CN116459271B - Dna四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了DNA四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途，属于生物医药技术领域。本发明研究表明tFNAs具有优异的细胞摄取能力，能够通过降低Notch信号通路的表达促进毛囊干细胞的增殖与迁移，同时促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化，恢复受损毛囊，增加毛囊数量，达到生发的效果。tFNAs可以制备预防和/或治疗脱发的药物，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及DNA四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途。
背景技术
随时人们生活、饮食习惯的改变以及压力的增加，脱发已经成为十分普通的问题，且日益年轻化。脱发也成为现代年轻人焦虑的原因之一。现代病理性研究表明脱发原因有内分泌失调紊乱，长期处于精神紧绷压力大的状态，营养不良，长期染烫头发等等。预防脱发和生发的产品逐渐受到广大消费者的喜好。但是，现有脱发产品和药物大多效果不理想，而植发的费用高，大众接受度不高。因此，研究一种预防和治疗脱发的药物十分有必要。
毛囊干细胞(HFSCs)是一种位于毛囊隆突部(bulge)，且具有多向分化潜力的干细胞。其中可以分化为毛囊细胞，通过WNT信号通路来共同控制头发的颜色和头发的生长。因此促进毛囊干细胞分化为毛囊细胞有望成功预防和治疗脱发，达到生发的目的。
DNA四面体，又称四面体框架核酸(tFNAs)，是由DNA单链(通常为4条)通过碱基互补配对而得，从二维结构上看，原先的DNA单链变为螺旋双链，从三维结构上看，形成四面体结构。DNA四面体比单链DNA或普通线性双链DNA更稳定，因此可用于合成生物体内检测探针，或者充当某些核酸药物的载体。目前尚无DNA四面体用于预防和/或治疗脱发的报道。
发明内容
本发明的目的是提供DNA四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途。
本发明提供了DNA四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途。
进一步地，所述DNA四面体是由序列如SEQ ID NO.1～4所述DNA单链通过碱基互补配对形成的DNA四面体。
进一步地，所述序列如SEQ ID NO.1～4所述的四条DNA单链的摩尔比为1:1:1:1。
进一步地，所述DNA四面体的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于85～105℃下维持5～15min，然后于2～8℃下维持20～30min。
进一步地，所述DNA四面体的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于95℃下维持10min，然后于4℃下维持20min。
进一步地，所述药物为生发的药物。
进一步地，所述药物为恢复受损毛囊、增加毛囊数量的药物。
进一步地，所述药物是以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述制剂为经皮给药制剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗脱发的药物，它是以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂；
所述DNA四面体是由序列如SEQ ID NO.1～4所述DNA单链通过碱基互补配对形成的DNA四面体；
优选地，所述制剂为经皮给药制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明研究表明tFNAs具有优异的细胞摄取能力，能够通过降低Notch信号通路的表达促进毛囊干细胞的增殖与迁移，同时促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化，恢复受损毛囊，增加毛囊数量，达到生发的效果。tFNAs可以制备预防和/或治疗脱发的药物，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为tFNAs的合成及表征结果：A为tFNAs的合成示意图；B为tFNAs的PAGE图像；C为tFNAs的HPCE图像；D为tFNAs的透射电镜图像；E为tFNAs的粒径大小和Zeta(ζ)电位检测结果；F为tFNAs的原子力显微镜图像。
图2为HFSCs的分离及鉴定结果：A为HFSCs的分离操作示意图；B为隆突处干细胞的镜下图；C纯化后HFSCs的镜下图；D为HFSCs使用免疫荧光鉴定结果；其中，蓝色为细胞核；绿色为细胞骨架；红色为CD34、Nestin或CK15。
