CN116463358A - 一个芝麻含油量调控基因SiNAC1及其检测引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个芝麻含油量调控基因SiNAC1及其检测引物对。该基因位于芝麻第10条染色体上，属于正调控基因，对含油量性状的解释率最高为43.8%；该基因长度为1439bp，包含3个外显子和2个内含子，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。本申请所涉及的芝麻含油量基因SiNAC1作为一个正调控基因，通过对该基因及其等位基因Sinac1的深入研究，可为芝麻等农作物含油量性状调控奠定良好技术基础，同时也可为芝麻育种技术提升和突破性优异新品种培育奠定重要理论和技术基础，因此，具有重要的技术实用意义。

Description

一个芝麻含油量调控基因SiNAC1及其检测引物对
技术领域
本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个芝麻含油量调控基因SiNAC1及其检测引物对。
背景技术
芝麻（Sesamum indicumL., 2n=26）是世界上重要的优质特色油料作物之一。研究表明，芝麻籽粒含油量在55%左右，其中油酸（C18:1）和亚油酸(C18:2)是主要脂肪酸组分，占脂肪酸总量的80%以上。尤其是芝麻油具有降血脂、预防冠心病和胆固醇等保健功效，因此在食品加工中具有重要地位。也因此，提高芝麻籽粒油脂含量和产量是对于增加芝麻油供应量具有重要的技术意义。
对芝麻基因组研究表明，芝麻含油量性状为数量性状。而在芝麻基因组中，参与油脂合成与代谢过程的关键基因达到了近千个。因此，充分挖掘和研究相关芝麻油脂合成调控的关键基因，对于培育芝麻新品种、以及提供芝麻油产量具有重要的技术意义。
发明内容
本申请中，发明人以560份芝麻核心种质群为材料基础，结合相关基因组重测序数据，采用自然群体关联分析、芝麻基因组变体数据库过滤等方法，成功获得了一个芝麻含油量性状相关的调控基因SiNAC1，基于该基因，可为芝麻含油量提高、以及优质芝麻新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一个芝麻含油量调控基因SiNAC1，该基因位于芝麻第10条染色体上，属于正调控基因（相较于低含油量型等位基因），对含油量性状的解释率最高为43.8%；该基因长度为1439bp，包含3个外显子和2个内含子，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGGTTATCTCATCACCTCATCAATCATATCTTTCTTTCTGCAGTAATATGTATATTGATGGATAGAAATTGGTTTTGGGCGTGCATGCAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCACAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGTAAGTCAAGCTAATCATATAAATATGTATCATCCGCTAGCTCCTGCACATGACTGTATTATTATATAAATGGCATATGCTTAAATATATATTATCTAACGTTTTATATATTTTATTTTGTACTTTTGTAGATGCACCATTAAACATAAATTTAAGTTAATGAATAAAAGAATCATATTACTGTATGCTTTCCACTTACTGCTTCATCAAATCAATTAAGGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
所述芝麻含油量调控基因SiNAC1所对应的cDNA，该cDNA序列长度为1131bp，可编码376个氨基酸；具体为：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCACAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
所述芝麻含油量调控基因SiNAC1或其对应的cDNA所编码蛋白，包括376个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MSISVNGQSQVPPGFRFHPTEEELLQYYLKKKVASEKIDLDVIQDVDLNKLEPWDIQEKCKIGSTPQNDWYFFSHKDKKYPTGTCTNRATASGFWKATGRDKVIYGNSRRIGMRKTLVFYKGRAPRGQKSDWIMHEYRLDDNTTATITHTNNHGSNAMGEGMQEEGWVVCRVFKKKNHSHKTLDTTPIISSSWSMITTINSCNEGTLEQMLQSIGTPFRRNHFPDADNNRRFLKLPNLHDSPNSSSRTQNCYQSLHVQMLGQEIADPGSINQSETSIGVHDWAALDRLVASQLNGHNEASKQLSSTFNHDDDSGMSTFCCPADDDQLVQLPQQRLSSSSSTRPYGTATHDYQNECDLWSFARSSNDQLCHLSDVSV。
