CN116463306A - 莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了莽草酸脱氢酶突变体，该突变体具有较高的催化3‑脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性并降低了其催化莽草酸逆向生成3‑脱氢莽草酸的活性，将该突变体用于微生物发酵生产莽草酸，不仅可以强化大肠杆菌莽草酸脱氢酶催化3‑脱氢莽草酸生产莽草酸的代谢流，同时还降低了逆反应莽草酸到3‑脱氢莽草酸的转化，从而提高了莽草酸的产量并减少了产物中的杂质，实现大肠杆菌高效生产莽草酸。
Description
技术领域
本发明涉及莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
莽草酸（Shikimic Acid，SA），化学名为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，分子式为C7H10O5，相对分子质量为174.15，是一种环己烷的羟基化不饱和酸衍生物。作为一种小分子有机酸，莽草酸在自然界中广泛存在。它不仅是微生物和植物合成叶酸、泛醌、维生素K2和芳香族氨基酸等芳香族化合物的中间体，也是工业生产中用于生产各种酚类、生物碱化合物及手性药物的关键原料。研究表明，莽草酸具有多种药用价值，莽草酸及其衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗血栓、抗炎镇痛等多种生物活性。罗氏制药开发的用于治疗和预防禽流感的药物——磷酸奥司他韦（商品名：达菲）就是以莽草酸为主要原料生产的。
常规的莽草酸生产主要从八角茴香等植物中提取，除受产地、气候等原料供给的影响，从植物中提取莽草酸步骤繁多、提取工艺复杂、纯度不高，不能满足工业上对莽草酸的大量需求。
化学法合成莽草酸主要有Diels-Alder反应法、逆Diels-Alder反应法以及奎宁酸转化法等，它们虽然在产率及纯度上较植物提取法有明显的优势，但同样受限于原料供给、步骤复杂、反应条件苛刻、环境污染等问题。
莽草酸途径广泛存在于各类微生物中，利用微生物生产莽草酸具有操作工艺简单、生产周期短、生产成本低、经济效益高、便于大规模生产等优点。目前利用微生物发酵生产莽草酸主要通过构建莽草酸工程菌株实现的。以大肠杆菌莽草酸途径为例，参见附图1，初始底物葡萄糖经糖酵解途径和磷酸戊糖途径分别合成磷酸烯醇式丙酮酸（PhosphoenolPyruvate，PEP）和4-磷酸赤藓糖（Erythrose-4-phosphate，E4P）作为莽草酸合成的前体物质。随后两者缩合反应形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP），进一步转化为3-脱氢奎宁酸（3-Dehydroquinicacid，DHQ），接着脱水反应形成3-脱氢莽草酸（3-Dehydroshikimic acid，DHS）。3-脱氢莽草酸最终在莽草酸脱氢酶（AroE）的作用下消耗NADPH还原为莽草酸现有研究对大肠杆菌莽草酸合成途径的调控通常涉及对葡萄糖转运、中心碳代谢、莽草酸合成上游及下游的多环节改造，虽然大大提高了微生物发酵生产莽草酸的产量，但是却难以克服副产物3-脱氢莽草酸的含量高的问题。
在大肠杆菌莽草酸途径中，莽草酸脱氢酶（AroE）催化的由3-脱氢莽草酸还原生成莽草酸的反应是主要限速步骤之一。由于AroE同时还具有催化莽草酸逆向生成3-脱氢莽草酸的活性，因此该反应是可逆反应。另外，随着发酵产物中莽草酸的积累，AroE还会受到莽草酸的反馈抑制，从而使得该反应向莽草酸的转化率受限。基于以上原因，利用大肠杆菌发酵生产莽草酸时发酵产物通常含有较高量的副产物3-脱氢莽草酸，3-脱氢莽草酸与莽草酸的比例通常在1：10以上。3-脱氢莽草酸与目标产物莽草酸无论是分子量还是物理化学特性均十分接近，这大大提高了莽草酸发酵生产过程中后续提纯与分离的难度，从而导致生成成本难以进一步降低。可见，降低发酵产物中副产物3-脱氢莽草酸的含量，减少产物莽草酸对AroE的反馈抑制，这对微生物发酵大规模生产莽草酸来说是迫切要解决的问题。
现有AroE的最适pH通常在7左右，在此pH条件下，AroE具有较高的催化3-脱氢莽草酸还原为莽草酸的活性，这对大规模发酵生产来说是必需的。但是在该pH条件下，AroE催化莽草酸逆向生成3-脱氢莽草酸的活性并非最低，这使得发酵产物中副产物3-脱氢莽草酸的含量难以得到更好的控制。虽然有研究表明，当降低pH时，AroE催化莽草酸逆向生成3-脱氢莽草酸的活性会受到较多抑制，但是其催化3-脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性也随之降低，这将导致在降低副产物的同时莽草酸的产量产率也受到影响。
