CN116456841A - 果糖基转移酶的用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供一种用于减少受试者的果糖摄取的方法；以及相关的组合物。组合物可用于治疗性和非治疗性用途，例如食欲抑制和治疗或预防代谢综合征、肥胖症、非酒精性脂肪肝疾病和便秘。

Description

果糖基转移酶的用途
技术领域
本公开提供涉及向受试者施用分离的果糖基转移酶以便在体内(in vivo)产生低聚果糖(果寡糖)的方法。本公开还涉及减少受试者的果糖摄取的体内方法；涉及减少经受试者蔗糖代谢形成果糖的体内方法；涉及包括分离的果糖基转移酶的营养品组合物；并且包括分离的果糖基转移酶的药物组合物。还提供包括本文所述的分离的果糖基转移酶的食物组合物。组合物可用于治疗病症，例如代谢综合征、肥胖症；和减少受试者的食欲。本文所述的组合物具有治疗和非治疗用途二者的应用。
背景技术
蔗糖是由葡萄糖和果糖单体单位形成的二糖。蔗糖通常被非正式地称为“糖”，反映了完全精制的食糖包括大约99.9％的蔗糖的事实。蔗糖在植物(例如甘蔗和甜菜)中自然地产生。蔗糖通常被添加到食品中，以便增加这种食物的甜度，并且也作为防腐剂。在食品，尤其是烘焙食物中使用蔗糖，通常被认为对满意的“口感”(质地等)是重要的。蔗糖是一种全球年产量为大约数亿吨的主要商品。
一旦被受试者，通常呗哺乳动物受试者消耗，蔗糖通常被酶(例如蔗糖酶、异麦芽糖酶糖苷水解酶和转化酶)代谢成其的组成单体单位(葡萄糖和果糖)，其通常在(例如)十二指肠中发现。由此产生的葡萄糖和果糖单位被迅速地吸收到血流中。蔗糖是产生大约17kJ/g的高能量化合物。
蔗糖的显著热值意味着世界各地的卫生当局推荐限制受试者(例如人)的日常消耗。例如，UK国家卫生局推荐，成年人一天的消耗不应当超过30g糖。对儿童推荐的每日限量更低，为每天大约19-24g。还推荐糖不应当超过每天从食物和饮料所获得总热量的5％。世界各地的其他卫生当局发布了大体类似的指南。例如，美国的美国人膳食指南(DietaryGuidelines for Americans)2015-2020推荐成年人糖摄入量的限制到大约200卡路里(kcal)(ca.50克)。
尽管这些推荐，但典型的每日糖消耗显著地超过了所建议的水平。例如，美国人膳食指南(Dietary Guidelines for Americans)所指出的，美国成年人平均每天消耗近似70g糖，其相当于大约270kcal的能量摄入。
过量的蔗糖消耗是有问题的，因为它与许多健康问题有关。例如，过量的蔗糖消耗被认为导致代谢综合征的发展，包括增加2型糖尿病的风险；并且导致成年人和儿童的体重增加和肥胖症。
鉴于这些问题，一个被广泛推广的策略是受试者简单地减少他们的总体糖的摄入。在环境允许的情况下，该策略可能是成功的。然而，对于许多成年人，现实是消耗高糖食物是令人愉快的，并且常常是生活中不可避免的部分。高糖食物的低糖替代品常常被认为是不太可取的，例如，是不太令人满意的。此外，在许多情况下，低糖选择不是简单地可获得的，无论是由于某些地区的供应稀缺，还是由于社会压力而摄入高糖食物。此外，对于许多人，需要考虑食品的糖水平是一种巨大的时间和精神负担。在实践中，这些受试者倾向于简单地消耗过量的糖水平，导致如上所述的健康问题。
这些困难被认识很久，并且为解决这些困难做出了各种尝试。大多数的尝试集中在减少商购获得的食品中的糖水平。然而，在生产成本增加、保质期缩短、需要人工防腐剂(这与健康和口味问题有关)和感知到的口味变差方面，这可具有显著的不利影响。例如，常用的人工甜味剂糖精与苦涩的回味有关。这些问题已导致消费者对含有人工甜味剂的产品产生一定程度的抵制。
鉴于这些困难，考虑了一种在不需要人工甜味剂的情况下，处理使用蔗糖制作的食品以便减少其热量负担的方法。已经描述的一种方法是在含蔗糖的食物消耗之前用酶(例如果糖基转移酶)工业处理它们。已经显示这些酶将蔗糖转化为不能被人体代谢的果寡糖，因此不导致受试者的热量摄入。
这类方法已经显示出前景，但仍存在重大问题。一个关键问题涉及这类食品的可用性：在实践中，商业上产生的食物可能没有以这种方式处理，并且希望限制其糖摄入的消费者可能无法知道是否指定的食品已经进行或没有进行这种处理。即使有以这种方式预处理的食品，也会出现问题，因为对消费者可用的选择通常是有限的。因此，消费者可能会被置于不得不在他们实际想要的食物和可能不太理想的替代预处理产品之间做出选择的境地，例如，由于成本或口味的原因，或由于有限的可用性原因。此外，在这类食物的预处理所产生的果寡糖可导致(或被认为导致)不利的影响(例如口味变差)。此外，“口感”常常被认为受到食物的预处理中产生的果寡糖的不利影响，因为这些果寡糖负面地影响经处理的食品的质地。这些困难意味着，即使寻求健康选择的受试者，在实践中往往最终消耗高蔗糖食物。这些问题尤其影响用以前使用的果糖基转移酶处理的食品，其中为了达到有用的转化效率通常需要高浓度的酶。
因此，需要有新的和/或改进的方法来减少与过量蔗糖消耗有关的问题，同时不影响口味或口感。
发明内容
本发明人已经认识到上述问题。本文所公开的方法解决了部分或全部这种问题。
相应地，本公开涉及一种减少受试者的果糖摄取的体内(in vivo)方法。该方法包括向受试者施用果糖基转移酶。向受试者施用的酶是分离的酶。该分离的果糖基转移酶将蔗糖转化为果寡糖，从而防止或减少受试者的体内蔗糖代谢产生游离的果糖。减少或防止游离的果糖，以及减少或防止受试者的果糖摄取。
相应地，本公开提供了一种减少受试者的果糖摄取的体内方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
