CN116496950A - 一株赖氨酸生产菌株及用途，生产赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一株赖氨酸生产菌株及用途，生产赖氨酸的方法，赖氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）cglzh1004，该谷氨酸棒杆菌cglzh1004保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467。本发明的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）相比出发菌产酸率、转化率以及发酵周期都有了较大改善，并且产酸稳定，可以显著提高发酵产酸率和转化率，降低生产成本，具有较好的工业化应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一株赖氨酸生产菌株及用途，生产赖氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-赖氨酸（L-Lysine），化学名称为a,s-二氨基己酸或2,6-二氨基己酸，是人体和动物重要的必须氨基酸之一，或称第一限制性氨基酸。人体和动物自身无法合成赖氨酸，赖氨酸是人和动物生存必需的生物大分子，其对于生物体内调节代谢平衡、提高生物体内对谷类蛋白质的吸收、改善动物营养和人类膳食营养、促进生长发育都具有重要作用。在饲料中添加适量的赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率。在畜牧业上，常用谷物喂养禽畜，但赖氨酸在谷物类食物中含量很低，且容易在加工过程中被破坏，因而被称为第一限制性氨基酸。在饲料、医疗、保健品、化妆品（保湿剂）等行业中被广泛使用。同时，赖氨酸作为一种初级化学品，化学工业上也可作为化工原料和前体使用，具有较大的需求量，市场前景广阔。
L-赖氨酸的生产方法主要有提取法、合成法、化学酶法和微生物发酵法，其中最重要的也是目前应用最为广泛的是微生物发酵法。微生物发酵法生产L-赖氨酸，比传统的采用化学合成法和蛋白质水解法，具有更低的生产成本、更加绿色环保、更易于大规模生产等显著的优越性。国内外大量企业和研究机构致力于L-赖氨酸发酵生产技术的研究，目前已取得较大进展，但仍然存在较多问题，其中赖氨酸生产菌种对原材料、培养条件和控制工艺都要求较高，控制工艺复杂，在生产过程中菌种的遗传性也不稳定，使得发酵生产水平波动较大，造成原材料及能耗较大，使生产成本偏高。通过基因改造的菌种，在生产过程中容易出现遗传稳定性差、多次传代后关键目的基因丢失、菌种易反向突变等一系列问题，会出现生产水平严重低下、产酸极低甚至不产酸的异常情况，造成倒罐，损失巨大。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述生产技术问题的不足，提供一株赖氨酸生产菌cglzh1004及使用其进行发酵生产L-赖氨酸的方法。
本发明所采取的技术方案是：一株赖氨酸生产菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）cglzh1004，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467。
赖氨酸生产菌株的用途是采用谷氨酸棒杆菌cglzh1004发酵生产赖氨酸。
采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）cglzh1004发酵生产赖氨酸的方法，包含如下步骤：
（1）菌种活化，将保藏的赖氨酸生产菌—谷氨酸棒杆菌cglzh1004甘油管菌种接种于无菌固体活化种子培养基培养，培养温度30~40℃，培养20h；在无菌超级台上用接种针取培养后菌体划线于平板上，培养30~40℃，培养16h；挑取平板中的单菌落划线接种于斜面培养基中，培养30~40℃，培养16h。
（2）菌种培养，将活化后的赖氨酸生产菌cglzh1004菌种接至无菌液体种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度30~40℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.08 MPa。
（3）发酵培养，将步骤（2）制得的对数生长期菌种接入无菌发酵培养基中进行发酵培养。发酵培养条件：温度30~40℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.10 MPa；发酵过程中通过调整搅拌转速和通气量进行溶氧控制，溶氧控制10~30%；发酵过程中通过控制补糖流量控制残糖含量在0.05~2%；发酵过程中通过控制补硫酸铵流量控制发酵液中AN（氨）含量在0.05~2%；培养至30~50 h结束培养，得到L-赖氨酸发酵液。
（4）提取纯化，将步骤（3）得到的L-赖氨酸发酵液进行后续处理，一部分L-赖氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行离子交换，收集赖氨酸富集液，再进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-赖氨酸晶体；另一部分赖氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入前一步陶瓷膜过滤后的浓菌浆和离心母液，加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒干燥，得到低含量饲料级L-赖氨酸颗粒产品；
