、S9给药组的肝组织HE染色代表性图片；图13F为各组的病理评分柱状图。其中，*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9，P<0.05。
图14显示方法一造模同时给药的糖尿病模型中空腹血糖和糖耐量水平的试验结果；图14A为空腹血糖的柱状图；图14B为糖耐量的曲线图。其中，##：相对于空白对照组，P<0.01；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9给药组，P<0.05。
图15显示方法二造模后给药的糖尿病模型中空腹血糖和糖耐量的测试结果；图15A为急性给药后糖耐量的曲线图；图15B为连续给药1个月后空腹血糖的柱状图；图15C为连续给药2个月后空腹血糖的柱状图；图15D为连续给药2个月后糖耐量曲线图。其中，#:相对于空白对照组,P<0.05；##:相对于空白对照组，P<0.01；*:相对于模型对照组，P<0.05；$：相对于S9给药组，P<0.05.
图16显示方法一造模同时给药实验中HE染色和胰岛素免疫组化实验结果；图16A-16C分别为空白对照组、模型对照组、S2给药组的胰岛素免疫组化的代表性图片；图16D为平均光密度值的柱状图，#：相对于空白对照组，P<0.05；*：相对于模型对照组，P<0.05；图16E-16G分别为空白对照组、模型对照组、S2给药组HE染色的代表性图片。
图17显示药物对MPTP损伤导致的帕金森病小鼠模型的行为学影响的测试结果；图17A为活动里程的柱状图；图17B为移动速度的柱状图；图17C为游泳里程的柱状图；图17D为游泳时间的柱状图；图17E为落棒潜伏期的柱状图；图17F为落棒几率的柱状图。其中，#：相对于空白对照组，P<0.05；##：相对于空白对照组，P<0.01；###：相对于空白对照组，P<0.001；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；***：相对于模型对照组，P<0.001；$：相对于S9给药组，P<0.05。
图18显示药物对MPTP损伤导致的帕金森病小鼠模型中脑内纹状体TH表达的影响的WB测试结果柱状图。其中，##：相对于空白对照组，P<0.01；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S1和S9药物给药组,P<0.05。
图19显示不同药物对缺血再灌注青光眼动物模型视网膜电图(ERG)DA3.0和DA10.0的影响效果；图19A为左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模眼)(左幅)的ERG(DA3.0)的典型图例；图19B为左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模眼)(左幅)的ERG(DA10.0)的典型图例；图19C-19D分别为各组大鼠右眼的全视野视ERG DA3.0和ERG DA10.0的b波振幅测试结果柱状图；图19E为S2给药组大鼠给药后第7天(D8)左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模并给药眼)(左幅)的ERG DA3.0典型图例；图19F为S2给药组大鼠给药后第7天(D8)左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模并给药眼)(左幅)的ERG DA10.0典型图例；其中，*：相对于模型对照组P<0.05；**：相对于模型对照组P<0.01；$：相对于S9给药组，P<0.05。
图20显示甲苯胺蓝染色超薄切片所观察到的缺血再灌注造模及给药所引起的眼底病理改变结果；图20A-20C分别为空白对照左眼、模型对照组右眼、S2给药组右眼的代表性病理图片；图20D为病理评分的结果柱状图。其中，###：相对于空白对照组，P<0.001；*：相对于模型对照组，P<0.05；**：相对于模型对照组，P<0.01；$：相对于S9给药组，P<0.05。
具体实施方式
通过参考以下对本发明一些实施方案的详细描述，可以更容易地理解本发明。
在引用出版物的情况下，这些出版物的公开内容被整体引用到本申请中，以便更全面地描述本发明相关的现有技术。
如本文所用，“给药”是指口服(“po”)给药，栓剂给药，局部接触给药，静脉给药(“iv”)，腹腔给药(“ip”)，肌肉给药(“im”)，病变内给药，海马内给药，侧脑室给药，鼻腔给药或皮下给药(“sc”)或将缓释装置例如微型渗透泵或易蚀植入物植入受试者。给药可以通过包括肠胃外和跨粘膜的任何途径进行(例如口服，鼻，阴道，直肠或皮)。肠胃外给药包括例如静脉，肌肉，小动脉，皮内，皮下，腹腔，心室和颅内。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂，静脉输注，透皮贴剂等。
术语“系统性给药”是指将化合物或组合物给予哺乳动物以使该化合物或组合物通过循环系统被递送至体内的部位，包括药物作用的靶部位的方法。系统性给药包括但不限于口服，鼻内，直肠和肠胃外给药(即通过消化道以外的其他途径，例如肌内，静脉，动脉，经皮和皮下给药)，但前提是，如本文所用，系统性给药不包括通过除循环系统以外的其他方式直接给药至脑区域，例如鞘内注射和颅内给药。
如本文所用，术语“治疗”是指，对于该术语所适用的疾病或症状，延迟其发生或延缓/逆转其发展，或减轻/预防疾病或症状。
术语“患者”，“受试者”或“个体”可互换地是指哺乳动物，例如人类或非人类哺乳动物，包括灵长类动物(例如猕猴、盘尾猿、长臂猿)、家养哺乳动物(例如猫科动物、犬科动物)、农业哺乳动物(例如牛、绵羊、猪、马)和实验室哺乳动物或啮齿动物(例如大鼠、鼠、兔形目、仓鼠、豚鼠)。
本发明提供了L-NIBC结合的金团簇分子。所述L-NIBC结合的金团簇分子包含金核和与金核结合的配体L-NIBC。所述L-NIBC结合的金团簇分子具有分子式Au15(L-NIBC)13。
本发明提供了所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13在治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼等疾病中的应用。
本发明提供了治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼等疾病的组合物。
本发明提供了治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼等疾病的方法。所述方法包含给予患者组合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13。
在一些实施方案中，当所述L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13作为金团簇分子混合物中的一个组份应用时，所述L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合物中的色谱含量不低于7％，至少是例如7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％，以及这些罗列数值的中间值、99％至100％的中间值。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂是磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。
本发明提供所述L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13用于制备治疗多发性硬化症、阿兹海默症(AD)、肝硬化、糖尿病、帕金森症(PD)、青光眼等疾病的药物的用途。
在一些实施方案中，所述L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13的剂量为0.001毫克/kg/天、0.005毫克/kg/天、0.01毫克/kg/天、0.05毫克/kg/天、0.1毫克/kg/天、0.05毫克/kg/天、1毫克/kg/天、2毫克/kg/天、3毫克/kg/天、4毫克/kg/天、5毫克/kg/天、6毫克/kg/天、7毫克/kg/天、8毫克/kg/天、9毫克/kg/天、10毫克/kg/天、15毫克/kg/天、20毫克/kg/天、30毫克/kg/天、40毫克/kg/天、50毫克/kg/天、60毫克/kg/天、70毫克/kg/天、80毫克/kg/天、90毫克/kg/天、100毫克/kg/天、200毫克/kg/天、300毫克/kg/天、400毫克/kg/天、500毫克/kg/天、600毫克/kg/天、700毫克/kg/天、800毫克/kg/天、900毫克/kg/天、或1000毫克/kg/天。
提供以下实施例仅用于说明本发明的原理；它们决不是要限制本发明的范围。
实施例1、样品制备
1.1、样品制备第一方案
在冰浴和搅拌条件下，反应釜中加入氯金酸的无水甲醇溶液2500毫升，其中氯金酸含量为5克，然后加入乙酸500毫升。充分冷却后加入500毫升L-N-异丁酰基半胱氨酸(L-N-isobutyryl cysteine，L-NIBC)的甲醇溶液，其中含36克L-NIBC。反应60分钟后，在搅拌下加入NaBH4的乙醇溶液1500毫升，其中含40克NaBH4。此时溶液会迅速变成棕黑色，同时有大量气体冒出，反应30分钟后，加入丙酮5000毫升终止反应，并使生成物沉淀出来。用离心机离心，取下层沉淀，并弃去上层清液。将离心所得沉淀用500毫升超纯水溶解，在室温25摄氏度和中性条件下老化7天。然后用截留分子量为500Da的透析袋在超纯水中透析，每天换水。7天后将透析袋解开，收集袋内溶液。对所收集的溶液进行冷冻干燥，则获得金团簇粗产品。