还提供了一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖的体内方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
还提供了一种减少受试者的葡萄糖摄取和/或减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖的体内方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
典型地，该方法是一种在受试者体内产生果寡糖的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而将蔗糖转化为果寡糖。
典型地，该果糖基转移酶是菊糖蔗糖酶(inulosucrase)或果聚糖蔗糖酶(levansucrase)。
在一实施例中，该果糖基转移酶是EC类2.4.1.9的菊糖蔗糖酶。相应地，该方法通常是一种减少受试者的果糖摄取并且在体内产生菊糖(inulin)的方法，该方法包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。该方法可以是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在另一实施例中，该果糖基转移酶是EC类2.4.1.10的果聚糖蔗糖酶。
典型地，果糖基转移酶包括根据SEQ ID NO:1至10中任一个的多肽或其功能变体。
典型地，该果糖基转移酶：
i)与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性，其中该同源性是相对于SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、162、196、197、281、282、298、379、381、399、402、457、458和480评估的；或
ii)与SEQ ID NO:5具有至少70％同源性，其中该同源性是相对于SEQ ID NO:5的位置49、50、73、82、83、84、85、86、119、120、209、210、293、295和361评估的；或
iii)与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性，其中该同源性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、74、75、116、265、338、339、366、370、372和373评估的。
通常，果糖基转移酶包括对应于SEQ ID NO:1的A182位置处的丙氨酸。有时，该果糖基转移酶包括对应于SEQ ID NO:8的F372位置处的苯丙氨酸和/或包括对应于SEQ IDNO:8的G373位置处的甘氨酸。
典型地，果糖基转移酶具有-0.4或比-0.4更负的溶解度GRAVY评分。
通常地，果糖基转移酶来源于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链霉菌属(Streptomyces)、曲霉菌属(Aspergillus)或梭菌属(Clostridium)的生物体。典型地，所述果糖基转移酶来源于格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、棘孢曲霉菌(Aspergillus acelatus)、聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)物种的生物体。
典型地，果糖基转移酶由来自埃希氏杆菌属(Escherichia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、酵母菌属(Saccharomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、毕赤酵母属(Pichia)、木霉菌属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)，优选地大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、里氏木霉菌(T.reesei)、黑曲霉菌(A.niger)或米曲霉菌(A.oryzae)的生物体表达或可通过上述生物体表达获得。
通常，果糖基转移酶包括在营养品组合物中，该营养品组合物包括果糖基转移酶和一种或多种营养学上可接受的填充剂、稳定剂、着色剂或调味剂。典型地，所述营养品组合物被配制成片剂、锭剂(troche)、糖锭(lozenge)、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。通常，所述方法包括向所述受试者口服施用该果糖基转移酶或该营养品组合物。
典型地，这种方法是非治疗性方法。典型地，该方法不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体。
还提供了一种分离的果糖基转移酶，用于：
i)减少受试者的果糖摄取；
ii)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖；
iii)减少受试者葡萄糖摄取和/或减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖；
iv)在受试者体内产生果寡糖，该用途包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而将蔗糖转化为果寡糖；
典型地：