所述芝麻含油量调控基因SiNAC1所对应的低含油量表型等位基因Sinac1，相较于正调控（高含油量）基因SiNAC1序列，该低含油量型gDNA序列发生有1个SNP变异；该基因长度为1439bp，包含3个外显子和2个内含子；碱基序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGGTTATCTCATCACCTCATCAATCATATCTTTCTTTCTGCAGTAATATGTATATTGATGGATAGAAATTGGTTTTGGGCGTGCATGCAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCAAAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGTAAGTCAAGCTAATCATATAAATATGTATCATCCGCTAGCTCCTGCACATGACTGTATTATTATATAAATGGCATATGCTTAAATATATATTATCTAACGTTTTATATATTTTATTTTGTACTTTTGTAGATGCACCATTAAACATAAATTTAAGTTAATGAATAAAAGAATCATATTACTGTATGCTTTCCACTTACTGCTTCATCAAATCAATTAAGGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
所述等位基因Sinac1所对应cDNA，与SiNAC1序列之间存在1个SNP非同义变化，并最终造成1个氨基酸变异；序列长度为1131bp，可编码376个氨基酸；具体如下：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCAAAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
所述等位基因Sinac1或其对应cDNA所编码蛋白，与高含油量型基因SiNAC1的cDNA所编码氨基酸序列的不同点在于，低含油量型基因cDNA序列所编码的第82氨基酸由T变为K； 包括376个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
MSISVNGQSQVPPGFRFHPTEEELLQYYLKKKVASEKIDLDVIQDVDLNKLEPWDIQEKCKIGSTPQNDWYFFSHKDKKYPKGTCTNRATASGFWKATGRDKVIYGNSRRIGMRKTLVFYKGRAPRGQKSDWIMHEYRLDDNTTATITHTNNHGSNAMGEGMQEEGWVVCRVFKKKNHSHKTLDTTPIISSSWSMITTINSCNEGTLEQMLQSIGTPFRRNHFPDADNNRRFLKLPNLHDSPNSSSRTQNCYQSLHVQMLGQEIADPGSINQSETSIGVHDWAALDRLVASQLNGHNEASKQLSSTFNHDDDSGMSTFCCPADDDQLVQLPQQRLSSSSSTRPYGTATHDYQNECDLWSFARSSNDQLCHLSDVSV。
PCR扩增制备所述芝麻含油量调控基因SiNAC11或其等位基因Sinac1PCR时的PCR扩增用引物对，具体设计为：
正向引物NAC1 Primer F：5’-ATGAGCATATCTGTGAATGGACAA-3’，
反向引物NAC1 Primer R：5’-CTATACGGAAACATCGGATAAATGG-3’。
利用所述PCR扩增用引物对制备获得芝麻含油量基因SiNAC1或其等位基因Sinac1的PCR扩增方法，包括如下步骤：
（1）提取制备基因组DNA模板
提取高含油量型芝麻种质或低含油量型芝麻种质的基因组DNA，以此作为PCR扩增用模板；
所述高含油量型芝麻种质，具体品种例如为豫芝11号；
所述低含油量型芝麻种质，具体品种例如为“树勋新富白”；
（2）PCR扩增
以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，利用PCR扩增用引物对（NAC1 Primer F/R），进行PCR扩增；25µl扩增体系参考设计如下：
模板DNA，1.0µL (50ng/µL)；
2×PrimeSTAR Max Premix，12.5 µL；
正向引物（NAC1 Primer F），1.0 µL (10µM)；
反向引物（NAC1 Primer R），1.0 µL (10µM)；
ddH2O，加至25µl；
PCR扩增程序参考：98℃预变性3分钟；之后95℃变性15秒，58℃复性15秒，72℃延伸1分10秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟；扩增产物4℃保存或直接进行电泳检测分析；
扩增产物（高含油量基因SiNAC1或其等位基因Sinac1）的序列扩增长度为1439bp。
针对芝麻含油量调控基因SiNAC1或其所对应的低含油量表型等位基因Sinac1的PCR检测用引物对，具体设计为：
SiOC1F1：5’-AGAAATGCAAAATTGGATCC-3’；
SiOC1R1：5’-ACCCTTGTAGAAAACAAGAGTC-3’；
扩增产物长度为192bp，具体扩增序列如下：
AGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCAAAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGT。
利用所述PCR检测用引物对的芝麻含油量表型的检测判定方法，包括如下步骤：
（一）提取基因组DNA
提取待测芝麻种质的基因组DNA；
（二）HRM（高分辨率熔解曲线，High-resolution melting curve）PCR检测
以步骤（一）所提取制备的基因组DNA为模板，利用PCR检测用引物对（SiOC1F1/R1）进行HRM PCR扩增；
PCR扩增时，反应体系参考设置如下：
模板DNA (50ng/µL) ，1.0 µL；
2 × Phanta Max Buffer，12.5 µL；
Forward Primer (10µM)，1.0 µL；
Reverse Primer (10µM)，1.0 µL；
dNTP Mix (10 mM each)，0.5 µL；
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.5 µL；
EvaGreen (20× in water)，1.25 µL；
加ddH2O 至总体积25µL；
PCR反应程序（LightCycler 480 Ⅱ荧光定量仪，美国Roche公司产品）参考为：95℃预变性5min，之后95℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸10s，循环40次，在进行溶解曲线分析，最后进行基因分型（Gene Scanning）分析。部分基因分型结果如图4所示。
（三）结果判定
需要说明的是，结果判定过程中所涉及的SNP标记位点属于C/A突变；
结果判定时，根据待检样本与对照样本的HRM PCR扩增结果，判定待检样本为高油含量基因型或者低油含量基因型；
若待检样本出现峰线，则待检样本为C/A型，判定为杂合型（含油量相对较高）；
若待检样本为平滑线，则测定样本为CC或AA纯合型；进一步地，区分纯合型待检样本究竟为CC型还是AA型，对待检样进行第二次HRM PCR，HRM PCR扩增前，在PCR扩增体系中加入与模板等量的含有纯合型低含油量表型等位基因Sinac1基因组DNA（即AA型模板）作为对照；
第二次HRM PCR扩增后：
若样本扩增出现峰线，则待检样本为CC型（与对照的低含油量基因型不一致），判定待检样本为纯合高油型（CC型）；
若样本扩增后仍为平滑线，则表示待检样本与对照基因组的基因型一致，含有SNP等位位点A，判定待检样本为纯合低油型（AA型）。
所述芝麻含油量调控基因SiNAC1在植物品种培育中的应用，通过基因SiNAC1超表达方式，用于培育（种子）高含油量作物新品种；所述作物具体例如为芝麻或拟南芥等。
鉴于芝麻含油量调控基因在芝麻品质改良、品种培育中的重要技术意义，发明人利用构建的560份芝麻核心种质群和基因组重测序数据库，结合现有芝麻高质量参考基因组，开展了含油量性状关联基因的挖掘探索。
含油量检测结果表明，3年5点8个环境下的560份样本的含油量变化为30.58%-57.82%。结合此性状的遗传分析结果表明，含油量性状主要受基因型影响，同时环境以及基因-环境互作也对该性状有一定影响。进一步的全基因组关联位点结果显示，位于芝麻基因组第10号染色体的15952989-16035890区域均表现出与含油量性状紧密连锁，其中SNP16035890关联最显著（p最显著为1.85E-42），对性状变异的最高解释率为43.8%。结合单倍型模块图分析，该SNP位点附近没有紧密连锁的p值小于E-5的SNP。基因组数据显示，SNP16035890位点所在的基因为evm.model.C34.308，将此含油量相关基因命名为SiNAC1。
上述工作基础上，为对该基因功能进行进一步研究和明确，发明人利用豫芝11号（高含油量型）和低含油量型代表种质“树勋新富白”，对该目标基因和等位基因进行了克隆和结构分析。初步明确了该基因在高、低含油量样品中具体结构序列差异原因。
基于上述工作，总体上，本申请的主要技术成果可以体现在如下几个方面：
（1）基于芝麻含油量调控基因SiNAC1的深入分析，对于揭示芝麻等农作物籽粒油脂形成与调控机理具有重要的技术意义；
（2）基于相关检测用引物对的检测，可为不同含油量芝麻种质资源的早期筛选、以及芝麻分子辅助育种体系的建立以及提高相关育种工作效率奠定一定技术基础；
（3）相关基因的克隆及相关检测方法建立，可为芝麻、甚至其他油料作物含油量性状调控奠定一定技术基础，因此具有重要的科研价值和经济应用价值
总之，本申请所涉及的芝麻含油量基因SiNAC1作为一个正调控基因，通过对该基因及其等位基因Sinac1的深入研究，可为芝麻等农作物含油量性状调控奠定良好技术基础，同时也可为芝麻育种技术提升和突破性优异新品种培育奠定重要理论和技术基础，因此，具有重要的技术实用意义。
附图说明
图1为本发明涉及的560份芝麻自然群体2016年三亚点（2016SY）含油量表型分布；
图2为本发明的芝麻自然群体2016年三亚点（2016SY）含油量性状全基因组关联分析Mahattan图；
图3为本发明的芝麻含油量基因SiNAC1及其等位基因的结构比较。绿色方框为外显子，黑色横线为内含子。箭头指示红色碱基为SiNAC1基因与等位基因Sinac1的核苷酸序列差异位点；
图4为本发明的芝麻含油量基因SiNAC1及其等位基因编码蛋白序列比较；