其中菌种培养的培养基包含葡萄糖60~100 g/L、豆粕水解液1~20 g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸二氢钾1~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、微量元素1份。
其中发酵培养的培养基包含葡萄糖20~80 g/L、豆粕水解液0.5~10 g/L、玉米浆1~30g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸0.05~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、氯化钾0.1~10 g/L、微量元素1份。
其中微量元素包含铁、钠、锌、钾、铜、锰；微量元素1份是指每升培养基中含有微量元素0.05~200mg。
其中膜过滤设备为陶瓷膜，孔径为8nm~50nm，蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为50~75℃，真空度为-0.08~-0.10MPa，浓缩比为3~10倍，冷却结晶设备为冷却结晶器，降温控制速度为2~5℃/h，最低温度为5~15℃，L-赖氨酸晶体干燥设备为流化床干燥机，L-赖氨酸颗粒产品干燥设备为喷浆造粒干燥机。
本发明的有益效果是：
本发明通过将谷氨酸棒杆菌CICC20213变种进行反复进行ARTP诱变处理、DES诱变处理、紫外诱变处理，再经过多轮多种抗性定向筛选，获得本申请中已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.25467的赖氨酸生产菌cglzh1004。该菌株具有更好的稳定性和更好的生产水平，其具有的独特生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用，具有较好的工业应用前景。
生物材料的保藏
一株赖氨酸生产菌cglzh1004，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1是葡萄糖和豆粕水解液的响应面关系图
图2是葡萄糖和玉米浆的响应面关系图
图3是豆粕水解液和玉米浆的响应面关系图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一株赖氨酸生产菌cglzh1004，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467。
采用赖氨酸生产菌cglzh1004发酵生产赖氨酸的方法，包含如下步骤：
（1）菌种活化，将保藏的赖氨酸生产菌cglzh1004甘油管菌种接种于无菌固体活化种子培养基培养，培养温度30~40 ℃，培养20h；在无菌超级台上用接种针取培养后菌体划线于平板上，培养30~40 ℃，培养16h；挑取平板中的单菌落划线接种于斜面培养基中，培养30~40 ℃，培养16h。
（2）菌种培养，将活化后的赖氨酸生产菌cglzh1004菌种接至无菌液体种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度30~40 ℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.08 MPa。
（3）发酵培养，将步骤（2）制得的对数生长期菌种接入无菌发酵培养基中进行发酵培养。发酵培养条件：温度30~40 ℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.10 MPa；发酵过程中通过调整搅拌转速和通气量进行溶氧控制，溶氧控制10~30%；发酵过程中通过控制补糖流量控制残糖含量在0.05~2%；发酵过程中通过控制补硫酸铵流量控制发酵液中AN含量在0.05~2%；培养至30~50 h结束培养，得到L-赖氨酸发酵液。
（4）提取纯化，将步骤（3）得到的L-赖氨酸发酵液进行后续处理，其中50%的L-赖氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行离子交换，收集赖氨酸富集液，再进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-赖氨酸晶体；另外50%的赖氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入前一步陶瓷膜过滤后的浓菌浆和离心母液及辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒，得到低含量饲料级L-赖氨酸颗粒产品；
其中菌种培养的培养基包含葡萄糖60~100 g/L、豆粕水解液1~20 g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸二氢钾1~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、微量元素1份。
其中发酵培养的培养基包含葡萄糖20~80 g/L、豆粕水解液0.5~10 g/L、玉米浆1~30g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸0.05~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、氯化钾0.1~10 g/L、微量元素1份。
其中微量元素包含铁、钠、锌、钾、铜、锰；微量元素1份是指每升培养基中含有微量元素0.05~200mg。
其中膜过滤设备为陶瓷膜，孔径为50nm，蒸发浓缩结晶设备为单效蒸发结晶器，蒸发温度为75℃，真空度为-0.09MPa，浓缩比为10倍，冷却结晶设备为冷却结晶器，降温控制速度为5℃/h，最低温度为5℃，L-赖氨酸晶体干燥设备为流化床干燥机，L-赖氨酸颗粒产品干燥设备为喷浆造粒干燥机。