金团簇粗产品可能包含很多不同分子式的金团簇分子；但是，有哪些金团簇分子在金团簇粗产品中实际存在，则完全是未知数；至于一个特定金团簇分子在金团簇粗产品中的实际含量及其治疗作用，更无从知晓；这些未知因素对金团簇粗产品的成药性及药物申报造成巨大困难，因此需对金团簇粗产品中所含的不同组份进行分离。为了这个目的，将上述金团簇粗产品溶于水，用制备级色谱进行分离，按流出时间依次收集不同保留时间的馏分。各馏分再分别用500道尔顿的透析袋进行透析，冷冻干燥后得到一系列金团簇样品；并从中选取部分样品，用超高分辨率磁共振质谱(Bruker Daltonics,Solarix 7.0T ESI)结合其他方法确定各样品中主要成分的分子式。其分子式如下所示：
样品1(S1)：主要成分为Au24(L-NIBC)18，样品2(S2)：主要成分为Au15(L-NIBC)13，样品3(S3)：主要成分为Au4(L-NIBC)4，样品4(S4)：主要成分为Au7(L-NIBC)5，样品5(S5)：主要成分为Au10(L-NIBC)6，样品6(S6)：主要成分为Au8(L-NIBC)6，样品7(S7)：主要成分为Au11(L-NIBC)9，样品8(S8)：主要成分为Au13(L-NIBC)9。
为了方便对比，金团簇粗产品也用于实验中，编号为：
样品9(S9)：为三个批次金团簇粗产品充分混匀所得。
1.2、样品制备第二方案
反应釜中依次加入1300毫升氯金酸的无水甲醇溶液，其中氯金酸含量为5克，加入200毫升乙酸，在冰浴下搅拌；加入300毫升L-N-异丁酰基半胱氨酸(L-N-isobutyrylcysteine，L-NIBC)的甲醇溶液，其中含12克L-NIBC；加入1毫升纯水；搅拌反应半小时后，加入NaBH4的甲醇溶液500毫升，其中含18克NaBH4。此时溶液会迅速变成棕黑色，同时有大量气体冒出，反应30分钟后，加入丙酮3000毫升终止反应，并使生成物沉淀出来。用离心机离心，取下层沉淀，并弃去上层清液。将离心所得沉淀用500毫升超纯水溶解，在25摄氏度和酸性条件下老化7天，离心除去沉淀；然后用截留分子量为500Da的透析袋在弱酸性水中透析上清，每天换水；7天后将透析袋解开，收集袋内溶液；对所收集的溶液进行冷冻干燥，则获得金团簇粗产品。金团簇粗产品的分离和确定样品中主要成分的分子式的操作与上述样品制备第一方案类似。结果未发现Au15(L-NIBC)13成份的存在。
实施例2、S2(Au15(L-NIBC)13)的表征
图1显示S2(Au15(L-NIBC)13)的质谱图。Au15(L-NIBC)13分子式为超高分辨率质谱分析所给出的典型分子式。由于L-NIBC中羧基的存在，在不同的溶液或溶剂中，可能因pH值的不同以及溶液或溶剂中金属阳离子或其他阳离子的存在，不同个数的氢离子会被相应的金属阳离子或其他阳离子替换。
如图1A所示，S2(Au15(L-NIBC)13)的大范围ESI质谱图显示谱图非常干净，表明杂质很少。图1B-1D则给出了Au15(L-NIBC)13的不同质荷比(m/z)的质谱同位素峰。色谱研究表明，S2中Au15(L-NIBC)13的色谱含量为98.9％。
图2显示S2(Au15(L-NIBC)13)的紫外-可见吸收光谱图。如图2所示，S2显示在260～500nm表现出若干较为明显的特征吸收峰。
图3显示S2(Au15(L-NIBC)13)(上方谱线)和配体L-NIBC(下方谱线)的红外吸收光谱。可以看到，配体L-NIBC位于2500cm-1附近的巯基(-SH)吸收特征峰在S2中不再可见(方框中所示)，而其他官能团的特征吸收峰则依然存在，说明S2中配体L-NIBC是通过巯基与金原子结合。
为了研究不同pH值水溶液下S2药物的亲水/亲脂性质，将10毫克S2药物溶于10毫升不同pH值的水溶液(超纯水用5M的HCl调节pH值，使其pH分别为1～7范围内的不同数值，具体的pH由pH计测定得出；测定的pH值定义为初始水溶液的pH值)中，再分别加入正辛醇10毫升，充分摇晃，然后静置待正辛醇相和水相分层。用石墨炉原子吸收光谱仪分别测上层正辛醇相中和下层水相中金元素的重量比浓度(以ppm计)，并计算脂水分配系数(logP＝log(Co/Cw)，Co和Cw分别代表S2药物在油相和水相中的重量比浓度)。
如图4所示，在初始水溶液pH值较高(如pH>3.4)时，S2药物主要溶解于水相，而正辛醇相中则含量很低，其脂水分配系数小于-1.52(P<0.03)。然而，在初始水溶液pH值为3.4或以下，随着初始水溶液pH值的降低，水相中S2药物的含量迅速降低，而正辛醇相中的含量则急剧上升。当初始水溶液pH值降低到2.8时，脂水分配系数即达1.18(P＝15.0)，当初始水溶液pH降到2时，脂水分配系数达到1.85(P＝71.1)。由此可见，S2药物在很窄的初始水溶液pH值区间内(如上图虚线中间区域所示)实现了亲水/亲脂性质的大幅反转。这些性质与常规的药物表现出很大的不同，将可能在药物临床应用中的剂型设计有重大意义。
实施例3、多发性硬化症动物实验(实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)模型)
3.1、EAE模型试验
试验使用的动物为7-9星期龄的雌性C57BL/6N小鼠，按照规定饲养和维护。
第0天，按体重随机分组，然后将200μl混合有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelinoligodendrocyte glycoprotein,MOG)肽和完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)的溶液(美国Hooke公司)分别在小鼠左右后背皮下注射，每个部位100μl。在免疫接种后0小时和48小时，由腹腔注射百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)。根据表1，从第1天到第28天分别给予上述金团簇样品。每天对动物(n＝10)按照表2进行EAE临床症状评分。
苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色是最常用的组织和细胞的染色方法之一。苏木素染色液对细胞核具有高度的亲和性，使其细胞核染成蓝色，伊红染色液对细胞质具有高度的亲和性，使其细胞质呈现粉红色或红色。每组取3只小鼠，将组织从-80℃冰箱拿出放入冰冻切片机(箱体温度-20℃)平衡15min，组织切片10μm。
HE染色具体步骤：行为学试验结束后，将小鼠麻醉、心脏灌注，然后取出小鼠大脑、4％多聚甲醛固定后梯度脱水，冰冻冠状切片后，用粘附性载玻片进行贴片。将贴有脑片的载玻片放入37℃的烘箱15min；苏木素染液染色8min；后放入自来水中洗去多余染料10min；用纯化水冲洗载玻片数秒；分化液分化30s(这步可以选做)，自来水冲洗10min；然后伊红染液染色1min，自来水冲洗10min；70％乙醇10s，80％乙醇10s，90％乙醇10s，100％乙醇10s，二甲苯5min，新鲜二甲苯5min，中性树胶封片；显微镜观察，其中细胞核呈现蓝色，细胞质呈现粉红色。
表1、试验分组与剂量表
注：EAE为实验性自身免疫性脑脊髓炎；i.p.为腹腔注射给药。
表2、EAE行为学临床评分标准
评分 临床表现
1 尾部张力丧失
2 轻度后肢无力
3 部分后肢瘫痪
4 完全性后肢麻痹
5 完全性后肢瘫痪伴前肢无力或奄奄一息
3.2、试验结果与分析
图5以S1、S2、S3和金团簇粗产品S9药物为代表给出了药物给药组的EAE模型小鼠行为学临床评分的试验结果。结果表明，S1(Au24(L-NIBC)18)和S3(Au4(L-NIBC)4)药物对EAE模型小鼠的行为学临床评分无显著改善作用。而S2(Au15(L-NIBC)13)给药组所有小鼠在整个试验阶段均几乎与正常小鼠无异，而仅仅在第14天和第15天行为学临床评分分别出现0.2和0.1的低分，其余天数行为学临床评分均是0，这与模型对照组小鼠有显著差异，说明S2药物对抑制MOG药物造成的小鼠行为学障碍有堪称神奇的作用。与S2给药组相比，S9给药组则从第18天才与模型对照组出现显著性差异(P<0.05)，且最高点行为学临床评分达到2分左右，同时，虽然在后续的给药中评分快速改善，且从第23天起降至1分以下，但仍说明S9药物的疗效明显差于S2药物。其它5个药物(S4-S8)的测试结果与S1药物及S3药物类似，也未发现明显药效作用，在此不赘述。
图6是HE染色的试验结果。在EAE动物模型中，大量免疫细胞会侵入到骨髓，通过HE染色技术可以看到免疫细胞侵入骨髓的状况。图6A显示部分样品给药组的组织学评分统计结果，可以看到S2药物能显著降低EAE造模引起的组织学评分升高(P<0.01，**)，S9(金团簇粗产品)给药也能显著降低评分升高(P<0.05，*)，但显著差于S2药物(P<0.05，$)，S1药物和S3药物则无明显效果。图6B-6F分别是空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组和S9给药组的典型HE染色图片。可以看到，模型对照组(图6C)中，大量免疫细胞侵入到骨髓，如方框内所示，而空白对照组的小鼠(图6B)则无此现象。图6D是S1给药组的典型HE染色图片，可以看到大量的免疫细胞侵入，如方框内所示，与模型对照组小鼠相似。而S2给药(图6E)能显著降低免疫细胞对骨髓的侵入，免疫细胞浸润几乎不可见，说明效果极好。S9给药组有一定治疗效果，但骨髓中仍能看到一定程度的免疫细胞侵入(图6F)。S3-S8药物与S1药物相似，没有发现对免疫细胞侵入骨髓有明显抑制作用。这一结果与图5中行为学的结果一致。