i)所述分离的果糖基转移酶是用于减少受试者的果糖摄取并且产生菊糖，并且该用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖；或
ii)该分离的果糖基转移酶是用于减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖，和该用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。
典型地，在该用途中，该果糖基转移酶是如本文定义的。典型地，该用途包括向受试者口服施用该分离的果糖基转移酶。该用途可以包括向受试者口服施用药学上可接受的组合物或营养学上可接受的组合物的形式的该分离的果糖基转移酶。
还提供了一种营养品组合物，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种营养学上可接受的填充剂、稳定剂、着色剂或调味剂。典型地，所述组合物是膳食补充剂。
还提供了一种药学上可接受的组合物，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在所提供的组合物中，分离的果糖基转移酶典型地是本文的分离的果糖基转移酶。典型地，所提供的组合物是用于口服施用。通常，所提供的组合物包括肠溶衣。通常，所提供的组合物被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。
本文还提供了一种如本文所述的组合物，用于药物。
还提供了一种食物组合物或食品，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种碳水化合物、脂肪、脂质、调味剂或着色剂。食物组合物或食品可以包括蔗糖。分离的果糖基转移酶典型地是如本文所定义的。
本文还提供了一种抑制受试者的食欲的方法，其包括向受试者施用本文所述的分离的果糖基转移酶或组合物。典型地，分离的果糖基转移酶是如本文定义的。典型地，该方法是非治疗性方法。典型地，所述方法不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体。典型地，所述方法包括向所述受试者口服施用该分离的果糖基转移酶或组合物。
还提供了一种如本文所述的分离的果糖基转移酶，或药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的代谢综合征、糖尿病、非酒精性脂肪肝或便秘。还提供了一种如本文所述的分离的果糖基转移酶，或药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的肥胖症。典型地，这种用途包括向所述受试者口服施用该分离的果糖基转移酶或所述药学上可接受的组合物。典型地，分离的果糖基转移酶是如本文所定义的。
附图说明
图1.在不同条件下表达的果糖基转移酶(FTase)的活性筛选。在20℃、28℃或37℃，在LB、最小自动诱导(minimal auto-induction)或复合自动诱导(complexautoinduction)下表达FTase。可溶的细胞溶解产物(lysate)与625mM蔗糖在37℃，模拟肠液中孵育。通过游离葡萄糖的释放来评估活性。数据显示了在28℃，在复合自动诱导培养基中24h的表达。空载体(empty vector,EV)被用作对照。去掉来自缓冲液的背景信号。注意，测定的线性范围是A340＝0.015至1.206。*样品被稀释了100倍。在实施例3中讨论结果。
图2.FTase的表达和纯化。(A)洗脱的蛋白质的SDS-PAGE。箭头指示了预期MW的带(Band)。具有低表达的酶被加载两次(a，b)。(B)每L培养物中菊糖蔗糖酶的表达产率。SEQID NO:2和4的蛋白质产率是不可测定的(not quantifiable，n.q.)。*SEQ ID NO:7的蛋白质产率从(A)中观察到的带计算出。
图3.在模拟的肠道条件下菊糖蔗糖酶的活性。在37℃，10μg/mL菊糖蔗糖酶与500mM的蔗糖孵育。(A，B)在不具有(A)和具有(B)胰蛋白酶(pancreatin)的情况下，监测菊糖蔗糖酶的转果糖作用。FOS中的果糖被计算为游离葡萄糖和游离果糖之差。(C，D)在存在(D)和不存在(C)胰蛋白酶的情况下，通过监测游离果糖来测量水解活性。误差条代表±1个标准差。有些误差条太小而不可见。N＝3。
图4.在低蔗糖浓度下FTase的活性。在模拟十二指肠条件下，在37℃和近似pH5.5，将SEQ ID NO:1(图4A)、SEQ ID NO:3(图4B)、SEQ ID NO:6(图4C)和SEQ ID NO:8(图4D)与不同浓度的蔗糖孵育30min。从游离葡萄糖或果糖的释放推断FOS的产生。误差条代表±1个标准差。N＝4，除了SEQ ID NO:3，其中N＝3。在实施例7中描述结果。
图5.蔗糖转化的酶浓度依赖性。在模拟的十二指肠条件下，在37℃将50μg/mL至5μg/mL的SEQ ID NO:1的连续稀释液与125mM(4.2％)蔗糖孵育30min。从游离葡萄糖/果糖的释放推断可用的果糖转化为FOS。去掉来自不具有FTase的模拟肠道相的信号。数据来自三个独立的实验，每个实验n＝5。误差条代表±1个标准差。在实施例8中描述结果。
图6.蔗糖转化为FOS的速率。在模拟十二指肠条件下，10μg/mL SEQ ID NO:1与125mM(4.2％)蔗糖在37℃下孵育。在每个时间点停止反应，并且从游离葡萄糖/果糖的释放推断可用的果糖转化为FOS。减去不具有FTase的模拟肠道相的信号。数据来自三个独立的实验，每个实验中，n＝5。误差条代表±1个标准差。在实施例9中描述结果。