另外，AroE之所以受到莽草酸的反馈抑制，来源于其对正向反应底物3-脱氢莽草酸以及逆反应底物莽草酸的特异性结合的竞争。当发酵体系中产物莽草酸积累到较高浓度时，AroE被高浓度的莽草酸结合而无法结合正向反应底物3-脱氢莽草酸而发挥正常的催化功能，进而限制了莽草酸的产量。因此，提高AroE对3-脱氢莽草酸的结合特异性，有望降低这种产物反馈抑制的发生。
综上所述，希望找到一种更理想的AroE，其在一定条件下具有较高的催化3-脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性以及较低的催化莽草酸逆向生成3-脱氢莽草酸的活性，并且其对3-脱氢莽草酸具有较高的结合特异性，从而增加莽草酸的积累并降低产物中杂质的含量。
发明内容
为解决现有的大肠杆菌莽草酸生产工程菌株3-脱氢莽草酸转化为莽草酸的转化率低，不适用于工业化生产等缺陷，提供一种莽草酸脱氢酶AroE突变体及利用其发酵生产莽草酸的方法。通过对大肠杆菌野生型莽草酸脱氢酶AroE中重要的氨基酸位点进行突变，改变其最适pH及对3-脱氢莽草酸的底物结合特异性，从而提高由3-脱氢莽草酸生成莽草酸的正反应生成率，并降低副产物3-脱氢莽草酸的含量。通过在生产莽草酸的大肠杆菌工程菌株中过表达所述莽草酸脱氢酶突变体，可强化大肠杆菌莽草酸脱氢酶催化3-脱氢莽草酸生产莽草酸的代谢流，实现莽草酸的高效生产并显著降低副产物3-脱氢莽草酸的含量。
本发明提供莽草酸脱氢酶突变体，所述突变体以SEQ ID NO：1所示氨基酸序列为基础，对其进行选自如下突变位点的突变：N59、D102、Q244，以降低莽草酸脱氢酶的最适pH，所述突变为上述突变位点中的一个或任意组合。
优选的，所述突变可选自N59D、D102N、Q244E。
本发明还提供一种莽草酸脱氢酶突变体，在上述突变的基础上进一步进行选自如下突变点的突变： T61、K65、N86，以提高莽草酸脱氢酶对3-脱氢莽草酸的底物结合特异性，所述突变为上述突变位点中的一个或任意组合。
所述突变可以选自T61R、T61N、T61D、T61E、K65H、K65N、N86D、N86L、N86W、N86E。
优选的，所述突变选自：D102N和T61R；D102N和T61N；D102N和T61D；D102N和T61E；D102N和K65H；D102N和K65N；D102N和N86D；D102N和N86L；D102N和N86W；D102N和N86E。
本发明还提供编码所述突变体的核酸分子。
本发明还提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
本发明还提供重组微生物，所述重组微生物是将编码所述突变体的核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
本发明还提供所述生物材料或所述重组微生物在莽草酸生产中的应用。
本发明提供使用所述莽草酸脱氢酶突变体高效生产莽草酸的方法。
本发明还提供一种高效生产莽草酸的方法，其特征在于，利用所述表达莽草酸脱氢酶突变体的大肠杆菌生产菌株进行发酵培养。
本发明所述术语“酶活”包括“莽草酸合成酶活性”和“3-脱氢莽草酸合成酶活性”。
本发明所述术语“莽草酸合成酶活性”是指AroE催化3-脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性。
本发明所述术语“3-脱氢莽草酸合成酶活性”是指AroE催化莽草酸逆向生成3-脱氢莽草酸的活性。
附图说明
图1为大肠杆菌的莽草酸途径合成代谢示意图
图2为利用表达野生型莽草酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌株生产莽草酸产量统计
图3为利用表达所述莽草酸脱氢酶突变体的大肠杆菌工程菌株生产莽草酸产量统计
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
实施例1 莽草酸脱氢酶AroE突变体的构建
根据NCBI公布的大肠杆菌Escherichia coli str. K-12 substr. W3110莽草酸脱氢酶AroE（NCBI GenBank ID: APC54135.1）（SEQ ID NO：1）的编码序列，设计引物，扩增得到其编码序列。利用双酶切方法，将aroE连接到pET28b载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序，获得重组表达载体pET28b-aroE。以载体pET28b-aroE为模板，使用N59D、D102N、Q244E对应的突变引物对（如表1所示）分别对aroE基因进行相应位点突变，PCR扩增产物用DpnI 酶切2小时后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序，分别获得相应的莽草酸脱氢酶突变体表达载体pET28b-aroE N59D 、pET28b-aroE D102N 、pET28b-aroE Q244E。提取重组突变体质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得相应的莽草酸脱氢酶突变体重组表达菌株。