从以上结果可以看到，S2药物(Au15(L-NIBC)13)可显著改善EAE模型小鼠的脑内炎症及行为学临床评分，相比于本试验中其他药物具有明显的优势，因此在多发硬化症及其他免疫相关疾病中有广阔应用前景。
以上结果说明，对于含有相同配体的不同金团簇分子，其分子结构对其在多发硬化症及其他免疫相关疾病的预防与治疗中的应用效果影响极大。对于含有配体L-NIBC的不同金团簇分子，S2药物(Au15(L-NIBC)13)相对于其他7种(S1、S3-S8)金团簇分子药物以及金团簇粗产品S9均具有显著的优势。
由于S2药物(即金团簇分子Au15(L-NIBC)13)表现出独特的疗效，因此我们检测了S9样品(金团簇粗产品)中的金团簇分子Au15(L-NIBC)13含量，根据色谱研究结果(检测波长220nm)，金团簇分子Au15(L-NIBC)13色谱峰纯度按面积归一化法计算为3.1％。研究表明，金团簇分子Au15(L-NIBC)13在金团簇粗产品中的色谱含量受制备方法和制备条件以及制备批次的影响而发生变化。在本申请的样品制备第一方案的制备方法和制备条件下，根据制备批次的不同，金团簇分子Au15(L-NIBC)13色谱含量在1.0％～3.6％范围内变化。
考虑到S9药物(金团簇粗产品)的药效明显差于S2药物，这些结果表明，金团簇分子Au15(L-NIBC)13的含量是影响其样品药效的重要因素之一。为了进一步研究这一点，在S9(金团簇粗产品)中添加不同份量的S2得到一系列S9+S2混合药物，作为金团簇分子混合物使金团簇分子Au15(L-NIBC)13在S9+S2混合药物中的色谱含量不同，再用EAE模型进行试验。结果表明，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在S9+S2混合药物中的色谱含量达到或超过7％时，即可显著提高S9+S2混合药物的疗效；这些结果表明，金团簇分子Au15(L-NIBC)13的含量达到或高于7％的L-NIBC结合的金团簇分子混合物都能很有效地治疗或预防多发性硬化症。
图7是S2药物、S9药物和S9+S2混合药物的EAE模型药物测试行为学临床评分，其中S9+S2混合药物中的金团簇分子Au15(L-NIBC)13的色谱含量是18％。可以看到，金团簇粗产品S9添加了少量S2后，对EAE模型小鼠的治疗效果大幅增加，已与S2几乎没有差别。
实施例4、阿兹海默病(AD)动物模型实验
4.1、APP/PS1双转基因AD模型小鼠试验
4.1.1、实验方法
将雄性C57BL/6种系APP/PS1转基因AD模型小鼠随机分为模型对照组、S1给药组、S2给药组、S3给药组、S4给药组、S5给药组、S6给药组、S7给药组、S8给药组和金团簇粗产品S9给药组，同时设置同年龄组C57BL/6野生型小鼠作为正常对照组，每组15只小鼠。S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9给药组分别每天1次腹腔注射相应药物的生理盐水溶液，剂量为10mg/Kg小鼠体重，注射体积为100μL，模型对照组和正常对照组小鼠则腹腔注射相同体积的生理盐水。
小鼠3月龄时开始给药，连续给药180天后采用Morris水迷宫试验对所有动物的认知功能及记忆功能进行测试。
定位航行实验：Morris水迷宫测试系统由圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成，水池上方有摄像机与计算机连接。水迷宫由直径为120cm，高60cm的圆形水池以及直径为9cm的站台构成，液面高出站台0.5cm，水温维持在22±0.5℃。使用白色色素将水染成乳白色。定位航行实验用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，历时5天。将水迷宫划分为N,S,W,E四个象限。平台放置在固定象限。整个实验过程中平台位置固定不变。训练时，每天从不同象限1/2弧度处将小鼠头朝向池壁，靠近外壁轻轻放入水中。记录小鼠爬到隐藏平台上的时间或到达60s时即停止实验。小鼠在平台上后让其在平台上停留30s，倘若小鼠60s内未找到平台，则实验者引导小鼠爬上平台，并让其停留30s。通过摄像跟踪系统记录实验过程中小鼠寻台潜伏期。每只动物试验后移开用吹风机温和吹干。每只动物每天训练4次，训练之间间隔20min，连续训练5天。
空间探索实验：第5天训练完毕后，第6天移走平台，将小鼠由平台最远端点面朝池壁轻轻放入水中，用摄像机记录小鼠60s内的运动轨迹，软件分析小鼠的穿台次数,目标象限停留时间和目标象限游泳路程。
实验结果均以用表示，所有数据采用SPSS软件(SPSS 21)处理，采用单因素方差分析(Post-Hoc Dunnett test)，p<0.05表示差异有统计学意义。不属于正态分布的数据采用Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验对数据做统计分析。
行为学试验结束后，小鼠腹腔注射7％水合氯醛麻醉后，建立心脏灌流连接，灌流结束后，小心采取脑组织置于4％灌流液中，采用生理盐水快速冲洗7分钟，之后采取4％水合氯醛灌流固定脑组织7分钟。采用免疫组化的方法检测Aβ1-40在海马区和皮层的表达：灌流组织脱水、透明、浸蜡及包埋后，采用石蜡切片机切片。采用二甲苯、无水乙醇梯度脱蜡。微波进行抗原修复后，切片用氧化氢孵育后，血清封闭切片30min。室温加入一抗(鼠抗Aβ1-40，1:100)，4℃孵育过夜(15h)。弃去一抗，PBS清洗切片，加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗，室温孵育30min。PBS冲洗切片后，加显色剂DAB显色液显色，Harris苏木素复染及脱水、封片。采用荧光显微镜拍照，采用image J对切片进行定量分析。
4.1.2、试验结果
图8给出了S1、S2、S3和S9连续180天给药对雄性小鼠在Morris水迷宫测试中表现的影响。如图8A所示，在定位航行试验训练过程中，与正常对照组相比，从训练第2天到第5天，模型对照组小鼠的寻台潜伏期显著性高于正常小鼠(P<0.01，##)。与模型对照组相比，S2给药组小鼠的寻台潜伏期大幅度下降，且从第3天起相对于模型对照组均出现显著性差异(第3、4、5天P值均小于0.05，*)。S1给药组小鼠的寻台潜伏期相对于模型对照组虽然有所降低，但差异均不具有显著性(P>0.05)。S3给药组小鼠的寻台潜伏期不仅未降低，反而在第4和第5天有所升高。S4～S8给药组与S3给药组相似，未表现出明显作用。金团簇粗产品S9给药组的效果超过S1给药组，且第5天与模型对照组相比出现显著性差异(P<0.05，*)，但仍明显差于S2给药组。
如图8B-8D所示，空间探索实验结果表明，与正常对照组小鼠相比，模型对照组小鼠在目标象限游泳路程(图8C)(P<0.01，##)以及目标象限停留时间(图8D)(P<0.05，#)均显著性降低，而穿台次数(图8B)也低于正常对照组小鼠，但无显著性差异(P>0.05)。与模型对照组相比，S3药物未能提高小鼠的穿台次数(图8B)，而S1、S2和S9给药组小鼠的穿台次数有所增加，但均无显著性差异(P>0.05)。对于目标象限游泳路程和目标象限停留时间(图8C和图8D)，S2药物均能显著提高这两个指标的数值(P均小于0.05，*)。S1药物虽能提高目标象限游泳路程和目标象限停留时间，但只有游泳路程具有显著性(P<0.05，*)，停留时间则不有显著性(P>0.05)。S9也能提高目标象限游泳路程和目标象限停留时间，其中相对于模型对照组也均出现显著性差异(P<0.05，*)，但S9药物的提升能力明显差于S2药物。而S3药物则未能显著提升这两个指标的数值。S4-S8药物与S3药物相似，也无明显作用。这些数据表明，S2药物可显著改善AD模型小鼠的认知与记忆能力，S1药物和金团簇粗产品S9药物也有一定作用，但均明显差于S2药物。S3-S8药物则无改善作用。
以上结果表明，虽然上述8种金团簇分子都是以L-NIBC为配体，但在APP/PS1双转基因AD小鼠模型中，对提升患病小鼠的认知与记忆能力方面存在明显差异，其中金团簇分子(Au15(L-NIBC)13)S2与其它7种金团簇分子以及金团簇粗产品S9相比，在改善患病小鼠的行为学障碍方面存在显著优势。
免疫组化试验的结果进一步证实S2金团簇分子(Au15(L-NIBC)13)能显著减少APP/PS1双转基因AD模型小鼠脑内的Aβ1-40纤维化斑块的形成。图9是以平均光密度值表示的模型对照组与S1、S2、S3和S9给药组小鼠海马区和皮层中Aβ1-40斑块数量的比较。可以看到S2药物能大幅度降低海马区(**：P<0.01)和皮层中Aβ1-40斑块的数量(**：P<0.01)。S1药物也能有所降低但差异不具有显著性(P>0.05)。S9药物能显著降低海马区(P<0.05，*)和皮层的斑块数量(P<0.05，*)，但效果明显差于S2药物。而S3药物则无任何效果。S4-S8药物与S3药物相似，也均未观察到任何效果，在此不赘述。
4.2、五转基因5xFAD阿兹海默病小鼠模型试验
常规的小鼠模型(如前述的APP/PS1双转基因小鼠模型等)对AD病因和治疗药物的初期探索研究是有用的。但是，由于AD的发病机制复杂，更深入的研究需要更合适的动物模型。5xFAD是一种较新的APP/PS1转基因AD小鼠模型，携带5个家族性基因突变，具有多种AD相关神经损伤和记忆功能障碍，与APP/PS1双转基因小鼠模型及其他AD动物模型相比，神经病理学病变特征更加明显，因此受到越来越广泛的认可。
4.2.1、试验方法