图3为tFNAs对HFSCs活力的调节：A为tFNAs和ssDNA在6h后入胞的共聚焦显微镜图像；其中，红色为tFNAs或ssDNA；蓝色为细胞核；绿色为细胞骨架；B为tFNAs和ssDNA与HFSCs培养6小时后细胞的摄取情况的流式细胞术结果；其中，紫色为tFNAs；橙色为ssDNA；蓝色为对照组；C为不同浓度tFNAs对HFSCs增殖的影响；D为通过Transwell检测tFNAs对HFSCs迁移的影响结果；E为使用流式细胞术测定各组细胞周期的结果。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4为tFNAs对HFSCs增殖和迁移信号通路的影响结果：A为免疫荧光染色的Hes1、HEY1和Notch蛋白质表达水平；其中，红色为Hes1、HEY1或Notch1；蓝色为细胞核；绿色为细胞骨架；B为WB检测的Hes1、HEY1和Notch1蛋白质表达水平及通过ImageJ计算的蛋白的WB相对定量(n＝3)。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5为tFNAs对HFSCs分化信号通路的影响结果：A为免疫荧光染色的Lhx2、GSK-3β、LEF1和Cyclin D1蛋白质表达水平；其中，红色为Lhx2、GSK-3β、LEF1或Cyclin D1；蓝色为细胞核；绿色为细胞骨架；B和C为WB检测的Lhx2、GSK-3β、LEF1和Cyclin D1蛋白质表达水平及通过ImageJ计算的蛋白的WB相对定量(n＝3)，B为培养3天，C为培养7天。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6为tFNAs对雄性脱发小鼠的毛囊的恢复作用结果：A为tFNAs的透皮作用；其中，红色为Cy5-tFNAs；蓝色为DAPI；B为小鼠背部皮肤全层HE染色结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明DNA四面体(tFNAs)的合成及表征
1、tFNAs的合成
本发明DNA四面体(tFNAs)的合成示意图如图1A所示。将等摩尔量的四条单链DNA(S1、S2、S3、S4；具体序列如表1所示)溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH＝8.0)中，四条单链DNA的终浓度均为1000nM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即自组装合成得到DNA四面体(tFNAs)。
表1.本发明四条DNA单链的具体序列
2、tFNAs的表征
(1)表征方法
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效毛细管电泳(HPCE)、透射电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)验证tFNAs是否成功合成以及tFNAs的大小和形状。动态光散射DLS(Nano ZS,Malvern,England)用于测量tFNAs的粒径和Zeta电位。
(2)表征结果
tFNAs由四条等摩尔量的ssDNA自组装形成，PAGE结果显示tFNAs成功合成(图1B)，HPCE结果也验证tFNAs由四条ssDNA单链组成(图1C)。
此外，通过DLS检测也证实了tFNAs的成功合成。由图1E可知tFNAs的大小为10.02±1.605nm，Zeta(ζ)电位为-6.67mV。
AFM图像(图1F)和TEM图像(图1D)显示tFNAs约为20nm，并且通过TEM观察到三角形结构。
上述表征结果表明本发明成功制备得到tFNAs。
以下通过具体实验例证明本发明的有益效果。
除另有说明外，实验例中使用的tFNAs均为按照实施例1所述方法制备的tFNAs。
实验例1、HFSCs的分离及鉴定
1、实验方法
本发明从SD大鼠胡须垫提取毛囊干细胞(HFSCs)并纯化鉴定。HFSCs的分离提取方法如图2A所示：将胡须垫整个剪下并用碘伏消毒5分钟后，再用10％双抗溶液漂洗三次，每次10分钟。在体式显微镜下，用显微镊将单个毛囊取出，显微剪剪下中间1/3包含隆突部。37℃下，将剪下的包含隆突部的毛囊用0.25g/L中性酶II消化1小时后，再用0.25％胰酶消化10分钟，收集细胞过筛培养。此外，通过共聚焦显微镜(N-SIM，Nikon，Tokyo，Japan)获得免疫荧光染色的HFSCs表面标记物的图像。
2、实验结果
图2A展示了HFSCs提取过程示意图。隆突处干细胞提取后镜下可见多角形细胞以及少量的成纤维细胞(图2B)。纯化后HFSCs镜下呈现多形性，既有角质形细胞，又有多角形细胞及分叉形细胞(图2C)。免疫荧光染色显示纯化后的细胞高表达Nestin、CD34，且低表达K15(图2D)。表明HFSCs分离成功且纯化成功。
实验例2、tFNAs对HFSCs活力的调节
1、实验方法
1.1为了检查tFNAs的细胞进入性能，首先用Cy5标记S1单链DNA(ssDNA)，然后按照实施例1所述的方法，利用Cy5标记的S1单链DNA以及S2-S4单链DNA制备Cy5标记的tFNAs。待HFSCs生长至对数期，分别加入含tFNAs或ssDNA的培养基(tFNAs或ssDNA浓度为250nM)处理HFSCs 6小时。然后收集细胞并用PBS冲洗3次。最终，通过流式细胞仪(CytoFLEX，BeckmanCoulter Inc.，Brea，USA)获得具有荧光Cy5的细胞占所有细胞的比例。此外，通过共聚焦显微镜(N-SIM，Nikon，Tokyo，Japan)获得了Cy5标记的tFNAs和ssDNA分散在细胞中的图像。以纯细胞为对照组(Control)。
1.2HFSCs处理后的细胞活力
细胞活力采用CCK-8检测法：HFSCs在含Defined K-SFM培养基、10％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，USA)和1％青霉素-链霉素溶液(HyClone，Logan，USA)的培养基中培养。实验组培养基中含有不同浓度的实施例1制备的tFNAs(62.5nM、125nM、250nM、375nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养24h和48h小时后，加入10％ CCK-8溶液(KeyGEN Biotech)37℃培养1小时。通过450nm处的OD值测量细胞活力。
1.3Transwell实验