表1 aroE基因定点突变引物
实施例2 莽草酸脱氢酶突变体的活性测试
（1）菌株培养：将实施例1构建的突变体重组菌株，接种到LB培养基中，于37℃下振荡培养，当菌液浓度达到OD600为1.0时，加入终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导，25℃诱导培养20h后收集菌体。
（2）菌体裂解：收集的菌体中加入无菌水重悬菌体并于4℃离心除去上清，重复2次。加入裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH 8.0）充分悬浮菌体。低温超高压破碎菌体，4℃离心收集上清液。
（3）酶活测定：上清液中的突变体蛋白用Ni-NTA纯化后分别使用反应液1测定以3-脱氢莽草酸为底物还原生成莽草酸的反应活性（莽草酸合成酶活性），使用反应液2测定以莽草酸为底物逆向生成3-脱氢莽草酸的反应活性（3-脱氢莽草酸合成酶活性）。
反应液1组成为：Tris-HCL 100 mM、NADPH 10 mM、3-脱氢莽草酸 20 mM、硫酸镁5mM。反应条件为：35℃、pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。
反应液2组成为：Tris-HCL 100 mM、NADP 10 mM、莽草酸 20 mM、硫酸镁5 mM，反应条件为35℃、pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。
用HPLC法测定3-脱氢莽草酸及莽草酸含量。
结果如表2所示，与野生型相比，突变体AroED102N最适pH降低为6.5。在pH为6.5时，该突变体催化3-脱氢莽草酸还原生成莽草酸的酶活性为600 IU，而逆反应催化莽草酸生成3-脱氢莽草酸的酶活性仅为2 IU。
由上述结果可以看出，通过对野生型AroE的第102位氨基酸进行突变，得到的AroED102N最适pH由7.0降低为6.5，在此pH条件下，所述突变体不仅3-脱氢莽草酸合成酶活性得到了很好的抑制，其莽草酸合成酶活性也保持在较高水平。
表2 莽草酸脱氢酶AroE突变体酶活
实施例3 莽草酸脱氢酶AroE突变体的进一步改造
参照实施例1的构建方法，以载体pET28b-aroE D102N为模板，在突变体AroED102N基础上针对AroE的底物结合相关位点，进一步进行改变底物结合特异性的突变。所用引物如表1所示，分别获得莽草酸脱氢酶突变体表达载体pET28b-aroE D102N，T61R 、pET28b-aroE D102N，T61N 、pET28b-aroE D102N，T61D 、pET28b-aroE D102N，T61E 、pET28b-aroE D102N，K65H 、pET28b-aroE D102N，K65N 、pET28b-aroE D102N，N86D 、pET28b-aroE D102N，N86L 、pET28b-aroE D102N，N86W 、pET28b-aroE D102N，N86E。将上述载体质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得突变体AroED102N，T61R、AroED102N，T61N、AroED102N，T61D、AroED102N，T61E、AroED102N，K65H、AroED102N，K65N、AroED102N，N86D、AroED102N，N86L、AroED102N，N86W、AroED102N，N86E重组表达菌株。
实施例4 进一步改造后的莽草酸脱氢酶突变体的活性测试
参照实施例2的方法培养所述突变体重组菌株，得到的突变体蛋白用Ni-NTA纯化后，分别使用反应液1测定以3-脱氢莽草酸为底物生成莽草酸的反应活性（莽草酸合成酶活性），使用反应液2测定以莽草酸为底物逆向生成3-脱氢莽草酸的反应活性（3-脱氢莽草酸合成酶活性）。
反应液1组成为：Tris-HCL 100 mM、NADPH 10 mM、3-脱氢莽草酸 20 mM、硫酸镁5mM。反应条件为35℃、pH 6.5。
反应液2组成为：Tris-HCL 100 mM、NADP 10 mM、莽草酸 20 mM、硫酸镁5 mM。反应条件为35℃、pH 6.5。
用HPLC法测定3-脱氢莽草酸及莽草酸含量，结果如表3所示。可以看出，突变体AroED102N，N86D 3-脱氢莽草酸合成莽草酸的酶活性为700 IU，而由莽草酸合成3-脱氢莽草酸的酶活性仅为0.5 IU，莽草酸合成酶活性/3-脱氢莽草酸合成酶活性比值为1400，远高于野生型AroE及突变体AroED102N。
上述结果充分说明，所述突变体AroED102N，N86D实现了在最适pH6.5的条件下，不仅提高了莽草酸合成酶活性，还大大抑制了3-脱氢莽草酸合成酶活性。