模型小鼠为有C57BL/6背景的5×FAD雄性小鼠。实验用小鼠分为模型对照组、S1药物给药组、S2药物给药组、S3药物给药组、S4药物给药组、S5药物给药组、S6药物给药组、S7药物给药组、S8药物给药组和S9药物给药组，以及同龄野生型对照组(正常对照组)。每组小鼠数目为15只。给药的剂量均为10mg/kg小鼠体重。通过腹腔注射的方式，给药组每天给予1次相应药物的生理盐水溶液，注射体积为100μl，开始给药时间为鼠龄2个月时。模型对照组和正常对照组小鼠通过腹腔注射方式每天给予相同体积的生理盐水，与给药组同步。
连续给药3个月后，开始采用Morris水迷宫试验对所有动物的认知功能及记忆功能进行分析。
空间学习能力测试
Morris水迷宫系统包括一个供小鼠游泳的水迷宫和自动录像及分析系统组成，水迷宫上方有摄像机与计算机连接。水迷宫是一个直径为110cm、高度为60cm的圆形水池。在训练小鼠游泳时，水池里的水被墨汁染为黑色且水温维持在22±0.5℃。将水迷宫划分为North、South、West和East这4个象限。一个直径为9cm的平台放置在一个固定象限。站台低于液面约0.5cm。
定位航行实验用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，历时5天。训练时，每天从不同象限1/2弧度处将小鼠头朝向池壁，靠近外壁轻轻放入水中。记录小鼠爬到隐藏平台上的时间或到达60s时即停止实验。小鼠在平台上后让其在平台上停留30s，倘若小鼠60s内未找到平台，则实验者引导小鼠爬上平台，并让其停留30s。通过摄像跟踪系统记录实验过程中小鼠寻台潜伏期。每只动物试验后移开用吹风机温和吹干。每只动物每天训练4次，训练之间间隔20min，连续训练5天。
空间记忆能力测试(probe test)
游泳训练5天之后结束，并将平台移除。于第6天开始probe test。将小鼠由平台最远端点面朝池壁轻轻放入水中，用摄像机记录小鼠60s内的运动轨迹。利用分析软件分析小鼠的穿台次数、目标象限停留时间和目标象限游泳路程。
实验结果均以用表示，所有数据采用SPSS软件(SPSS 21)处理，采用单因素方差分析(Post-Hoc Dunnett test)，P<0.05表示差异有统计学意义。不属于正态分布的数据采用Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验对数据做统计分析。
行为学实验后开始病理学分析。首先，利用CO2杀死小鼠之后，建立心脏灌流连接。用生理盐水冲洗5-10分钟之后取出脑组织置于4％PFA中，过夜固定。第二天对组织进行脱水、透明、浸蜡及包埋后制成石蜡包埋块，用于石蜡切片机的切片。切片结束后采用二甲苯、无水乙醇梯度脱蜡。然后利用免疫组化的方法检测淀粉样斑块数量、对星型胶质细胞和小胶质细胞进行计数。利用微波炉进行抗原修复。切片用过氧化氢孵育后，血清封闭切片30min。常温下加入一抗(鼠抗Aβ42，1:100)，GFAP和Iba1。弃去一抗，PBS清洗切片，加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗，常温孵育30min。PBS冲洗切片后，加显色剂DAB显色液显色，Harris苏木素复染及脱水、封片。采用荧光显微镜拍照，采用Image J或斑块计数对切片进行定量分析。
4.2.2、试验结果
行为学研究结果表明，从训练第2天到第5天，模型对照组小鼠的寻台潜伏期显著性高于正常对照组小鼠。与模型对照组相比，S2给药组小鼠的寻台潜伏期大幅度降低，且从第3天起相对于模型对照组均出现显著性差异。然而S1和S3给药组小鼠的寻台潜伏期未明显降低，但S1药物要好于S3药物。S4-S8给药组与S3给药组相似，其小鼠的寻台潜伏期也未降低。金团簇粗产品S9药物小鼠的寻台潜伏期与模型对照组相有降低，但差异不具有显著性(P>0.05)。
空间探索实验也给出类似结果。与模型对照组相比，S2给药能显著提高造模小鼠的穿台次数(P<0.01，**)、目标象限游泳路程(P<0.01，**)和目标象限停留时间(P<0.01，**)。S1药物和S3药物效果均不明显，S4-S8药物与此相似，也无明显效果，在此不赘述。金团簇粗产品S9给药组小鼠则穿台次数、目标象限游泳路程和目标象限停留时间相对于模型对照组均有所降低，但差异均不具备显著性(P>0.05)。
图10显示模型对照组和给药组小鼠脑内皮层(cortex)、海马体(hippocampus)中和海马下托(subiculum)纤维化斑块的Aβ42免疫组化染色试验结果。模型对照组小鼠5月龄时在上述区域均出现大量Aβ斑块(图10A、图10B、图10C、图10D、图10F和图10H)。S1药物给药组的小鼠在脑内皮层和海马体中的Aβ斑块数量相对于模型对照组有一定程度的降低，但仅在海马体中出现显著性差异(P<0.05，*)，皮层中则无显著性差异(P>0.05)，在海马下托中斑块数量与模型对照组无降低。S3药物对三个区域的Aβ斑块数量无明显影响。S4-S8药物与S3药物类似，也无明显效果。然而S2药物的给药使皮层中Aβ斑块的数量下降了约51％(P<0.01，**)，海马区中下降幅度达到约53％(P<0.01，**)，在海马下托中也达到35％(P<0.01，*)。S2给药组小鼠脑内皮层、海马体和海马下托中典型免疫组化染色图片分别如图10E、图10G和图10I所示，可以看到Aβ斑块均明显少于相应的模型对照组(图10D、图10F和图10H)。
金团簇粗产品S9给药组小鼠脑内皮层(cortex)、海马体(hippocampus)中和海马下托(subiculum)中Aβ斑块数量相对于模型对照组有下降(下降幅度分别为26％、22％和15％)，皮层和海马区中的下降具有显著性差异(P<0.05，*)，而海马下托中的下降没有显著性差异(P>0.05)。但是，与S2给药组相比，金团簇粗产品S9给药组小鼠脑内三个区域中Aβ斑块数量的下降幅度显著小于S2给药组(P均小于0.05，$)；这说明金团簇粗产品S9药物有一定药效但其药效显著差于S2药物。
脑内炎症是AD发病机制的另一个重要假说。小胶质细胞和星形胶质细胞是造成神经炎症的主要细胞。Iba1和GFAP分别是小胶质细胞和星形胶质细胞的标志物，这些蛋白表达的增多表明小胶质细胞和星形胶质细胞数量增多及细胞激活。众多研究显示AD小鼠脑内Iba1和GFA表达显著性增高。这些细胞的激活可导致细胞促炎因子如白介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、活性氧的大量产生，进而导致神经功能障碍和死亡。因此，评价药物对Iba1阳性(Iba1+)和GFAP阳性(GFAP+)细胞计数的影响可显示药物对脑内炎症相关过程的作用。
图11A和11B分别显示了模型对照组和各给药组小鼠脑内皮层和海马体中Iba1阳性(Iba1+)细胞免疫组化染色的试验结果。图11C和11D则是相应的GFAP阳性(GFAP+)细胞免疫组化染色的试验结果。可以看到，S1药物对脑内皮层和海马体的Iba1阳性细胞和GFAP阳性细胞的计数均无明显作用，说明S1药物对脑内炎症无明显抑制效果。而S2药物则表现出明显抑制脑内炎症的效果。如图11A和图11B所示，相对于模型对照组，S2药物给药使皮层和海马区的Iba1阳性细胞的计数分别降低了55％(P<0.01，**)和42％(P<0.01，**)。如图11C和图11D显示，相对于模型对照组，S2药物给药使皮层和海马区的GFAP阳性细胞的计数也分别下降了和33％(P<0.05，*)和22％(P<0.05，*)。S3药物对脑内皮层和海马区中的Iba1阳性细胞和GFAP阳性细胞的计数均无明显作用，说明无明显药效。S4-S8药物与S3药物相似，也未观察到明显药效。
如图11所示，金团簇粗产品S9给药组小鼠脑内皮层和海马体中Iba1阳性细胞和GFAP阳性细胞的计数相对于模型对照组也有所下降，但下降幅度均显著小于S2给药组(P均小于0.05，$)，且只有皮层和海马区中的Iba1阳性细胞的计数出现显著性差异(P<0.05，*)，但是GFAP阳性细胞的计数未出现显著性差异(P>0.05)。这说明金团簇粗产品S9的药效虽也有一定效果，但显著差于S2药物。
以上结果表明，S2药物在五转基因5xFAD模型小鼠试验中表现出比S1药物和S3-S9药物明显好得多的疗效，至少可从抑制脑内蛋白纤维化和抑制脑内炎症等两个方面对AD的治疗产生积极作用。同时，结合APP/PS1双转基因小鼠模型的试验结果，可以看到，虽然S1药物对AD也具有一定疗效，但总体效果也显著差于S2药物，也一定程度上差于金团簇粗产品S9。
以上结果说明，含有相同配体的不同金团簇分子的分子结构对金团簇分子在阿兹海默病的预防与治疗中的应用效果影响极大。对于含有L-NIBC的不同金团簇分子，金团簇分子Au15(L-NIBC)13(S2药物)相对于其他7种金团簇分子(S1和S3-S8药物)和金团簇粗产品S9具有极其显著的优势，更适用于作为开发预防和治疗阿兹海默病的药物。
进一步研究表明，在金团簇粗产品S9药物中添加S2药物得到混合药物，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合药物中的含量达到7％时，相比S9即可显著提高混合药物的药效。
实施例5、肝硬化动物模型试验
5.1、试验方法
小鼠肝硬化模型造模
SPF级雄性C57BL/6N小鼠，6-8周龄，体重16-20g，按体重随机分成11组(n＝10)：空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组、S3给药组、S4给药组、S5给药组、S6给药组、S7给药组、S8给药组和S9给药组。除空白对照组外，其他各组小鼠采用四氯化碳(CCl4)诱导法制备肝硬化模型。造模方法如下：(1)每只小鼠按照7μL/g体重腹腔注射10％的CCl4(橄榄油稀释)，每周2次，共注射8周；空白对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油溶剂。(2)从第6周开始，每周最后一次注射48h后挑选2只小鼠处死，观察小鼠肝脏外观，外观符合肝硬化特点后(第8周)，肝组织福尔马林固定，进行HE染色、Masson染色等评价肝硬化模型的建模情况。
