CN116495801B - 一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶及其制备方法与poct应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶及其制备方法与POCT应用。首先采用两步高温火焰喷射法制备高熵硫化物纳米酶；然后将制得的纳米酶置于氧气环境中，纳米酶中的硫离子与氧气反应生成二氧化硫，同时多余的氧掺杂在纳米酶颗粒中，得到硫空位氧掺杂的高熵硫化物纳米酶；最后将硫空位氧掺杂的高熵硫化物纳米酶与生物质酸进行反应，生物质酸中的氢以离子方式解离，氢离子取代纳米酶中的金属离子进而对该纳米酶的结构进行刻蚀，得到中空球形且表面带负电荷的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。本方法简单易行，制得纳米酶具有高比表面积和良好类过氧化物酶活性，在溶血性链球菌等POCT免疫分析领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能材料技术领域，涉及一种纳米酶，具体涉及一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶及其制备方法与POCT应用。
背景技术
天然酶的一些固有缺陷如稳定性低、价格昂贵等，大大限制了其在生物医学、食品安全以及环境保护等领域的实际应用。纳米酶作为一种人工酶，具有成本低、稳定性强、易于批量生产和储存等优势，解决了天然酶的局限性。与天然酶相比，纳米酶在医疗、食品等众多领域展示出了潜在的应用潜力。
其中，具有多种金属元素的高熵硫化物纳米酶由于具有丰富的活性位点、酶活性和良好的生物相容性等优势被广泛应用。目前高熵硫化物的制备方法多采用溶剂热法合成，但存在耗时长的缺点，限制了高熵硫化物纳米酶的大量使用。通过一种操作简单快速的技术制备产率高、易于储存的高熵硫化物是未来的必然趋势。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫物纳米酶。
本发明的目的之二是提供上述中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶的制备方法，方法简单，环保，可制备出多种类的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。
本发明的目的之三是提供上述中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶在POCT免疫分析检测中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将含5种前驱盐的溶液A与有机溶剂B混合，配成浓度为0.01～1mmol/mL的溶液C，超声混合均匀；在反应室中将溶液C雾化后，用液体喷雾结合高温火焰喷射的方法进行反应；反应结束后冷却至室温，收集到的粉末为制备高熵硫化物纳米酶的前驱盐模板；
步骤2，取步骤1中适量的前驱盐模板和硫代乙酰胺加入有机溶剂D中，配成含前驱盐模板和硫代乙酰胺的浓度为1.0～10.0mgmL-1的溶液E；与步骤1制备方法相同，在反应室中用液体喷雾结合高温火焰喷射的方法进行反应，自然冷却至室温收集到的粉末为高熵硫化物纳米酶；
步骤3，将步骤2中制得的高熵硫化物置于反应瓶中，通入氧气，50～200℃加热反应，高熵硫化物纳米酶中的硫离子与氧气发生反应生成二氧化硫，同时多余的氧会掺杂在纳米酶颗粒中，制得硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶；
步骤4，将步骤3中制得的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶置于反应瓶中，加入浓度为10％～70％的生物质酸同时在50～200℃加热搅拌，反应时间范围是5～60min，反应结束后自然冷却至室温，离心干燥得到固体粉末为中空球形且表面带负电荷的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。
优选的，步骤1中5种前驱盐溶液选自Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Bi3+、Al3+、Nd3 +、Gd3+、Ce3+、Cr3+、Sc3+、In3+等中任意5种金属离子的硫酸盐、硝酸盐或氯化物。
优选的，步骤1中所述有机溶剂B选自甘露醇、异山梨醇、茨醇中的两种，两种有机溶剂的体积比1:1～1:100，混合后总体积为50mL。
优选的，步骤2中所述有机溶剂D为醇类有机溶剂，更优选为无水乙醇。
优选的，步骤1、步骤2中所述的液体喷雾的速度控制范围是0.1～1.0mL/min，反应室的压力为0.01～2MPa，高温火焰的温度范围是400～1000℃，超声时间5～30min。
优选的，步骤3中所述氧气的流速控制范围是10～50mL/min，反应时间为5～50min。
优选的，步骤4中所述生物质酸选自柠檬酸、醋酸、松节油酸、茉莉酸、轮环糊精酸、糠酸中的一种。
第二方面，本发明提供上述制备方法制得的一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。
第三方面，本发明提供上述中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶在POCT免疫分析检测中的应用。
本发明制备的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物具有一定的类过氧化物酶活性。由于硫空位氧掺杂的中空结构，所制得纳米酶的高比表面积和活性位点增加，使得上述纳米酶的酶活性提高，更能够催化过氧化氢(H2O2)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)之间的氧化反应，加速产生氧化态TMB(ox-TMB)，反应体系从无色变成蓝色，在652nm附近产生强烈的光吸收。此外基于环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)和酶联免疫吸附技术(NLISA)对待测物进行检测。LAMP可以快速进行待测物DNA的复制，提高了特异性和灵敏度。NLISA中抗原抗体反应的特异性以及酶对底物高效催化作用，本发明将纳米酶用于LAMP+NLISA检测体系中，从而建立蓝色强度值与体系中待测标志物(溶血性链球菌)浓度之间的标准曲线，然后实现对未知浓度标志物的量化检测。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法适用于多种的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物的制备，该制备方法简单易行，制备时间短，方便快捷，制备得到的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物具有高比表面积和丰富的活性位点。此外该制备方法成本低，环保，可精准控制。实验结果表明，本发明制得的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶具有良好的类过氧化物酶活性，在溶血性链球菌(Streptococcus emolytic)的快速检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备机理图；