图5为本发明的含油量基因标记引物对在部分芝麻种质中的HRM PCR扩增结果；
图6为本发明的拟南芥转SiNAC1基因植株PCR检测。泳道M为DL 2,000 marker，显示的条带从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。SiNAC1基因扩增产物为1131bp；抗性筛选基因bar扩增产物为430bp；
图7 为本发明的拟南芥阳性转基因植株SiNAC1表达情况；WT为非转基因拟南芥野生型对照；
图8本发明的转SiNAC1拟南芥阳性植株籽粒的含油量变化图；WT为非转基因拟南芥野生型对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
芝麻品种豫芝11号是现有芝麻育种及栽种中常见和常用材料，该品种芝麻为单杆型，具有产量高、丰产性好等优点，籽粒属于白粒，含油量较高（高于50%）；
芝麻“源树勋新富白”，属于一种分支型芝麻品种，其蒴果四棱，籽粒黄色，为一种低含油量型（低于50%）种质；
上述芝麻种质及其他未详细说明种质资源，均来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库；
需要说明的是，相关种质材料的使用、研究均是符合相关行政法规规定的，相关种质材料均可从河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库这一公开渠道或者其他种质资源库等公开渠道获得。
实施例1
鉴于含油量调控基因在油料作物中重要的技术意义，发明人对芝麻中含油量调控基因进行了初步挖掘探索，相关试验情况简要介绍如下。
（一）芝麻含油量性状表型调查
2016-2018年，发明人对560份芝麻自然群体在3年5点8个环境下进行了种植、收获；针对所收获的芝麻籽粒样本，采用近红外检测分析方法，确定了各样本籽粒的含油量等重要品质性状（检测分析方法参考：袁青丽等，芝麻籽粒脂肪酸主要组分的近红外光谱模型建立及特征分析，河北农业科学，2022）。
统计分析过程中，将粗脂肪含量大于50%的样本定位高含油量样本；将粗脂肪含量低于50%的样本定位低含油量样本，以便后续评价基因型。具体含油量表型性状统计分析结果如下表1所示。
表1，560份芝麻自然种质群含油量表型统计及遗传分析结果
注：2018PY、2018YC、2018YM、2017PY、2017YC、2017YY、2016YY、2016SY分别代表2018年平舆基地、2018年杨厂基地、2018年元谋基地、2017年平舆基地、2017年杨厂基地、2017年原阳基地、2016年原阳基地以及2016年三亚基地共5地点8个环境；“基因型（G）”是指基因型解释的方差；“环境（E）”是指环境解释的方差；“G×E”是指基因型与年份环境解释的方差；“**”代表极显著相关。
结合上述统计结果以现有芝麻含油量性状研究情况，可以看出：560份种质样本的最高含油量的范围为53.42-57.82%；最低含油量的范围为30.58-50.32%；含油量平均值范围为47.38-51.35%，符合数量性状正态分布的特征。也即，说明：芝麻含油量性状属于数量性状，受多对基因控制。同时，芝麻含油量性状与基因型、环境以及基因型-环境互作均极显著相关，但主要受遗传影响，遗传力H2为83.07 %。
（二）芝麻含油量性状全基因组关联分析
（1）基因组重测序和测序数据拼接
560份芝麻样本栽种过程中，以叶片为样品材料，发明人采用CTAB法提取了不同样本植株的DNA（提取操作参考：魏利斌等，芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），并采用Illumina测序方法对560份材料进行了基因组重测序，测序覆盖度≥10×。
随后，参考豫芝11号基因组数据（Zhang et al.，Ultra-dense SNP genetic mapconstruction and identification of SiDt gene controlling the determinategrowth habit in Sesamumindicum L，2016，Science Reports；Zhao et al.，Identification of sesame (Sesamum indicum L.) chromosomesusing the BAC‐FISHsystem, 2018, Plant Biology）；选用BWA（Burrows- Wheeler Aligner）软件将各株系的测序数据进行比对拼接。
（2）全基因组关联分析
上述工作基础上，进一步进行SNP矩阵分析。分析时，提取560份芝麻种质的vcf，共确定了变体4008867个。经过初步过滤，剩余高质量变体896745个。
随后将上述数据转换成适于Tassele 5.0软件的格式，并以前述的2016-2018年调查的8组表型数据为表型，进行MLM（Mixed linear model）关联分析。
经过分析，初步确定了与芝麻含油量性状紧密关联的变体及P值，部分结果参见图2。