表3 莽草酸脱氢酶AroE突变体酶活
实施例5 利用莽草酸脱氢酶突变体AroED102N，N86D生产莽草酸
（1）按照参考文献（Knop DR, Draths KM, Chandran SS, Barker JL, vonDaeniken R, Weber W, Frost JW. Hydroaromatic equilibration duringbiosynthesis of shikimic acid. J Am Chem Soc. 2001 Oct 24;123(42):10173-10182. doi: 10.1021/ja0109444.）中所记载的工程菌株SP1.1的构建方法，以大肠杆菌W3110代替所述文献中的大肠杆菌RB791作为起始菌株，构建生产莽草酸的大肠杆菌工程菌株。
（2）将携带有野生型以及突变体AroE编码基因的质粒pET28b-aroE和pET28b-aroE D102N，N86D分别转入步骤（1）所构建的生产莽草酸的大肠杆菌工程菌株，将获得的重组菌株分别在含有卡那霉素的LB固体平板中划线，37℃过夜培养。
（3）第二天挑取单克隆接种至30mL TB液体培养基中，220rpm 37℃培养至OD600为1.5-2，获得一级种子。
（4）将2 mL一级种子接种至200mL TB液体培养基中，220rpm 37℃培养至OD600为2-3，获得二级种子。
（5）将二级种子转接到含有2L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养。所述发酵培养基组成为：一水葡萄糖 20g/L、酵母粉6g/L、玉米浆干粉10g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾 2g/L、一水柠檬酸3g/L、七水硫酸镁1.6g/L、六水氯化钴2mg/L、七水硫酸锌3mg/L、七水硫酸亚铁70.0mg/L、一水硫酸锰10mg/L、氯化钙6mg/L、 五水硫酸铜6mg/L、维生素H 0.6mg/L、维生素B1 0.2mg/L。发酵条件为：37℃、pH 6.5（用氨水调节控制）、溶氧20%。
（6）菌株生长到OD600=25时，加入0.2 mM IPTG。定时取样HPLC分析莽草酸及3-脱氢莽草酸生成。
结果见图2和图3，50小时时，突变体AroED102N，N86D莽草酸产量为94g/L（图3），是相同发酵条件下野生型AroE对照的产量63 g/L （图2）的1.5倍。最重要的是，发酵产物中3-脱氢莽草酸含量由野生型的7.9g/L显著降低到1.0g/L，这使得产物中3-脱氢莽草酸/莽草酸的比值降至非常低的水平，大大降低了产物分离和提纯的难度和成本。
可见，本发明成功地提供突变体AroED102N，N86D，不仅提高了莽草酸合成酶活性还大大抑制了3-脱氢莽草酸合成酶活性。利用所述突变体发酵生产莽草酸，在提高莽草酸产量的同时，显著降低了作为杂质的逆反应产物3-脱氢莽草酸的含量，从而降低生成和后续分离纯化的难度和成本，实现了莽草酸的高效生产。
Claims (10)
1.莽草酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为基础，对其进行如下位点的突变： D102。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变为D102N。
3.如权利要求1或2任一项所述的突变体，其特征在于，还包括选自如下位点的突变：T61、K65、N86。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变选自：T61R、T61N、T61D、T61E、K65H、K65N、N86D、N86L、N86W、N86E。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变选自：D102N和T61R；D102N和T61N；D102N和T61D；D102N和T61E；D102N和K65H；D102N和K65N；D102N和N86D；D102N和N86L；D102N和N86W；D102N和N86E。
6.编码权利要求1-5任一项所述突变体的核酸分子。
7.含有权利要求6所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
8.重组微生物，其特征在于，所述重组微生物是将权利要求6所述核酸分子通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
9.权利要求1-5任一所述突变体或权利要求6所述核酸分子或权利要求7所述生物材料或权利要求8所述重组微生物在莽草酸生产中的应用。
10.一种莽草酸的生产方法，其特征在于，使用权利要求1-5任一所述莽草酸脱氢酶突变体。
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