通过Transwell检测tFNAs对HFSCs迁移的影响：待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105个/ml。然后在Transwell小室顶部加200μL含有125nM或250nM tFNAs的细胞悬浮液，Control组细胞悬浮液中不加tFNAs；在底部加750μL含10％胎牛血清的DMEM(每组设3个重复孔)，继续在孵箱培养24h和48h。用结晶紫染色，镜检，并计算PET膜下表面的细胞数，计算中间和四周5个视野，取平均值。
1.4细胞周期测定
流式细胞仪检测细胞周期，将HFSCs接种在6孔板上。实验组培养基中含有tFNAs(250nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养24h后，用不含EDTA胰蛋白酶消化细胞，并用PBS洗涤两次。进行PI染色，通过流式细胞仪检测细胞周期(Millipore Guava,MA,USA)。
2、实验结果
本发明使用流式细胞术和共聚焦显微镜检验了Cy5标记的tFNAs和ssDNA进入HFSCs的情况，根据流式细胞术的结果(图3B)，可检测到tFNAs入胞率高达97.6％，而ssDNA入胞率仅为8.59％，说明tFNAs具有出色的入胞性能，这是其最显著的优势之一。从激光共聚焦显微镜的图像(图3A)中可以得到类似的结果，Cy5标记的tFNAs广泛分布在细胞的细胞质中。
其次，本发明进行了细胞活力测定，以确保tFNAs的生物安全性，这是用于细胞实验的前提。如图3C所示，tFNAs组促进了HFSCs的活力，该结果证实了tFNAs良好的生物安全性。值得注意的是，tFNAs对细胞活力的促进呈现出一定的浓度剂量依赖性。具体而言，当tFNAs浓度为250nM，细胞活力最佳。
本发明还测定了不同浓度药物处理后细胞的迁移结果以及tFNAs对细胞周期的影响。如图3D和3E所示，tFNAs与对照组相比可以明显增加细胞迁移，并促进G2-M周期细胞比例增多。
实验例3、tFNAs对HFSCs增殖和迁移信号通路的影响
1、实验方法
1.1蛋白质印迹分析
取处于对数生长期的HFSCs进行培养，实验组培养基中含有tFNAs(250nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养24h后，用PBS冲洗细胞并用蛋白质提取试剂(KeyGenBiotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的蛋白质与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗Hes1一抗(1:1000；Abcam，英国剑桥)、抗HEY1一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗Notch1一抗(1:1000；CST，美国波士顿)和抗GAPDH一抗(1:1000；CST，美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime，上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
1.2免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。按照“1.1蛋白质印迹分析”所述方法培养HFSCs，实验组培养基中含有tFNAs(250nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养24h后，将细胞在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％ Triton X-100处理10分钟。然后，将细胞在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)观察所有细胞。
2、实验结果
由图4可知，与对照组相比，WB检测(图4B)和免疫荧光检测(图4A)都显示tFNAs降低了Hes1、HEY1、Notch1的表达，表明tFNAs降低了Notch信号通路的表达。当Notch信号通路受到抑制时，WNT信号通路就会被激活。WNT信号通路是HFSCs活化的关键信号，Lhx2及其下游的LEF1和Cyclin D1在细胞增殖及其不同谱系及毛囊再生中起着决定性作用。说明tFNAs通过抑制Notch信号通路的表达，可以促进WNT信号通路的激活，进而促进HFSCs的增殖与迁移，促进毛囊再生。
实验例4、tFNAs对HFSCs分化信号通路的影响
1、实验方法
1.1蛋白质印迹分析
取处于对数生长期的HFSCs进行培养，实验组培养基中含有tFNAs(250nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养3d和7d后，用PBS冲洗细胞并用蛋白质提取试剂(KeyGen Biotech，南京，中国)处理以提取蛋白质。然后将纯化的蛋白质与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合并在100℃加热10分钟。目标蛋白通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后，PVDF膜在室温下用封闭液(Beyotime，Shanghai，China)封闭20分钟，并与包括抗Lhx2一抗(1:1000；Abcam，英国剑桥)、抗GSK-3β一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗LEF1一抗(1:1000；CST，美国波士顿)、抗Cyclin D1一抗(1:1000；CST，美国波士顿)和抗GAPDH一抗(1:1000；CST，美国波士顿)在4℃下过夜。用TBST洗涤后，将膜与二抗(1:5000；Beyotime，上海，中国)一起孵育1小时。最后，通过化学发光检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)检测膜上的蛋白质条带。