图2是中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶反应过程示意图；
图3是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶的透射电子显微镜图；
图4是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶的透射电子显微镜图；
图5是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶的透射电子显微镜图；
图6是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶的透射电子显微镜图；
图7是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶的透射电子显微镜图；
图8是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶的透射电子显微镜图；
图9是不同纳米酶在不同喷洒速度下的酶活曲线；
图10是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶(1mL/min)的吸收曲线；
图11是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶(1mL/min)的吸收曲线；
图12是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
图13是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶(0.1mL/min)的吸收曲线；
图14是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
图15是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
图16是免疫分析示意图；
图17是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
图18是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
图19是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
图20是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
图21是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
图22是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明提供一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫物纳米酶，首先是通过了两步高温火焰喷射法制备了高熵硫化物纳米酶；第一步高温火焰喷射法是通过将含前驱盐的溶液与机溶液均匀混合后，用高温火焰喷射法得到合成高熵硫化物的前驱盐模板；第二步高温火焰喷射法是取适量前驱盐模板与硫代乙酰胺混合在有机溶液中，将溶液雾化后用高温火焰喷射法合成高熵硫化物。然后将制得的纳米酶置于氧气环境中基于氧硫反应和氧硫置换，纳米酶中的硫离子与氧气反应生成二氧化硫得到硫空位，同时多余的氧也会掺杂在纳米酶颗粒中，得到硫空位氧掺杂的高熵硫化物纳米酶；最后将硫空位氧掺杂的高熵硫化物纳米酶与生物质酸进行湿化学反应，生物质酸中的氢以离子方式解离，氢离子取代纳米酶中的金属离子对该纳米酶的结构进行刻蚀，得到中空球形且表面带负电荷的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫物制备机理如图1所示，中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫物纳米酶制备过程如图2所示。
实施例1：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶(Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，Ni(NO3)2·6H2O，CuCl2·2H2O，Cr(NO3)3·9H2O和MnSO4·H2O溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Cu-Cr-Mn高熵硫化物纳米酶。
图3是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例2：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶(Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，Zn(NO3)2·6H2O，CoCl2·6H2O，CrCl3和Al2(SO4)3溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Zn-Co-Cr-Al高熵硫化物纳米酶。
图4是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例3：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶(Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，NiCl2·6H2O，CoCl2·6H2O，Gd(NO3)3·6H2O和Sc(NO3)3溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Gd-Sc高熵硫化物纳米酶。
图5是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例4：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Ni-Co-Cr-Bi高熵硫化物纳米酶(Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，Ni(NO3)2·6H2O，CoCl2·6H2O，Cr2(SO4)3和Bi(NO3)3·5H2O溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Ni-Co-Cr-Bi高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Ni-Co-Cr-Bi高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-Bi～高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-Bi高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-Bi高熵硫化物纳米酶。