药物给药
造模成功后，S1-S9给药组小鼠按照10mg/kg剂量腹腔注射给予相应的药物，空白对照组和模型对照组小鼠按照10mL/kg腹腔注射给与生理盐水，每天给药1次，连续给药20天。
生化检测
给药结束后，将小鼠进行眼眶采血，收集血清，选择中生北控试剂盒，生化分析仪(西门子)对血清中的白蛋白(albumin，ALB)、总胆红素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)和单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)共5个指标进行检测。检测方法严格按照试剂盒说明书进行。
病理检测
(1)HE染色
小鼠安乐死后，对小鼠肝组织采用4％多聚甲醛固定液固定48h以上，固定后采用酒精梯度脱水，采用二甲苯和乙醇透明化处理。然后将组织浸蜡、包埋。对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，采用石蜡切片机将肝组织切片，切片厚度为4μm。HE染色主要流程如下：将切片在65℃烤箱烤片后，将切片采用二甲苯处理及乙醇梯度脱水。依次采用苏木精染色液染色，促蓝液返蓝及0.5％曙红液染色后将切片进行梯度乙醇及二甲苯处理，中性树胶封片。采用显微镜观察肝脏组织的纤维化改变。
(2)Masson染色
将小鼠肝脏组织切片烤片后脱蜡至水，铬化处理后用Regaud氏苏木精染液核染。水洗后将切片用Masson丽春红酸性复红液染色，以2％冰醋酸水溶液浸洗片后采用1％磷钼酸水溶液分化。直接用苯胺蓝或光绿液染后以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻，采用95％酒精、无水酒精及二甲苯透明化后采用中性树胶封固。采用显微镜观察肝脏组织。
5.2、试验结果
模型对照组小鼠肝脏被增生的纤维隔分隔成大小不等的圆形或椭圆形团块，血清中ALT、TBil、AST和MAO指标相对于空白对照组显著升高(P<0.01，##)，ALB相对于空白对照组显著下降(P<0.05，#)，提示本次实验造模成功。
图12显示了药物对肝硬化模型小鼠血清ALT(图12A)、AST(图12B)、TBIL(图12C)、MAO(图12D)及ALB水平(图12E)的影响。结果显示，S1药物能在一定程度上改善造模小鼠血液中的ALT(P<0.05，*)、AST(P<0.05，*)和TBIL水平(P<0.05，*)，对MAO和ALB指标有一定作用则与模型对照组相比无显著性差异(P>0.05)。金团簇粗产品S9与S1药物相比效果相似，能显著降低小鼠血液中的ALT、AST和TBIL指标(P均小于0.05)，对MAO和ALB指标也有一定降低作用，但与模型对照组无显著性差异(P>0.05)。
S2药物则对造模小鼠血液中的五种指标均能显著改善(ALT：P<0.01，**；AST：P<0.01，*；TBIL：P<0.01，**；MAO：P<0.05，*；ALB：P<0.05，*)，且效果显著好于金团簇粗产品S9药物(对ALT、AST、TBIL和MAO：P均小于0.05，$)。而S3药物则均无明显改善作用，S4-S8药物也与S3药物类似，无明显改善作用，在此不赘述。以上结果显示S1药物、S2药物及金团簇粗产品S9对肝硬化造模小鼠均有治疗作用。结合S1药物和S9药物以及S2药物对五种指标的分别改善的程度，可以看到，S2药物效果显著优于S1药物和S9药物。而S3-S8药物对肝硬化造模小鼠均无明显治疗作用。
图13是HE染色的试验结果。其中13A、13B、13C、13D和13E幅分别是空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组和S9给药组的代表性图片。如图13A所示，空白对照组小鼠的正常肝组织结构清晰，肝小叶完整，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞核正常，汇管区仅有少量纤维组织。如图13B所示，模型对照组小鼠的肝脏中，肝细胞排列紊乱，出现气球样变，肝小叶接近消失，假小叶大量出现，胶原纤维大量增生并形成圆形或椭圆形的纤维间隔。
如图13D所示，与模型对照组相比，S2给药组的肝组织均呈现极显著的肝损伤恢复现象，表现在肝组织结构清晰，肝小叶完整，肝细胞索排列整齐，纤维增生和假小叶几乎观察不到，与正常肝细胞状况无明显差别，说明其药效极其显著。
如图13C所示，S1药物也有一定治疗效果，但与空白对照组相比，仍存在一定量的纤维增生和假小叶结构，结合前面血清指标的结果，说明S2药物综合疗效明显好于S1药物。
如图13E所示，S9给药组与S1给药组相似，也表现出较好的治疗效果，但同样明显差于S2给药组。S3-S8药物则未表现出任何治疗效果，肝细胞排列紊乱，肝小叶接近消失，假小叶大量出现，胶原纤维大量增生并形成圆形或椭圆形的纤维间隔，与模型对照组相似。
图13F给出了S1～S3以及金团簇粗产品S9药物对肝硬化组织病理学评分影响的试验结果。柱状图中的六组数据从左至右分别是空白对照组、模型对照组、S1给药组、S2给药组、S3给药组和S9给药组。其中S1给药组和S9给药组的评分与模型对照组均具有显著性差异(P均小于0.05，*)。S2给药组的评分与模型对照组相比则具有极显著差异(P<0.01，**)，且比S9给药组的评分也下降了50％(P<0.05，$)，与模型对照组相比则下降了66％。S3给药组与模型对照组相比未出现下降，说明无明显药效，S4-S8药物则与S3药物相似，也无明显药效，在此不赘述。Masson染色结果与HE染色结果一致，在此也不赘述。
从以上结果可以看到，病理检测结果与生化检测结果一致，共同说明S1(Au24(L-NIBC)18)和S2药物(Au15(L-NIBC)13)对肝硬化有显著疗效，但S2药物的疗效大幅度好于S1药物。同时，S2药物的疗效也显著好于金团簇粗产品S9。这说明，含有相同配体的不同金团簇分子的分子结构对其在肝硬化的预防与治疗中的应用效果影响很大，其中Au15(L-NIBC)13具有非常显著的优势，更适用于作为开发治疗肝硬化的药物。
进一步研究表明，在金团簇粗产品S9药物中添加S2药物得到混合药物，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合药物中的含量达到7％时，与S9相比即可显著提高混合药物的药效。
实施例6、糖尿病动物模型试验
6.1、试验方法
6.1.1、糖尿病造模、给药及血糖测试
本研究采用了两种方法进行试验，一种是造模同时给药，另一种是造模成功后再给药，试验方法分别如下：
方法一：造模同时给药。
SPF级C57BL/6雄性小鼠按照空腹血糖水平随机分组(n＝12/组)，分别为空白对照组，模型对照组，S1给药组、S2给药组、S3给药组、S4给药组、S5给药组、S6给药组、S7给药组、S8给药组和S9给药组。本实验采用高脂饮食喂养加小剂量链脲佐霉素建立小鼠糖尿病模型，造模第1天即开始给药。首先各组小鼠给以实验室标准维持饲料1周，1周后，除空白对照组，其他各组更换为高脂饮食(High Fat Diet)喂养。该喂养方式持续3周。3周后，模型对照组和S1～S9给药组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(100mg/kg)连续5天，从而进一步对胰腺造成一定损伤，制造糖尿病模型，空白对照组则注射等量生理盐水作为对照。从喂饲维持饲料第1天开始，S1-S9给药组采用腹腔注射对小鼠给药，剂量为10mg/kg体重，每天1次，空白对照组及模型对照组腹腔注射等量生理盐水，本给药方式持续35天直至实验结束。造模及给药试验后，所有小鼠均空腹5h后，检测0点血糖(空腹血糖)，然后灌胃葡萄糖(1.5mg/g体重)后，分别在0.5h，1h，1.5h和2h时检测血糖水平。
方法二：造模成功后再给药。
采用高脂饮食(High Fat Diet)诱导的糖尿病小鼠模型，研究药物的降糖效果。SPF级B6小鼠随机分组(n＝12-15只/组)：空白对照组(正常进食)、模型对照组、S1给药组、S2给药组、S3给药组、S4给药组、S5给药组、S6给药组、S7给药组、S8给药组和S9给药组。模型对照组和9个药物给药组在2月龄时给予高脂饮食喂养。空白对照组小鼠给予标准实验室饲料喂养。在小鼠5个月龄时，对小鼠进行血糖测定，以确定高脂饮食喂养的小鼠是否血糖升高及糖代谢紊乱，从而确定造模成功。给药分为两种，一种为急性给药，9种药物给药组小鼠分别腹腔注射一次(5mg/kg)，30分钟后测量相应的空腹血糖指标和糖耐量指标；另一种为长期给药，9个药物给药组小鼠分别腹腔注射药物(5mg/kg/天)连续2个月。空白对照组和模型对照组给予腹腔注射等量生理盐水。给药试验1个月时或2个月后，所有小鼠均饥饿过夜16h，检测空腹血糖，然后灌胃葡萄糖(1.5mg/g体重)后，分别在15min，30min，45min，60min，120min检测血糖水平。
6.1.2、HE染色