1.2免疫荧光染色
为进一步观察蛋白表达，进行免疫荧光染色。按照“1.1蛋白质印迹分析”所述方法培养HFSCs，实验组培养基中含有tFNAs(250nM)，对照组(Control)培养基中不含有tFNAs。培养3d和7d后，将细胞在冷的4％多聚甲醛中固定20分钟，随后用0.5％ Triton X-100处理10分钟。然后，将细胞在5％山羊血清中封闭1小时，并与目标一抗在4℃下孵育过夜。第二天冲洗3次后，将样品与二抗(1:500；Invitrogen，Carlsbad，USA)一起孵育1小时。然后，细胞核用DAPI染色，细胞骨架用鬼笔环肽染色。最后，使用共焦激光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)观察所有细胞。
2、实验结果
由图5可知，与对照组相比，WB检测(图5B和5C)和免疫荧光检测(图5A)显示tFNAs增强了Lhx2、GSK-3β、LEF1和Cyclin D1的表达，表明tFNAs增强了HFSCs向转运扩增细胞(Transit-amplifying cells，TACs)分化信号通路的表达。在头发生长阶段，HFSCs接收来自真皮(DP)的调节信号并激活形成TAC。TAC是HFSC和分化的终末细胞之间的过渡群体，促进HFSC分化为终末细胞。说明tFNAs对HFSCs分化的调控作用。
实验例5、tFNAs对雄性脱发小鼠的毛囊的恢复作用
1、实验方法
1.1小鼠雄性脱发模型的建立及药物干预
实验小鼠建模及分组：选取6周龄的C57BL/6雄性小鼠，随机分为空白对照组、处理组(双氢睾酮建模组)和tFNAs治疗组。小鼠背部正中皮肤平行脊柱脱毛，面积约2×2cm2。处理组脱毛后于术区每天涂抹双氢睾酮，持续涂抹10天；tFNAs治疗组脱毛后于术区每天等量涂抹双氢睾酮，持续涂抹10天，并且从第10天开始每天涂抹250nM的tFNAs持续10天。每天观察小鼠背部毛发变化，涂抹tFNAs第10天处死小鼠取背部皮肤组织(实验第20天)。tFNAs按照实验例2所述方法使用Cy5标记。
1.2冰冻切片免疫荧光染色
取出组织后，置于4％多聚甲醛中12小时。再在20％蔗糖中4℃过夜。OCT(冰冻包埋剂)包埋组织，-20℃进行冰冻。冰冻切片使用前放湿盒室温1小时复温。用组化笔在组织周围划出范围，以防止此后操作中液体溢出使得组织切片变干。PBS洗去OCT及多聚甲醛，3次，每次10分钟。0.1％TritonX-100打孔30分钟。用PBS洗切片3次，每次10分钟。加山羊血清预封闭抗原，4℃过夜。吸去山羊血清，加入DAPI染色10分钟。滴碳酸盐缓冲甘油于片上，盖盖玻片。用透明指甲油封于盖玻片四周。徕卡多功能扫描仪扫描切片。
1.3皮肤全层HE染色
取出组织经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。切片后常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。苏木素染色5min，自来水冲洗。盐酸乙醇分化30s(提插数下)。自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。置伊红液2min。扫描仪扫描切片。
2、实验结果
图6A表明tFNAs具有优良的透皮效果，皮肤全层免疫荧光染色可见用Cy5荧光基团标记的tFNAs分布于皮肤全层。通过观察小鼠背部毛发变化发现涂抹双氢睾酮建立小鼠雄性脱发模型后经tFNAs涂抹治疗后，病损区毛发明显比双氢睾酮建模组增多。皮肤全层HE染色结果显示(图6B)，双氢睾酮建模后，毛囊数量明显减少，涂抹tFNAs治疗后，可见皮肤全层厚度增厚，毛囊数量较建模组明显增多，也证明tFNAs具有增加毛囊数量和生发的作用。
本发明研究表明tFNAs具有优异的细胞摄取能力，能够通过降低Notch信号通路的表达促进毛囊干细胞的增殖与迁移，同时促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化，恢复受损毛囊，增加毛囊数量，达到生发的效果。tFNAs可以制备预防和/或治疗脱发的药物，具有良好的应用前景。
Claims (7)
1.DNA四面体在制备预防和/或治疗脱发的药物中的用途；
所述DNA四面体是由四条序列如SEQ ID NO.1~4所述DNA单链通过碱基互补配对形成的DNA四面体。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述四条序列如SEQ ID NO.1~4所述DNA单链的摩尔比为1:1:1:1。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于85~105℃下维持5~15min，然后于2~8℃下维持20~30min。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述DNA四面体的制备方法包括以下步骤：将四条DNA单链于95℃下维持10min，然后于4℃下维持20min。
5.根据权利要求1~4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物为生发的药物。
6.根据权利要求1~4任一项所述的用途，其特征在于：所述药物是以DNA四面体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述制剂为经皮给药制剂。
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