通过该种方式，采用30L发酵罐培养，培养至48h，发酵液中L-赖氨酸217.65 g/L，糖酸转化率70.23%。经过提取纯化，得到L-赖氨酸晶体3199.46g、L-赖氨酸颗粒产品4663.93g。
糖酸转化率计算公式=发酵产出的赖氨酸总量/发酵耗用的葡萄糖总量g×100%。发酵产出的赖氨酸总量g=发酵液体积L×发酵产酸含量g/L。
实施例2
本发明所采取的技术方案是：一株赖氨酸生产菌cglzh1004，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467。
采用赖氨酸生产菌cglzh1004发酵生产赖氨酸的方法，包含如下步骤：
（1）菌种活化，将保藏的赖氨酸生产菌cglzh1004甘油管菌种接种于无菌固体活化种子培养基培养，培养温度30~40℃，培养20h；在无菌超级台上用接种针取培养后菌体划线于平板上，培养30~40℃，培养16h；挑取平板中的单菌落划线接种于斜面培养基中，培养30~40℃，培养16h。
（2）菌种培养，将活化后的赖氨酸生产菌cglzh1004菌种接至无菌液体种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度30~40 ℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.08 MPa。
（3）发酵培养，将步骤（2）制得的对数生长期菌种接入无菌发酵培养基中进行发酵培养。发酵培养条件：温度30~40 ℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.10 MPa；发酵过程中通过调整搅拌转速和通气量进行溶氧控制，溶氧控制10~30%；发酵过程中通过控制补糖流量控制残糖含量在0.05~2%；发酵过程中通过控制补硫酸铵流量控制发酵液中AN含量在0.05~2%；培养至30~50h结束培养，得到L-赖氨酸发酵液。
（4）提取纯化，将步骤（3）得到的L-赖氨酸发酵液进行后续处理，其中40%的L-赖氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行离子交换，收集赖氨酸富集液，再进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-赖氨酸晶体；其余60%的赖氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入前一步陶瓷膜过滤后的浓菌浆和离心母液，加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒，得到低含量饲料级L-赖氨酸颗粒产品；
其中菌种培养的培养基包含葡萄糖60~100 g/L、豆粕水解液1~20 g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸二氢钾1~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、微量元素1份。
其中发酵培养的培养基包含葡萄糖20~80 g/L、豆粕水解液0.5~10 g/L、玉米浆1~30g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸0.05~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、氯化钾0.1~10 g/L、微量元素1份。
其中微量元素包含铁、钠、锌、钾、铜、锰；微量元素1份是指每升培养基中含有微量元素0.05~200mg。
其中膜过滤设备为陶瓷膜，孔径为8nm，蒸发浓缩结晶设备为多效蒸发结晶器，蒸发温度为50~75℃，真空度为-0.08~-0.10MPa，浓缩比为3~10倍，冷却结晶设备为冷却结晶器，降温控制速度为2~5℃/h，最低温度为15℃，L-赖氨酸晶体干燥设备为流化床干燥机，L-赖氨酸颗粒产品干燥设备为喷浆造粒干燥机。
通过该种方式，采用350吨发酵罐培养，发酵培养至45 h，发酵液中L-赖氨酸221.06 g/L，糖酸转化率71.08%。经过提取纯化，得到L-赖氨酸晶体30.67t（吨）、L-赖氨酸颗粒产品67.75t。
糖酸转化率计算公式=发酵产出的赖氨酸总量/发酵耗用的葡萄糖总量g×100%。
实施例3
赖氨酸生产菌cglzh1004的诱变筛选方法
以谷氨酸棒杆菌CICC20213变种为出发菌，经过多轮原生质体紫外诱变、硫酸二乙酯（DES）化学诱变、常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP ）诱变处理，同时结合多种结构类似物抗性定向筛选，获得具有底物抗性和遗传标记的赖氨酸高产菌株。谷氨酸棒杆菌CICC20213变种由天津科技大学微生物菌种保藏管理中心对谷氨酸棒杆菌CICC20213突变后获得，谷氨酸棒杆菌CICC20213购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（电话：010-53218300）。