方法一的试验完成后，各组动物安乐死，迅速采集动物胰腺，置于4％多聚甲醛固定后，将动物胰腺组织放入包埋盒中，流水冲洗30min去除固定液。将组织采用酒精梯度脱水(50％，70％，80％，95％，无水乙醇)，采用环保透明剂对组织做透明处理。将透明后的组织依次浸入纯石蜡(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，每次1h，从而对组织包埋并完全除去剩余透明剂。将包埋的胰腺组织用石蜡切片机将组织作3μm连续切片，60℃烤片1h备用。将切片放入二甲苯15min脱蜡，重复3次，之后将切片依次浸入梯度乙醇(100％，85％和75％)中各5min，流动自来水冲洗5分钟使切片脱蜡。将切片在苏木精染液中染色5min后用自来水洗去多余染液，0.7％盐酸乙醇分色10s，自来水冲切片至镜检细胞核及核染色质清晰。分别采用70％和90％乙醇各脱水10min，用0.5％伊红溶液染色5min，自来水洗去多余染液。染色后的切片依次用70％，80％，90％，100％乙醇脱水10s，透明剂透明，于通风处风干。滴加适量中性树胶后用盖玻片封片。采用光学显微镜观察病理切片并拍照。
6.1.3、胰岛素免疫组化
方法一试验完成后，按照上述方法完成胰腺3μm连续切片。将3μm厚的胰腺切片脱蜡后，采用3％H2O2去离子水室温孵育5-10min阻断内源性过氧化物，磷酸缓冲液(PBS)冲洗5min×3次。将切片置于抗原修复液中于微波炉内进行抗原修复，自然冷却后，PBS冲洗5min×3次。滴加5％BSA封闭液，37℃孵育30min。弃去封闭液，滴加胰岛素免疫组化一抗孵育液(抗体比例为1：200)，37℃孵育1-2h，用PBS冲洗5min×3次去除多余一抗。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育液，37℃孵育30min。PBS冲洗，5min×3次。将切片用DAB显色，显微镜下观察以控制显色时间，采用自来水冲洗终止染色。采用苏木素复染细胞核，自来水漂洗后，采用不同浓度酒精(75％、85％和100％)梯度脱水、透明剂透明、中性树胶封片。采用显微镜观察胰腺组织，免疫组化检测胰岛素表达情况并拍照，每张切片随机选取3个含有胰岛的视野(400倍)，使用软件Image-Pro Plus version 6.0测定各个视野的平均光密度值定量，取平均值作为该切片的平均光密度值。
6.2、试验结果
图14A是方法一造模同时给药试验中空腹血糖水平的试验结果。可以看到，模型对照组空腹血糖为19.5±2.4mM，显著高于空白对照组的正常小鼠的空腹血糖10.1±1.7mM(P<0.01，##)。S1药物给药组、S2药物给药组和S9药物给药组的空腹血糖分别为16.5±1.4mM、11.7±2.1mM和14.9±1.6mM，相对于模型对照组空腹血糖均显著降低(S1：P<0.05，*；S2：P<0.01，**；S9：P<0.05，*)，且S2药物给药组空腹血糖降低的幅度显著大于S1药物给药组和S9药物给药组(P<0.05，$)。而S3-S8药物给药组则与模型对照组处于同一水平，无明显效果。
图14B是方法一造模同时给药试验中糖耐量测试结果，其中0h对应于图14A中的空腹血糖。模型对照组在各个时间点上血糖数值均明显高于空白对照组(P均小于0.01，##)，说明造模成功。S1药物给药组的空腹血糖和葡萄糖喂食后不同时间点的血糖数值均低于模型对照组，其中空腹血糖(0h)、0.5h和2h的数据有显著性差异(P均小于0.05，*)，说明S1药物有一定的降血糖效果。金团簇粗产品S9药物给药组各时间点的血糖平均值都小于S1给药组，且相对于模型对照组空腹血糖(0h)、0.5h、1.5h和2h的数据出现显著性差异(P均小于0.05，*)，说明金团簇粗产品S9药物的疗效好于S1。而S2药物给药组在0h、0.5h、1h、1.5h和2h时血糖数值均显著低于模型对照组(P均小于0.01，**)，且血糖降低的幅度也比金团簇粗产品S9药物的大很多(在0.5h-2.0h的血糖结果中，血糖的降低幅度都是S9药物的接近2倍或2倍以上)，且均出现显著性差异(P均小于0.05，$)，说明S2药物的药效远好于金团簇粗产品S9药物的药效。S3药物给药则在所有时间点均未表现出明显的降低血糖的作用，S4-S8药物的结果与S3药物相似，也均无明显效果，在此不赘述。
图15A是方法二造模后给药试验中的急性给药试验糖耐量的测试结果，其中0分钟对应于空腹血糖。可以看到，无论是空腹血糖还是其他各个时间点的血糖数据，模型对照组均显著高于空白对照组(P均小于0.05，#)，说明造模成功。其中的0h空腹血糖数据，模型对照组为11.5±2.1mM，而空白对照组为6.1±1.3mM，而各给药组的空腹血糖由于是急性给药，因此与模型对照组无明显差异。对于金团簇粗产品S9药物给药组，葡萄糖喂食后的各时间点血糖数值均小于模型对照组，其中15min和30min的结果具有显著性差异(P<0.05，*)。对于S2药物，各时间点相对于模型对照组血糖下降幅度比S9给药组更大(15min～60min时，下降幅度分别提高了1.16到2.2倍)，且在15min、30min、45min、60min出现显著性差异(P均小于0.05，$)，相对于模型对照组，则在15min、30min、45min、60min和120min均表现出显著性差异(P均小于0.05，*)。S1药物效果略逊于金团簇粗产品S9药物，但也有明显效果，在此不赘述。而S3-S8给药组各时间点则与模型对照组处于同一水平，显示无明显效果，在此也不赘述。
图15B和图15C分别是方法二造模后给药试验中连续给药1个月和2个月后空腹血糖的结果。模型对照组的空腹血糖分别为12.5±0.6mM和10.8±0.8mM，相对于空白对照组的数据(5.6±0.4mM和5.2±0.4mM)显著上升(P均小于0.01，##)。S9药物给药组的数值分别下降至11.2±0.7mM和9.5±0.8mM，但相对于模型对照组不具备显著性差异(P均大于0.05)。S2药物给药组下降幅度更大，分别显著下降至8.9±0.5mM和8.1±0.6mM(相对于S9药物，下降幅度分别高了2.8倍和1.1倍)，且相对于模型对照组均具有显著性(P均小于0.05，*)。S3-S8药物给药组则与模型对照组均处于相近水平，未出现明显下降。
图15D是连续给药两个月后糖耐量的试验结果。如图所示，S2药物给药组在0min、15min、30min、60min和120min的血糖数值均显著低于模型对照组(P均小于0.05)，验证了S2药物优异的降血糖效果。金团簇粗产品S9药物的疗效明显差于S2药物，但也有显著的药效，S1药物则略逊于差于S9，S3-S8药物则未表现出明显药效，在此均不赘述。
以上结果相互印证，共同说明，S1药物和金团簇粗产品S9药物均表现出一定的降血糖效果，而S2药物则表现出极好的降血糖作用，效果明显优于S1药物和金团簇粗产品S9药物。S3-S8药物均无明显的降血糖效果。
图16显示了方法一同时给药试验中HE染色和胰岛素免疫组化的试验结果。其中图16A、16B和16C分别是空白对照组、模型对照组和S2药物给药组的代表性免疫组化图片。免疫组化结果显示，各组小鼠均可见Insulin阳性信号、呈黄色至棕褐色(注：棕色在灰度图中颜色较深，黄色在灰度图中颜色较浅)，主要表达部位为胰岛细胞，其中空白对照组的Insulin染色呈棕色强阳性信号(灰度图中颜色很深，如图16A中箭头所指)，模型对照组Insulin染色信号明显减弱，颜色明显变浅至稀疏的浅棕色至黄色(灰度图中颜色较浅，如图16B中箭头所指)，而S2药物给药组小鼠则与空白对照组正常小鼠相似，也呈现棕色强阳性信号(灰度图中颜色很深，如图16C中箭头所指)。图16D是平均光密度值的统计结果。结果显示，模型对照组的Insulin表达与空白对照组相比显著降低(P<0.05，#)，S9药物给药组相对于模型对照组虽有所升高，但差异不具有显著性(P>0.05)。S2药物给药组相对于模型对照组则显著提高(P<0.05，*)，说明S2药物具有非常好的保护胰岛免受损伤或修复胰岛损伤的作用，效果明显好于金团簇粗产品S9药物。S1药物与S9药物结果相似，S3药物给药组与模型对照组处于相同水平，说明S3药物不具有保护胰岛或修复胰岛的功能。S4-S8药物与S3药物类似，也未表现出明显药效，在此不赘述。方法二先造模再给药的试验结果与此处结果相似，S2药物也表现出显著的保护胰岛免受损伤或修复胰岛损伤的作用，效果也明显优于S1药物和金团簇粗产品S9药物，S3-S8药物也未表现出明显药效，在此不赘述。
另一方面，HE染色试验结果表明，模型对照组(图16F)胰腺较空白对照组(图16E)可见明显组织学变化，主要表现为胰岛数量减少、胰岛体积重度减小及胰岛细胞数量显著减少，并有轻中度胰岛炎症。而S2药物给药组(图16G)中，胰岛的组织结构相对于模型对照组有大幅改善，相对于空白对照组则未见异常变化，胰岛内也未见炎细胞浸润，同样说明S2药物对胰岛的极好的保护作用。S9药物给药组的胰岛组织结构相对于模型对照组虽也有明显改善，但相对于S2药物给药组则有较大差距，具体表现在胰岛体积出现一定程度减小，胰岛细胞数量也有减少，胰岛内也出现少量炎细胞浸润。S1药物与S9药物结果相似，S3药物给药组与模型对照组处于相同水平，说明S3药物不具有保护胰岛或修复胰岛的功能。S4-S8药物与S3药物类似，也未表现出明显药效，在此不赘述。
这些结果表明，S2药物不仅能显著改善血糖指标，还有保护胰岛免受损伤或修复胰岛损伤的功能。
以上结果说明，含有相同配体的不同金团簇分子的分子结构对其在Ⅱ型糖尿病的预防与治疗中的应用效果影响极大。对于含有配体L-NIBC的不同金团簇分子，金团簇分子Au24(L-NIBC)18(S1药物)对II型糖尿病的预防与治疗表现出一定治疗效果，与金团簇粗产品S9药物相似，而金团簇分子Au15(L-NIBC)13(S2药物)则表现出明显优于金团簇分子Au24(L-NIBC)18(S1药物)和金团簇粗产品S9的极好的治疗效果，其他6种金团簇分子则无明显疗效。这表明金团簇分子Au15(L-NIBC)13(S2药物)在II型糖尿病的预防及治疗中具有极其显著的优势。
另一方面，由于胰岛损伤是I型糖尿病的典型特征之一，S2药物在胰岛保护及胰岛损伤修复中的优异作用说明其在I型糖尿病的预防及治疗中也具有显著优势和有广阔应用前景。