初步分析结果表明：与目标性状紧密连锁（P值小于E-5）的SNP位点主要分布于第1、4、5、7、9、10、11号染色体。为进一步筛选出可靠度高的目标SNP区域，发明人对3个及以上环境中出现的SNP位点及其区域开展分析。结果发现，在全部紧密关联的SNP内，最小P值的SNP位点位于第10号染色体: SNP16035890, P=1.85E-42（2016SY）。随后对该SNP位点上下游100Kb的区域进行可变体统计分析和单倍型图谱分析。
单倍型分析时，参数设置为：minMAF:0.05; maximum LD comparison distance:100kb。结果显示，目标SNP16035890所在的15947323-16135949区域内，共有60个SNP位点（部分结果如下表2所示，展示了部分P值小于E-4的SNP信息）。分析表明：没有发现与SNP16035890有显著连锁的其他变体存在；而目标SNP16035890位于基因evm.model.C34.308的外显子中，属于G/T非同义突变，因此初步推测认定该基因为目标基因，并将该含油量相关基因命名为SiNAC1。也即，该基因位于第10号染色体，16034784bp-16036222bp。
表2，部分与芝麻含油量性状紧密关联的候选变体信息
注：数据为2016年三亚点（2016SY）表型数据关联结果。
实施例2
在实施例1对目标基因（SiNAC1）完成定位基础上，分别以低含油量型 “树勋新富白”和高含油量豫芝11的基因组DNA为模板，对芝麻含油量调控的高油含量型基因SiNAC1及等位基因低含油量型Sinac1基因进行了克隆和序列结构差异分析，相关情况简要介绍如下。
（一）提取制备PCR扩增用模板DNA
参考实施例1说明，分别提取制备低含油量型 “树勋新富白”和高含油量豫芝11的基因组DNA，并以此为后续PCR扩增用模板。
（二）设计引物
根据实施例1获得的关联变体位点和目标基因，参考芝麻基因组数据，设计PCR扩增用引物对如下：
正向引物NAC1 Primer F：5’-ATGAGCATATCTGTGAATGGACAA-3’，
反向引物NAC1 Primer R：5’-CTATACGGAAACATCGGATAAATGG-3’。
（三）PCR扩增
分别以步骤（一）所制备基因组DNA为模板，利用步骤（二）所设计引物，进行PCR扩增以制备获得基因SiNAC1及等位基因Sinac1；
25µl扩增体系参考设计如下：
模板DNA，1.0µL (50ng/µL)；
2×PrimeSTAR Max Premix，12.5 µL；
正向引物（NAC1 Primer F），1.0 µL (10µM)；
反向引物（NAC1 Primer R），1.0 µL (10µM)；
ddH2O，加至25µl；
PCR扩增程序（PTC-100热循环仪，MJ research公司产品）参考为：98℃预变性3min；之后98℃变性15s，58℃复性15s，72℃延伸70s，循环35次；最后72℃延伸10min。扩增产物4℃保存或直接进行电泳检测分析。
对PCR产物进行电泳检测会回收后进行测序分析（本申请中相关引物合成及测序由天津基因芯片生物公司提供完成）。测序结果如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示。
将高含油量型SiNAC1基因与其低含油量型等位基因Sinac1进行序列比对，示意图如图3所示。对比分析可以看出：
在基因序列的第333碱基存在一个SNP差异，上述变异造成了Sinac1基因的编码蛋白第82氨基酸由T变为K；而正是由于这一SNP非同义突变导致了芝麻NAC1蛋白功能发生了改变，并最终影响到了油脂合成，使得含油量表型由高油型变为低油型。
实施例3
在前述工作基础上，为进一步确认SiNAC1基因与芝麻含油量性状相关性，基于HRMPCR扩增技术需要，发明人设计了一对检测用引物对，并随机选择了25份高含油量型（多点环境下平均含油量大于50%）和25份低含油量型（多点环境下平均含油量小于50%）芝麻种质进行了验证。具体过程简要介绍如下。
（一）设计引物
考虑本申请中所涉及的SNP标记位点属于一种C/A突变，因此，基于HRM PCR方法具有较好便捷性，而基于HRM PCR扩增结果判定时，则需要区分如下不同情形：
若待检样本出现峰线，则可确定样本为C/A型，判定为杂合型（含油量相对较高）；
若待检样本为平滑线，则可确定样本为CC或AA纯合型；进一步地，区分纯合型待检样本究竟为CC型还是AA型，需对待检样进行第二次HRM PCR；而在第二次HRM PCR扩增前，需在PCR扩增体系中加入与模板等量的含有纯合型低含油量表型等位基因Sinac1基因组DNA（即AA型模板）作为对照；
第二次HRM PCR扩增后：
若样本扩增出现峰线，则待检样本为CC型（与对照的低含油量基因型不一致），判定待检样本为纯合高油型（CC型）；
若样本扩增后仍为平滑线，则表示待检样本与对照基因组的基因型一致，含有SNP等位位点A，判定待检样本为纯合低油型（AA型）；
具体检测用引物对设计如下：
SiOC1F1：5’-AGAAATGCAAAATTGGATCC-3’，
SiOC1R1：5’-ACCCTTGTAGAAAACAAGAGTC-3’。
（二）HRM PCR扩增
分别提取所随机选择的25份高含油量型和25份低含油量型芝麻种质基因组DNA，以此作为模板，利用步骤（一）中所设计引物对进行PCR扩增；
PCR扩增时，反应体系参考设置如下：
模板DNA (50ng/µL) ，1.0 µL；
2 × Phanta Max Buffer，12.5 µL；