原生质体紫外诱变方法：取制备好原生质体2~3ml，加入直径5 cm的平皿中，置于20 w的紫外灯下，垂直照射60~90 s，然后用移液枪吸取0.2 ml涂布于培养皿中，避光32 ℃培养36~72 h。硫酸二乙酯（DES）化学诱变方法：用菌株斜面菌株经过一次种子培养后，离心沉降10 min（3000~5000 r/min），收集菌体，用无菌水洗涤菌体2~3次，再次离心收集菌体，加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液至原体积，用浓度为1%（v/v）的硫酸二乙酯处理30~60 min，用无菌水稀释后，进行一级培养。ARTP诱变选育方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于种子培养基中，180 r/min、32 ℃摇床培养4.5 h，取1 mL种子液于1.5 mL EP管，4000 rpm离心，去除上清液，加入1 mL生理盐水，混匀，反复三次，将菌悬液稀释，使菌悬液OD600为0.6~1.0；取10 µL 稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，ARTP 诱变条件：射频功率120 W，处理距离2 mm，载气流量10 SLM (Standard liters per minute)，处理温度为室温（20~40℃），诱变处理时间选择致死率达到90%以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1 mL 无菌生理盐水的EP管中，震荡混匀，然后稀释到10-1、10-2、10-3倍，取100 µL均匀涂布到平板上，每个梯度做两个平行，32℃培养24 h。
抗性菌株筛选方法：用接种环从诱变后的平板中取一满环菌种于无菌离心管中，用无菌水离心洗涤两次，然后悬于无菌水中制成菌悬液，按浓度梯度制备一系列的赖氨酸乙酯盐酸盐、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、赖氨酸氧肟酸盐、γ-甲基赖氨酸、α-氯已内酰胺抗性培养基平板，直接将菌悬液分别涂布于抗性平板上，32 ℃培养2～3 d。根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度，随机挑选生长菌落进行筛选。
菌种初筛：将种子培养基分装到96孔板中，每个1mL，将平板上的单菌落挑到种子液孔板中，180 r/min，32 ℃培养6 h，并同时接种到另一块平板上，32℃培养22 h后放入冰箱。将发酵培养基分装到孔板中，每个0.9 mL，种子液接0.15 mL，180 r/min，32℃培养20h。挑取发酵产酸较高的菌种，将平板上对应序号的菌种挑至斜面，32℃培养20 h，甘油管保存。
菌种复筛：将初筛甘油管保藏的菌种分别划一支斜面，32℃培养20 h。从斜面上挑一环菌至500 mL种子摇瓶中，180 r/min，32℃培养10 h，转接500 mL发酵摇瓶，180 r/min，32℃培养24 h，测发酵摇瓶产酸，挑取产酸较高的菌种保存。
遗传稳定性试验：
将上述筛选获得的赖氨酸高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代30代，每一代菌株先进行种子培养，选择遗传稳定和产酸高的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把赖氨酸高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。
将最终获得的一株赖氨酸高产菌株cglzh1004再连续传种30次，使用30L发酵罐培养考察其L-赖氨酸的产量。结果如下：
表1 菌株cglzh1004的遗传稳定性
从表1中可以看出，突变菌株cglzh1004的遗传稳定性良好，连续传代30次在30L发酵罐培养结束的赖氨酸产量基本稳定在210~230g/L，菌株cglzh1004的遗传稳定性良好。
实施例4
培养基优化试验
通过多次单因素试验，确定葡萄糖、豆粕水解液、玉米浆对赖氨酸发酵产酸具有显著的影响。在单因素试验结果基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken Design(BBD)响应面试验设计法，如表2和表3所示，以葡萄糖、豆饼水解液和玉米浆为考察因素，分别以 A、B、C表示，以L-赖氨酸的产量(g/L)为指标进行优化。
表2 Box-Behnken 响应面设计试验因素水平和编码
表3 响应面试验设计及结果
利用Design Expert 8.05b软件对试验数据进行分析及多元二次回归拟合，该回归模型(p值<0.0001)高度显著，失拟项(p值=0.1756)不显著，说明模型拟合得较好。根据模型做出相应的响应曲面见图1-图3。通过该组动态图对任何两因素交互影响L-lysine产量的效应进行分析与评价，从而确定最佳因素水平。
从图1-图3中可以直观的看出，实验因素对响应值的影响变化趋势，以及回归模型确实具有最大响应值。利用设计软件进行岭脊分析，可以得到最优培养基为：葡萄糖的浓度为55.69g/L、豆饼水解液的浓度为5.94 g/L、玉米浆的浓度为13.81 g/L，此时L-lysine产量最大预测值为229.389 g/L，经过30L发酵罐进行验证培养结果为230.45 g/L。
对比实验：
使用本发明中的赖氨酸生产菌cglzh1004和原菌株CICC20213变种，结合本发明中实施例1的相关工艺分别进行30L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：
表4 突变菌株和出发菌发酵生产赖氨酸的性能比较
从表4中可以看出，本发明中的菌株cglzh1004相比出发菌产酸率、转化率以及发酵周期都有了较大改善，菌株cglzh1004生产赖氨酸的能力得到了较大提升，并且产酸稳定，应用于赖氨酸工业化生产，可以显著提高发酵产酸率和转化率，降低生产成本，具有较好的工业化应用潜力。
对该菌株进行传代保藏，命名为赖氨酸生产菌cglzh1004，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），其分类命名为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），保藏日期为2022年8月1日，菌种保藏编号为CGMCC No.25467，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