进一步研究表明，在金团簇粗产品S9药物中添加S2药物得到混合药物，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合药物中的含量达到7％时，与S9相比即可显著提高混合药物的药效。
实施例7、帕金森病(PD)动物模型试验
7.1、试验方法
MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)损伤模型是PD研究中普遍使用的动物模型。本实施例使用这一动物模型进行研究。试验动物采用SPF级雄性C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9药物给药组，每组12只。模型对照组连续7天每天腹腔注射MPTP(30mg/kg/天)以建立MPTP小鼠PD模型，空白对照组以等量生理盐水代替。各药物给药组先腹腔注射MPTP(30mg/kg/天)，半小时后再腹腔注射相应药物(10mg/kg/天)，每天一次，连续7天。
采用自发活动计数、滚轴(rotarod)试验及游泳试验分析药物对模型动物行为学的影响。具体方法如下：
(1)自主活动计数(open field)：实验时将动物从饲养笼中转移到自主活动检测仪,待动物适应新环境5min后,开始记录5min内其自发活动及变化，以5min内动物的活动里程及移动速度来衡量其活动能力的强弱。
(2)滚轴(rotarod)试验：动物需要在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验。实验时将动物置于转棒仪的滚轴上并避免滑落,滚轴直径6cm，转速20rpm/min，适应5次后，每次检测15min，连续测3次取平均值。动物滑落下来时会相应停止下面的传感平台,并记录从滚轴掉下的潜伏期,每次试验记录小鼠的落棒潜伏期和落棒动物只数。
(3)游泳实验(swim test)：将受试小鼠放入Morris水箱中，水深60cm，水温为22℃。记录10min内动物游泳的活动里程、游泳时间来衡量其活动能力的强弱。
行为学试验结束后，进行脑内纹状体中蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测。于冰上取出所需脑部位，RIPA裂解液裂解，匀浆4℃离心12000g，30min，提取蛋白，制备样品，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压55V-60V，电泳时间为4.5h，半干法恒流转膜，电流设为60mA，时间约1.5h。5％脱脂奶粉室温封闭1h；加入TBST稀释的兔抗酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)(稀释比例1:300)，4℃过夜；回收抗体，TBST洗3次，10min/次；加入TBST稀释的IRDye R 680RD Goat anti-Rabbit(稀释比例1:3000)；TBST洗3次，10min/次；双色红外激光成像系统扫描蛋白信号。
所有数据采用Prism 5.0软件处理，数据用表示，采用t检验或单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
7.2、试验结果
图17是行为学的测试结果。
模型对照组小鼠在给予MPTP后3～5min，出现震颤、运动减少、弓背、后肢张开、步态不稳、竖尾、竖毛等改变，个别出现癫痫样发作，约30～60min后上述症状逐渐减轻，24h后基本恢复正常，但随着给药次数的增加，急性反应表现反倒减轻，但24h后其运动减少、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显。
图17A和图17B显示，连续注射MPTP的7天后，模型对照组小鼠自发活动里程相对于空白对照组下降了约47％(P<0.01，##)，移动速度下降了约25％(P<0.01，##)，表现出运动迟缓的症状。S1药物给药组小鼠的自发活动里程较模型对照组出现显著上升(P<0.05，*)，移动速度较模型对照组虽有所提高，但不具有显著性差异(P>0.05)。金团簇粗产品S9药物给药组小鼠的自发活动里程和移动速度与S1药物给药组相似，较模型对照组自发活动里程也有显著差异(P<0.05，*)，但移动速度则无显著性差异(P>0.05)。S2药物给药组小鼠的自发活动里程和移动速度较模型对照组均出现显著上升(P<0.01，**)，且S2药物给药组上升幅度均明显大于S1药物给药组和S9药物给药组(相对于S9药物，分别高了66％和1.1倍)(其中活动里程S2和S9药物之间具有显著性差异，P<0.05，$)，几乎恢复到与空白对照组小鼠相近的水平。S3-S8药物给药组与模型对照组相比两个指标均无显著性差异(P<0.05)。
在游泳能力测试中，小鼠的游泳时间(Swimming duration)越长，游泳里程(swimming distance)越远，说明小鼠肢体运动协调情况越好。如图17C和17D所示，与空白对照组相比，模型对照组小鼠10分钟游泳里程下降了约26％，游泳时间下降了约29％，且均出现显著性差异(P<0.01，##)。S1药物给药组相对于模型对照组游泳里程出现显著性上升(P<0.05)，游泳时间虽也有一定幅度上升，但缺乏显著性(P>0.05)。金团簇粗产品S9药物给药组的游泳里程和游泳时间相对于模型对照组均出现显著性上升(P均小于0.05，*)。S2药物给药组相对于模型对照组游泳里程和游泳时间均出现大幅上升(P均小于0.01，**)，上升幅度均显著大于S9药物给药组(P均小于0.05，$)，几乎达到空白对照组的水平。其余药物的数值与模型对照组处于相近水平，与模型对照组均无显著性差异(P>0.05)。
如图17E和图17F所示，在滚轴行为学测试中，空白对照组小鼠落棒潜伏期(Falllatency)和落棒几率(Drop rate)分别为16.4±3.4min和26.1±2.0％，模型对照组小鼠落棒潜伏期显著缩短至8.2±2.7min，落棒几率显著增加到77.3±4.1％，表明MPTP造模导致小鼠运动协调能力下降,抓棒不稳,易于落棒。相对于模型对照组，S1药物给药组的落棒潜伏期有显著上升(P<0.05，*)，落棒几率有显著下降(P<0.05，*)。相对于模型对照组，金团簇粗产品S9药物给药组的落棒潜伏期有所延长，但缺乏显著性(P>0.05)，落棒几率有显著下降(P<0.05，*)，说明也有较好效果。相对于模型对照组，S2药物给药组的落棒潜伏期有显著延长(P<0.05，*)，落棒几率有极显著下降(P<0.001，***)，落棒几率相对于S9药物给药组也出现显著性差异(P均小于0.05，$)。其他给药组在两个参数上与模型对照组均处于相同或相近水平，无统计学差异(P>0.05)，说明无显著药效。
以上结果说明，S2药物对MPTP造模的帕金森病小鼠模型的行为学障碍有极好疗效，S1和金团簇粗产品S9药物虽也有较好疗效，但远差于S2药物。
蛋白印迹法(Western blot，WB)被用于进一步检测小鼠脑内纹状体中的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)蛋白表达量。TH是多巴胺(DA)生物合成途径的关键酶，TH免疫印迹检测可以显示组织中TH的表达水平，从而显示DA神经元的变化。图18显示了WB试验的结果。结果显示，空白对照组的TH表达量为100±3.1％，MPTP处理使模型对照组TH表达量下降到57.2±3.6％。S1药物和金团簇粗产品S9药物处理使TH表达量分别恢复至66.8±2.2％和70.2±3.0％，与模型对照组差异具有显著性(P<0.05，*)，说明S1药物具有抗MPTP毒性的作用，对脑内DA神经元的特异性丢失具有一定保护作用。令人惊讶的是，S2药物处理使TH表达量恢复至85.3±2.6％，与模型对照组差异具有显著性(P<0.01，**)，与S9和S1药物相比差异也具有显著性(P<0.05，$)，说明S2药物具有极佳的神经保护作用，效果明显好于金团簇粗产品S9药物。S3药物给药组的TH表达量相对于模型对照组则处于同一水平，说明S3药物无显著的神经保护作用。
以上结果说明，含有相同配体的不同金团簇分子的分子结构对其在帕金森病的预防与治疗中的应用效果影响极大。对于含有L-NIBC的不同金团簇分子，金团簇分子Au24(L-NIBC)18(S1药物)和金团簇粗产品S9药物具有一定预防和治疗效果，金团簇分子Au15(L-NIBC)13(S2药物)则表现出极佳预防和治疗效果，且效果明显优于金团簇分子Au24(L-NIBC)18和金团簇粗产品S9药物，其他6种金团簇分子则无明显疗效。这表明金团簇分子Au15(L-NIBC)13相对于其他7种金团簇分子以及金团簇粗产品S9药物在帕金森病的预防及治疗种具有极其显著的优势，更适用于制备预防或治疗帕金森病的药物。
进一步研究表明，在金团簇粗产品S9药物中添加S2药物得到混合药物，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合药物中的含量达到7％时，与S9相比即可显著提高混合药物药效。
实施例8、缺血再灌注青光眼动物模型
8.1、试验方法
SD雄性大鼠，根据造模前ERG的b波振幅，选取96只动物，随机分成10组，右眼进行眼缺血再灌注造模，左眼不做造模处理(作为空白对照)，造模当日(计为第一天，D1)即开始给药。除了模型对照组不作处理，其余为各给药组，包括S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9给药组，均采用滴眼给药，剂量为0.05mg/眼，每天3次，连续21天，D1的给药时间设置为造模前约3h、2h和1h，除D1外其余给药日给药间隔为3h。试验期间每天对动物进行一般临床观察、眼局部观察，每周1次体重测定，给药前、首次给药后第7(D8)、14(D15)、21天(D22)进行全视野视网膜电图(ERG)、光学相干断层扫描(OCT)检查。