Forward Primer (10µM)，1.0 µL；
Reverse Primer (10µM)，1.0 µL；
dNTP Mix (10 mM each)，0.5 µL；
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.5 µL；
EvaGreen (20× in water)，1.25 µL；
加ddH2O 至总体积25µL；
PCR反应程序（LightCycler 480 Ⅱ荧光定量仪，美国Roche公司产品）参考为：95℃预变性5min，之后95℃变性10s，56℃复性10s，72℃延伸10s，循环40次，最后进行基因分型（Gene Scanning）分析。部分基因分型结果如图4所示。
将HRM PCR分析结果与不同种质含油量表型结果进行对照统计，结果如下表3所示。
表3，测试样本表型与HRM PCR结果一致性比较
/>
续表3：
注：表中“/”指没有表型数据。
统计结果表明：表型为高含油量型的25份种质中，扩增结果均显示为CC型（高含油量基因型）；表型为低含油量型的25份种质中，有23份种质扩增显示为AA型（低含油量基因型），2份种质为CC型（高含油量基因型），总体准确度为96%。这一结果表明，所设计的检测引物对SiOC1F1/R1可较好用于芝麻含油量表型的早期筛选、以及用于分子辅助育种。
实施例4
为进一步明确SiNAC1基因的潜在应用前景，基于基因工程转化技术，以拟南芥为转化目标，发明人将克隆所得SiNAC1基因转化进入了拟南芥基因组，相关过程简要介绍如下。
（一）构建重组载体
以pFGC5941质粒为载体，参考前述SiNAC1基因克隆操作及现有分子克隆技术，采用同源重组的方法，将SiNAC1基因与pFGC5941质粒进行连接以获得可以过表达SiNAC1基因的重组载体。具体过程也可参考如下。
首先，设计PCR扩增用引物对如下：
F: 5’-TTACATTTACAATTACCATGAGCATATCTGTGAATGGACAA-3’，
R: 5’-CTCTAGACTCACCTAGGATCCCTATACGGAAACATCGGATAAATGG-3’。
随后，以cDNA（豫芝11号）为模板进行PCR扩增，50µl扩增体系参考为：
2×Phanta Max Buffer，25µL；
dNTP Mix (10 mM each)，1µL；
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1µL；
Primer-F，2 µL；
Primer-R，2 µL；
cDNA模板，1µL；
ddH2O，18 µL；
扩增程序：98℃预变性3min；之后98℃变性15s，58℃复性15s，72℃延伸70s，循环35次；最后72℃延伸10min。
再后，分别对上述酶切产物和pFGC5941质粒进行NcoI、BamHI双酶切 (37℃、30min)；对酶切产物纯化回收后，利用同源重组的方法进行连接；具体重组操作（利用诺唯赞的One Step Cloning Kit Cat）体系如下：
5×CE ⅡBuffer，4 μl；
Exnase Ⅱ，2 μl；
酶切回收的线性化载体，0.02×10000 bp=200 ng；
插入片段（PCR产物），0.04×1439 bp=58 ng；
ddH2O加至 20 μl；
反应体系混匀离心后37℃温育20 min。
最后，取上述5 μl重组载体连接产物加入到50 μl DH5a感受态细胞中，混匀后冰上静置25 min，42℃热激45s迅速放冰上2 min，加700 μl未加任何抗生素的LB培养基37℃振荡培养1 h，取100 μl涂布在含有卡那霉素的LB平板；过夜培养后挑取阳性克隆接种于5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，提取质粒并进行测序，确保重组质粒构建正确。
（二）遗传转化
将步骤（一）所得重组载体转化农杆菌，并制备转染液。随后，采用花序侵染的方法，将SiNAC1重组进入拟南芥的遗传组中。具体操作可参考如下。
首先，将步骤（一）中重组正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，具体操作参考为：取1μg重组质粒加入50 μl 感受态细胞中，混匀后冰上静置5 min再依次液氮5min、37℃热激5min，再迅速放冰上5 min；加700 μl未加任何抗生素的LB培养基37℃振荡培养2 h后涂布含有50mg/l 利福平、50mg/L卡那霉素的LB平板，培养两天后并进行菌落PCR检测，并挑选阳性菌落扩增应用（拟南芥转化前三天进行菌株扩增）。
随后，将扩增后农杆菌液转入离心管中，室温条件下，6000rpm/min离心10分钟，弃上清；并将沉淀用浸染液（5%蔗糖，1/2MS，200ul/L silwet77，PH5.8）重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），此即为转化用侵染液。
最后，选取初果期的健壮植株，将其整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒（叶片尽量不与浸染液接触）；浸染结束后，用保鲜膜包裹植株花絮，横放于暗箱中培养约24小时后正常培养；转化20天后收获种子并保存备用。