图6是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例5：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶(Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，NiCl2·6H2O，CoCl2·6H2O，Cr2(SO4)3和In(NO3)3·5H2O溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Cr-In高熵硫化物纳米酶。
图7是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例6：中空球形的硫空位氧掺杂Fe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶(Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶)的制备
将各0.65mmol的Fe(NO3)3·9H2O，Ni(NO3)2·6H2O，CoCl2·6H2O，Nd(NO3)3·5H2O和Ce(NO3)3·9H2O溶解在2mL去离子水中，加入20mL甘露醇和30mL异山梨醇混合溶液，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的液体喷雾结合800℃的高温火焰喷射制得前驱盐模板。
取0.15g上述制得前驱盐模板与0.18g的硫代乙酰胺溶解在50mL的无水乙醇中，均匀混合。在压力为0.2MPa的反应室中，分别用喷射速度为1mL/min、0.5mL/min、0.1mL/min的真空液体喷雾结合900℃的高温火焰喷射制得Fe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶。
将50μgFe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶放置于圆底烧瓶中，通入氧气，氧气的流速是25mL/min，反应时间为12min。制得硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶。
将30μg硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶放置于烧瓶中，加入15mL30 wt％松节油酸，同时在90℃温度加热搅拌进行生物质酸刻蚀反应，总反应时间为15min，然后自然冷却至室温，离心干燥得到中空球形的硫空位氧掺杂的Fe-Ni-Co-Nd-Ce高熵硫化物纳米酶。
图8是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶的透射电子显微镜图。
实施例7：纳米酶类活性的评价
配制摩尔浓度为200mmol，pH值为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶解于二甲基亚砜得到0.1mmol的TMB溶液，将30wt％的过氧化氢溶液稀释成摩尔浓度为1mmol，将中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶分散在缓冲溶液中，超声5min，得到1mg/mL的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶分散液。在离心管中一次加入1680μL缓冲液，100μL酶分散液，200μL过氧化氢溶液以及20μL TMB溶液，常温下孵育15分钟后，用紫外分光光度计测量吸收情况。并与无中空球形的硫空位氧掺杂的高熵硫化物纳米酶添加的空白体系进行吸光度值的比较。
图10是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶(1mL/min)的吸收曲线；
图11是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶(1mL/min)的吸收曲线；
图12是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
图13是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶(0.1mL/min)的吸收曲线；
图14是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
图15是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶活性验证图，下曲线为TMB+过氧化氢吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶(0.5mL/min)的吸收曲线；
上述实验结果表面，本发明提供的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物具有良好的类过氧化物酶活性，并且不同元素不同的喷洒速度的酶活性有差异：
图9(a)表示Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶的活性大小：
1mL/min>0.5mL/min>0.1mL/min；
图9(b)表示Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶的活性大小：
1mL/min>0.5mL/min>0.1mL/min；
图9(c)表示Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶的活性大小：
0.5mL/min>1mL/min>0.1mL/min；
图9(d)表示Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶的活性大小：
0.1mL/min>0.5mL/min>1mL/min；
图9(e)表示Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶的活性大小：
0.5mL/min>0.1mL/min>1mL/min；
图9(f)表示Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶的活性大小：
0.5mL/min>1mL/min>0.1mL/min；
实施例8Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线，最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图17是Fe-Ni-Cu-Cr-Mn～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝0.9986X+1.20596，R2＝0.9973。