末次检查结束后所有动物进行安乐死，进行大体解剖观察，并对双眼眼球采集并固定于Davidson’s液中，进行常规组织学处理：包括取材、石蜡包埋、切片、HE染色。视神经剔除周围结缔组织后，迅速置于预冷的PFA固定液中、修快、脱水、树脂包埋、超薄切片、甲苯胺蓝染色。光镜下观察眼球各部分和视神经的结构，重点观察视神经轴突形态、视网膜各层厚度及细胞形态学改变。病理学家采用光学显微镜对切片进行检查和评估。使用标准术语对病变进行诊断和分级。采用4分级法对显微结果进行分级打分，分别为轻微(1分)、轻度(2分)、中度(3分)、重度(4分)，以便于进行组间比较。
数据统计分析：采用统计学软件SPSS 22.0对数据进行处理。首先用Levene Test对数据进行均一性检验，如果数据均一(P＞0.05)，则进行单因素方差分析；如果LeveneTest分析显示数据为非正态分布(P≤0.05)，则进行Kruskal-wallis非参数检验。如果Kruskal-wallis非参数检验结果显著(P≤0.05)，则进一步采用Mann-Whitney U检验进行两两比较。P<0.05视为数据有统计学差异。
8.2、试验结果
视网膜电图(ERG)是评价缺血再灌注青光眼动物视神经功能损伤的一种常用方法。视网膜的视感细胞在光的刺激下产生的一组复合的电位变化，可以用电极引出，通过适当的放大描记装置把它记录下来，即为ERG图，直接反映了视网膜视神经功能的变化。
图19A是模型对照组大鼠造模后第7天(D8)的左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模眼)(左幅)的ERG(DA3.0)的典型图例，可以看到a波振幅在左右眼无明显差异，但b波出现大幅变化。作为空白对照的正常的左眼b波清晰可见，振幅正常，而造模的右眼b波振幅大幅度下降，波形变得不清晰。图19B是模型对照组大鼠造模后第7天(D8)的和左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模眼)(左幅)的ERG(DA10.0)的典型图例，可以看到，左眼和右眼b波振幅与DA3.0相似，也出现大幅变化。以上结果说明造模眼的视神经功能严重下降，造模成功。
图19C和19D分别是各组大鼠右眼的全视野视ERG DA3.0和DA10.0的b波振幅测试结果。在造模及给药前(药前)，各组动物之间右眼b波振幅未见统计学差异。和同期模型对照组相比，S2药物给药组大鼠右眼的b波DA3.0振幅(图19C)和DA10.0(图19D)在D8、D15和D22均大幅高于模型对照组，且均有显著性差异，其中，DA3.0中D8：P<0.01(**)，其余天数均P<0.05(*)；DA10.0，所有天数P均小于0.05(*)。
图19E是S2药物给药组大鼠给药后第7天(D8)左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模并给药眼)(左幅)的ERG DA3.0典型图例，可以看到，S2药物用药后右眼ERG波形清晰正常，b波波形及振幅与左眼无明显差异。图19F是S2药物给药组大鼠给药后第7天(D8)左眼(正常眼)(右幅)和右眼(造模并给药眼)(左幅)的ERG DA10.0典型图例，可以看到，S2药物用药后右眼和左眼的ERGDA10.0的b波振幅与ERG DA3.0相似，左眼与右眼无明显差异，在此不赘述。这些结果说明S2药物对缺血再灌注造模的青光眼大鼠模型的视神经功能损伤有明显改善作用。
S9药物给药组大鼠的右眼b波DA3.0振幅在D8和D15与模型对照组大鼠右眼相比也显著升高(P均小于0.05，*)，D22则不存在显著性差异。在三个时间点，S9药物给药组的数值均明显小于S2药物给药组，且在D8和D22出现显著性差异(P均小于0.05，$)。对于右眼b波DA10.0振幅，S9药物给药组大鼠在D8和D22与模型对照组出现显著性升高(P均小于0.05，*)，但在D15则不存在显著性差异。在三个时间点，S9药物给药组的数值也均小于S2药物给药组。这些结果表明，金团簇粗产品S9药物对青光眼也有很好治疗作用，但疗效比S2药物差。
S1药物给药组大鼠的右眼b波DA3.0和DA10.0振幅在D8与模型对照组大鼠右眼相比也明显升高，且出现显著性差异(P<0.05，*)，但升高幅度明显低于S2药物给药组的大鼠右眼。在其他时间点与模型对照组相比则差异不明显(P>0.05)，说明S1药物也对青光眼治疗有一定作用，但效果差于金团簇粗产品S9药物。
其余的S3-S8药物，则未表现出任何治疗效果。
光学相干断层扫描(OCT)被进一步用于检查大鼠视网膜的厚度变化。研究结果表明，模型对照组大鼠右眼视网膜厚度在造模后无论是距视盘750μm还是1500μm处均随天数增加呈现逐渐下降的趋势。以距离视盘1500μm处的视网膜厚度为例，造模后第21天(D22)时相对于造模前下降幅度达到约13％，且差异具有显著性(P<0.01)。S2药物给药组大鼠的右眼在造模并给药后均明显高于模型对照组大鼠右眼在相应天数的数值，其中第14天(D15)的差异具有显著性(P<0.05)，这一结果也说明了S2药物对大鼠视网膜的保护作用。
图20显示甲苯胺蓝染色超薄切片所观察到的缺血再灌注造模及给药所引起的眼底病理改变，图20A、图20B和图20C分别显示了空白对照左眼、模型对照组右眼和S2药物给药组右眼的典型病理图片，图20D是病理评分的结果。病理检查表明，空白对照左眼视神经结构清晰，髓鞘呈大小不等的环形，未见明显异常(图20A)，模型对照组大鼠右眼在造模后可见严重的视神经结构紊乱及髓鞘脱失(图20B)。S2药物给药组大鼠的右眼相对于模型对照组右眼表现出极其明显的改善效果，视神经结构清晰，与正常左眼相似，仅能观察到少量的髓鞘轻微脱失现象(图20C)，且病理评分显著性低于模型对照组右眼(图20D)(P<0.01，**)。
S9药物给药组大鼠的右眼相对于模型对照组右眼表现出较好改善效果，但视神经结构有一定程度紊乱，髓鞘脱失较明显，病理评分明显低于模型对照组右眼(图20D)(P<0.05，*)。然而，当与S2药物给药组大鼠右眼相比时，病理评分明显更高，且差异具有显著性(P<0.05，$)，说明S2药物的药效比金团簇粗产品S9药物有显著提高。S1药物给药组与S9给药组相似，也有一定药效。
S3-S8药物则对病理评分无明显降低作用，说明无明显药效。
以上结果说明，对于含有相同配体的不同金团簇分子的分子结构对其在视神经保护及青光眼的预防与治疗应用中的效果影响巨大。对于含有L-NIBC的不同金团簇分子，金团簇分子Au15(L-NIBC)13(S2药物)具有极其优异的疗效，相对于其他七种金团簇分子以及金团簇粗产品S9药物在青光眼预防及治疗方面具有极其显著的优势。
进一步研究表明，在金团簇粗产品S9药物中添加S2药物得到混合药物，当金团簇分子Au15(L-NIBC)13在混合药物再的含量达到7％时，与S9相比即可显著提高混合药物的药效。

Claims (16)

1.L-N-异丁酰基半胱氨酸(L-NIBC)结合的金团簇分子，其特征在于，所述L-NIBC结合的金团簇分子包含：
金核；和
与金核结合的配体L-NIBC；
其中所述L-NIBC结合的金团簇分子具有分子式Au15(L-NIBC)13。
2.权利要求1所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13在制备治疗疾病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是多发性硬化症。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是阿兹海默症(AD)。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是肝硬化。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是糖尿病。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是帕金森症(PD)。
8.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疾病是青光眼。
9.治疗疾病的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13。
10.根据权利要求9所述组合物，其特征在于，所述L-NIBC结合的金团簇分子Au15(L-NIBC)13，当作为金团簇分子混合物中的一个组份在所述组合物中应用时，在所述混合物中的色谱含量至少是7％。
11.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是多发性硬化症。
12.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是阿兹海默症(AD)。
13.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是肝硬化。
14.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是糖尿病。
15.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是帕金森症(PD)。
16.根据权利要求9或10所述组合物，其特征在于，所述疾病是青光眼。
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