（三）检测、筛选
对转化后拟南芥进一步抗性培育筛选，对抗性筛选所得阳性转化植株（芝麻含油量基因SiNAC1过表达植株）进行PCR初步检测，获得正确的转化植株（部分检测结果如图6所示，筛选时，SiNAC1基因扩增产物为1131bp；抗性筛选基因bar扩增产物为430bp）。具体阳性植株筛选方法参考如下。
取转化后的拟南芥种子，灭菌后平铺于MS培养基（含15mg/L的草铵膦），培养箱培养10天后将正常生长的植株移栽至土壤培养；植株长大后提取DNA进行PCR鉴定；PCR鉴定用引物对参考如下：
NAC1 Primer F：5’-ATGAGCATATCTGTGAATGGACAA-3’，
NAC1 Primer R：5’-CTATACGGAAACATCGGATAAATGG-3’；
扩增产物大小1439bp；
BlpR-F: 5’-AGAAACCCACGTCATGCCAG-3’，
BlpR-R: 5’-GTCTGCACCATCGTCAACCA-3’；
产物大小430bp。
需要解释的是，未详细说明的相关操作参考现有分子克隆、基因工程等常规操作即可，不再赘述。
进一步地，对初步筛选所得阳性拟南芥转化植株中SiNAC1基因表达情况进行RT-PCR检测（结果如图7所示）。检测时，以AtTublin为内参基因，以非转基因拟南芥野生型（WT）材料为对照。SiNAC1表达量=2^-（（CT SiNAC1 -CT AtTublin ）-（CT SiNAC1wt -CT AtTublinwt ））。
检测结果表明，在筛选所得的阳性拟南芥转化植株中成功检测到了SiNAC1基因的表达。进一步地，对获得的阳性转基因株系进行了加代。
对获得的27株T2代单株进行了种植和籽粒收集。对所收集籽粒，参照魏利斌等（2016）核磁共振检测方法（魏利斌等，芝麻籽粒脂肪含量核磁共振无损快速测定方法的建立，江苏农业科学，2016），进行了拟南芥籽粒含油量标准曲线构建和含油量表型检测（结果如图8所示）。
分析可以看出：与野生型（WT）（平均含油量为24.75%）相比，SiNAC基因超表达后转基因拟南芥株系的平均含油量达到了26.72%，较野生型提高了7.96%，含油增加量达到了极显著（p<0.01)的统计水平。这一结果表明SiNAC1基因的过表达可以有效促进拟南芥籽粒中油脂合成与积累。而基于这一结果，也表明SiNAC1基因在油料作物含油量调控、新品种培育中具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一个芝麻含油量调控基因SiNAC1，其特征在于，该基因位于芝麻第10条染色体上，属于正调控基因，对含油量性状的解释率最高为43.8%；该基因长度为1439bp，包含3个外显子和2个内含子，其碱基序列如SEQ ID No.1所示；
所述芝麻含油量调控基因SiNAC1所对应的cDNA，该cDNA序列长度为1131bp，可编码376个氨基酸；具体为：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCACAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
2.权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC1所编码蛋白，其特征在于，包括376个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC1所对应的低含油量表型等位基因Sinac1，其特征在于，相较于正调控基因SiNAC1序列，该低含油量型gDNA序列发生有1个SNP变异；该基因长度为1439bp，包含3个外显子和2个内含子；碱基序列如SEQ ID No.3所示；
所述等位基因Sinac1所对应cDNA，序列长度为1131bp，可编码376个氨基酸；具体如下：
ATGAGCATATCTGTGAATGGACAATCTCAAGTGCCTCCTGGCTTCAGATTTCATCCCACTGAAGAGGAGCTGTTACAGTATTACCTGAAGAAGAAGGTTGCTTCAGAGAAGATTGATTTGGATGTAATTCAAGATGTGGATCTCAACAAGCTTGAGCCCTGGGACATACAAGAGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCAAAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGTCGTGCCCCTCGTGGCCAAAAATCCGATTGGATAATGCACGAATACAGACTGGATGACAACACTACTGCTACTATTACCCATACAAATAATCATGGAAGCAACGCCATGGGAGAAGGAATGCAAGAAGAGGGCTGGGTGGTTTGTCGAGTGTTTAAGAAGAAAAATCACAGCCACAAGACACTGGACACTACTCCTATCATCAGCTCTTCTTGGTCAATGATCACTACCATAAATTCTTGTAATGAAGGAACTTTAGAACAAATGCTACAGTCGATTGGCACCCCATTTAGAAGAAATCACTTCCCTGATGCTGATAACAACAGACGATTCTTGAAACTACCGAACCTGCACGATAGCCCCAACTCGTCATCCCGCACCCAAAATTGCTACCAATCGCTTCACGTGCAAATGCTTGGCCAAGAGATCGCAGACCCTGGATCCATCAATCAGTCAGAAACCAGCATTGGGGTTCATGATTGGGCAGCTCTCGACAGGCTCGTGGCATCACAACTCAACGGCCACAATGAGGCTTCCAAACAGCTCTCAAGTACTTTCAATCATGATGATGATTCCGGAATGAGCACTTTTTGTTGCCCAGCTGATGATGATCAATTGGTTCAGCTACCGCAACAGAGATTGTCATCTTCATCTTCAACTAGACCCTACGGTACGGCTACTCACGATTATCAAAATGAATGTGATCTTTGGAGCTTTGCCAGATCGTCTAACGATCAGCTGTGCCATTTATCCGATGTTTCCGTATAG。
4.权利要求2所述等位基因所编码蛋白，其特征在于，与高含油量型基因SiNAC1的cDNA所编码氨基酸序列的不同点在于，低含油量型基因cDNA序列所编码的第82氨基酸由T变为K； 包括376个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
5.PCR扩增制备权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC11时或权利要求3所述等位基因Sinac1的PCR扩增用引物对，其特征在于，具体设计为：
正向引物NAC1 Primer F：5’-ATGAGCATATCTGTGAATGGACAA-3’，
反向引物NAC1 Primer R：5’-CTATACGGAAACATCGGATAAATGG-3’。
6.利用所述权利5所述PCR扩增用引物对制备获得权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC11时或权利要求3所述等位基因Sinac1的PCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取制备基因组DNA模板
提取高含油量型芝麻种质或低含油量型芝麻种质的基因组DNA，以此作为PCR扩增用模板；
所述高含油量型芝麻种质，具体品种为豫芝11号；
所述低含油量型芝麻种质，具体品种为“树勋新富白”；
（2）PCR扩增
以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，利用PCR扩增用引物对，进行PCR扩增；
扩增产物的序列扩增长度为1439bp。
7.针对权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC1或其所对应的低含油量表型等位基因Sinac1的PCR检测用引物对，其特征在于，具体设计为：
SiOC1 F1：5’-AGAAATGCAAAATTGGATCC-3’；
SiOC1 R1：5’-ACCCTTGTAGAAAACAAGAGTC-3’；
扩增产物长度为192bp，具体扩增序列如下：
AGAAATGCAAAATTGGATCCACTCCACAGAATGATTGGTATTTCTTCAGTCACAAAGACAAAAAATACCCCAAAGGGACTTGCACTAATCGCGCCACTGCTTCCGGATTCTGGAAGGCCACAGGGCGTGACAAAGTGATCTATGGTAATTCGAGACGAATTGGAATGAGGAAGACTCTTGTTTTCTACAAGGGT。
8.利用权利要求7所述PCR检测用引物对的芝麻含油量表型的检测判定方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）提取基因组DNA
提取待测芝麻种质的基因组DNA；
（二）HRM PCR检测
以步骤（一）所提取制备的基因组DNA为模板，利用PCR检测用引物对进行HRM PCR扩增；
（三）结果判定
需要说明的是，结果判定过程中所涉及的SNP标记位点属于C/A突变；
结果判定时，根据待检样本与对照样本的HRM PCR扩增结果，判定待检样本为高油含量基因型或者低油含量基因型；
若待检样本出现峰线，则待检样本为C/A型，判定为杂合型；
若待检样本为平滑线，则测定样本为CC或AA纯合型；进一步地，区分纯合型待检样本究竟为CC型还是AA型，对待检样进行第二次HRM PCR，HRM PCR扩增前，在PCR扩增体系中加入与模板等量的含有纯合型低含油量表型等位基因Sinac1基因组DNA作为对照；
第二次HRM PCR扩增后：
若样本扩增出现峰线，则待检样本为CC型，判定待检样本为纯合高油型CC型；
若样本扩增后仍为平滑线，则表示待检样本与对照基因组的基因型一致，含有SNP等位位点A，判定待检样本为纯合低油型AA型。
9.权利要求1所述芝麻含油量调控基因SiNAC1在植物品种培育中的应用，其特征在于，通过对基因SiNAC1进行超表达方式，用于培育高含油量作物新品种。
10.如权利要求9所述芝麻含油量调控基因SiNAC1在植物品种培育中的应用，其特征在于，所述作物具体为芝麻或拟南芥。
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