实施例9Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线，最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图18是Fe-Zn-Co-Cr-Al～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝0.7589X-0.00592，R2＝0.9964。
实施例10Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图19是Fe-Ni-Co-Gd-Sc～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝1.0950X+0.17112，R2＝0.9949。
实施例11Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图20是Fe-Ni-Co-Cr-Bi～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝1.0620X+1.67227，R2＝0.9958。
实施例12Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图21是Fe-Ni-Co-Cr-In～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝0.9956X-1.00732，R2＝0.9899。
实施例13Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶基于类过氧化物酶活性在生物检测中的应用
用环介导等温扩增技术对溶血性链球菌DNA(SH-DNA)进行扩增(溶血性链球菌购自西林)。链置换DNA的合成不停地自我循环，实现大量扩增，提高了灵敏度和特异性。
参考图16所示的免疫分析示意图。首先将抗异硫氰酸荧光素抗体(抗FITC抗体)固载在T线上，兔抗小鼠IgG固载在C线上。Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶被抗生物素抗体修饰为纳米酶探针。SH-DNA通过生物素和抗生物素抗体的组合与纳米酶探针偶联。样品中含有溶血性链球菌时，则SH-DNA的两端分别被纳米酶和异硫氰酸荧光素(FITC)标记。然后，双标记产物被抗FITC抗体在T线上捕获。游离的纳米酶探针继续流动，并通过纳米酶探针与兔抗小鼠IgG的反应停在C线最终T线、C线上都会显色；在不含溶血性链球菌情况下，只有C线显色。
将LAMP反应产物和捕获探针加入到样品区，最后加入显色反应混合溶液(最终浓度为0.1mmol TMB，1mmol的过氧化氢)。在红外光照射10min后用智能手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度根据不同浓度对应不同的蓝色强度值，得出相应被检测物质浓度-吸光度的标准线性方程。
图22是Fe-Ni-Co-Nd-Ce～纳米酶检测溶血性链球菌的标准曲线；
溶血性链球菌的标准曲线方程为：Y＝0.8794X-0.10681，R2＝0.9904。
本发明以中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶的活性，并将其用作催化剂，以3,3',5,5'～四甲基联苯胺(TMB)为显色底物，对溶血性链球菌进行快速且定量的检测，非常适用于居家自检测以及即时监测。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将含5种前驱盐的溶液A与有机溶剂B混合，配成浓度为0.01~1mmol/mL的溶液C，超声混合均匀；在反应室中将溶液C雾化后，用液体喷雾结合高温火焰喷射的方法进行反应；反应结束后冷却至室温，收集到的粉末为制备高熵硫化物纳米酶的前驱盐模板；其中5种前驱盐选自Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Bi3+、Al3+、Nd3+、Gd3+、Ce3+、Cr3+、Sc3+、In3+中任意5种金属离子的硫酸盐、硝酸盐或氯化物；有机溶剂B选自甘露醇、异山梨醇、茨醇中的两种，两种有机溶剂的体积比1:1~1:100，混合后总体积为50mL；
步骤2，取步骤1中的前驱盐模板和硫代乙酰胺加入有机溶剂D中，配成含前驱盐模板和硫代乙酰胺的浓度为1.0~10.0mgmL-1的溶液E；与步骤1制备方法相同，在反应室中用液体喷雾结合高温火焰喷射的方法进行反应，自然冷却至室温收集到的粉末为高熵硫化物纳米酶；
步骤3，将步骤2中制得的高熵硫化物置于反应瓶中，通入氧气，50~200 ℃加热反应，高熵硫化物纳米酶中的硫离子与氧气发生反应生成二氧化硫，同时多余的氧会掺杂在纳米酶颗粒中，制得硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶；
步骤4，将步骤3中制得的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶置于反应瓶中，加入浓度为10%~70%的生物质酸同时在50~200 ℃加热搅拌，反应时间范围是5~60min，反应结束后自然冷却至室温，离心干燥得到固体粉末为中空球形且表面带负电荷的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶；其中所述生物质酸选自柠檬酸、醋酸、松节油酸、茉莉酸、轮环糊精酸、糠酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，其特征在于，步骤2中所述有机溶剂D为醇类有机溶剂。
3.根据权利要求2所述的一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，其特征在于，步骤2中所述有机溶剂D为无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，其特征在于，步骤1、步骤2中所述的液体喷雾的速度控制范围是0.1~1.0 mL/min，反应室的压力为0.01~2 MPa，高温火焰的温度范围是400～1000℃，超声时间5~30min。
5.根据权利要求1所述的一种中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶制备方法，其特征在于，步骤3中所述氧气的流速控制范围是10~50mL/min，反应时间为5~50min。
6.一种权利要求1至5任一项所述制备方法制得的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶。
7.权利要求6所述的中空球形的硫空位氧掺杂高熵硫化物纳米酶在POCT免疫分析检测中的应用。
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