中国科学院微生物研究所对赖氨酸生产菌cglzh1004的细胞形态、生理生化特征（见表5）、16S rRNA基因序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）、抗生素敏感性等项目进行了检测鉴定，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号cglzh1004的鉴定结果为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）；采用K-B法测定了菌种cglzh1004对30种抗生素的敏感性，试验结果表明，菌种cglzh1004对测试的23种抗生素敏感，对5种抗生素不敏感（见表6）。
表5细胞形态和理化实验结果
表6抗生素敏感性试验结果
本发明所述的赖氨酸生产菌cglzh1004及采用该菌株发酵生产赖氨酸的方法，经过多次试验及试生产，菌种稳定性大大提高，发酵生产水平取得了较大进展，采用该菌株发酵生产赖氨酸，产率和转化率具有较高水平，具有显著先进性，并且发酵配方原材料简单易得、工艺条件粗放，易于控制。经过350吨发酵罐生产，生产技术水平稳定。本发明技术适合进行工业化生产推广，具有显著的先进性和较好的应用前景。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (10)
1.一株赖氨酸生产菌株，其特征在于：所述赖氨酸生产菌株为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）cglzh1004，菌种保藏编号为CGMCC No.25467。
2.权利要求1所述的赖氨酸生产菌株的用途，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌cglzh1004发酵生产赖氨酸。
3.一种采用权利要求1所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：包含如下步骤：
（1）菌种活化，将保藏的谷氨酸棒杆菌cglzh1004甘油管菌种接种于无菌固体活化种子培养基培养，培养温度30~40℃，培养20h；在无菌超级台上用接种针取培养后菌体划线于平板上，培养温度30~40℃，培养16h；挑取平板中的单菌落划线接种于斜面培养基中，培养温度30~40℃，培养16h；
（2）菌种培养，将活化后的谷氨酸棒杆菌cglzh1004菌种接至无菌液体种子培养基中进行培养，培养至对数生长期，菌种培养条件：温度30~40 ℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.08MPa；
（3）发酵培养，将步骤（2）制得的对数生长期菌种接入无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件：温度30~40℃、pH值6.5~7.5、罐压0.02~0.10 MPa；发酵过程中通过调整搅拌转速和通气量进行溶氧控制，溶氧控制10~30%；发酵过程中通过控制补糖流量控制残糖含量在0.05~2%；发酵过程中通过控制补硫酸铵流量控制发酵液中AN含量在0.05~2%；培养至30~50 h结束培养，得到L-赖氨酸发酵液；
（4）提取纯化，将步骤（3）得到的L-赖氨酸发酵液进行后续处理，一部分L-赖氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行离子交换，收集赖氨酸富集液，再进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-赖氨酸晶体；另一部分赖氨酸发酵液通过蒸发浓缩系统进行浓缩，然后浓缩液中加入前一步陶瓷膜过滤后的浓菌浆和离心母液，加入辅料进行配制，将配制液进行喷浆造粒干燥，得到低含量饲料级L-赖氨酸颗粒产品。
4. 根据权利要求3所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：所述菌种培养的种子培养基包含葡萄糖60~100 g/L、豆粕水解液1~20 g/L、硫酸铵5~40 g/L、磷酸二氢钾1~10 g/L、硫酸镁0.05~5 g/L、微量元素0.05~200mg/L。
5. 根据权利要求3所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基包含葡萄糖20~80g/L、豆粕水解液0.5~10g/L、玉米浆1~30g/L、硫酸铵5~40g/L、磷酸0.05~10g/L、硫酸镁0.05~5g/L、氯化钾0.1~10 g/L、微量元素0.05~200mg/L。
6. 根据权利要求5所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基中葡萄糖的浓度为55.69g/L、豆粕水解液的浓度为5.94 g/L、玉米浆的浓度为13.81 g/L。
7.根据权利要求4-6任一项所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：所述微量元素包含铁、钠、锌、钾、铜、锰。
8.根据权利要求3所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：膜过滤设备为陶瓷膜，孔径为8nm~50nm。
9.根据权利要求3所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为50~75℃，真空度为-0.08~-0.10MPa，浓缩比为3~10倍。
10.根据权利要求3所述的赖氨酸生产菌株生产赖氨酸的方法，其特征在于：降温冷却结晶设备为冷却结晶器，降温控制速度为2~5℃/h，最低温度为5~15℃。
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