图7.来自商购获得的巧克力棒的蔗糖转化。在动态的肠道模型中测试来自22.5g分量(serving)的吉百利的(Cadbury’s)(TM)牛奶(Dairy Milk)(TM)巧克力棒的蔗糖转化。巧克力通过胃相。达到胃相后(t＝60min)，添加胆汁酸，然后添加475μg SEQ ID NO：1或等同体积的水。在接下来的120min内，胰腺分泌物被泵入消化液，至达到95mL的总体积。从释放的游离葡萄糖/果糖推断FOS的产生。误差条代表±1个标准差。N＝3。在实施例10中描述结果。
具体实施方式
本发明将相对于特定的实施例并且参考某些附图进行描述，但本发明并不限于此，而是仅由权利要求限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解，依照本发明的任何特定的实施例，不一定能实现所有的方面或优点。因此，例如，本领域的技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化本文教导的一个优点或一组优点的方式来体现或实施，而不一定实现本文可能教导或建议的其他方面或优点。
此外，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非内容明确规定其他情况。因此，例如，提到“一种果糖基转移酶”包括两种或更多种果糖基转移酶，提到“一种果寡糖”包括两种或更多种这种果寡糖等等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，通过引用以其整体并入本文。
定义
提供以下术语或定义只是为了有助于本发明的理解。除非本文特别地定义，否则本文使用的所有术语对于本发明的本领域技术人员来说具有相同的含义。从业者尤其注意Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborPress,Plainsview,New York(2012)；和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)，用于本领域的定义和术语。本文提供的定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
本文使用的“约”，当提及可测量的值，例如含量、时间长度等时，是指包括相对于给定的值±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％并且仍更优选地±0.1％的变化，因为这种变化适合于执行所公开的方法。
本公开上下文中的术语“氨基酸”以其最广泛的意义使用，并且是指包括含有氨基(NH2)和羧基(COOH)官能团，连同对每个氨基酸特异的侧链(例如，R基)的有机化合物。在一些实施例中，氨基酸是指自然存在的L(左旋)α-氨基酸或残基。本文使用自然存在的氨基酸常用一个和三个字母的缩写：A＝Ala、C＝Cys、D＝Asp、E＝Glu、F＝Phe、G＝Gly、H＝His、I＝Ile、K＝Lys、L＝Leu、M＝Met、N＝Asn、P＝Pro、Q＝Gln、R＝Arg、S＝Ser、T＝Thr、V＝Val、W＝Trp和Y＝Tyr(Lehninger,A.L，(1975)Biochemistry、第2版、第71-92页、WorthPublishers、New York)。一般属于“氨基酸”还包括D-氨基酸、逆向-反向(retro-inverso)氨基酸以及化学修饰的氨基酸(例如氨基酸类似物)、通常不被并入蛋白质中的天然存在的氨基酸(例如正亮氨酸)，和具有本领域中已知的氨基酸特性的性质的化学合成化合物(例如β-氨基酸)。例如，苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物(其允许多肽化合物具有与天然Phe或Pro相同的构象限制)被包括在氨基酸的定义中。这种类似物和模拟物在本文被称为各自氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他示例由Roberts和Vellaccio,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Gross and Meiehofer eds.,第5卷,第341页,AcademicPress,Inc.,N.Y.1983列出，其通过引用并入本文。
本文可互换使用的术语“多肽”和“肽”是指氨基酸残基的聚合物并且涉及氨基酸残基的变体和合成类似物。因此，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及应用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽还可以经历成熟或翻译后修饰过程，其可包括但不限于：糖基化、蛋白裂解、脂质化、信号肽裂解、前肽裂解、磷酸化等。肽可以使用重组技术，例如通过重组或合成多核苷酸的表达制备。重组产生的肽，其典型地基本上不含培养基，例如，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、更优选地小于约10％和最优选地小于约5％。
术语“蛋白质”用于描述具有二级或三级结构的折叠多肽。蛋白质可以由单个多肽组成，或可以包括被组装以形成多聚体的多个多肽。多聚体可以是同源寡聚体或异源寡聚体。蛋白质可以是天然存在的或野生型蛋白质，或修饰的或非天然存在的蛋白质。例如，蛋白质可以通过增加、替换或删除一个或多个氨基酸而与野生型蛋白质不同。
蛋白质的“变体”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其具有相对于正在考虑的未修饰型或野生型蛋白质的氨基酸取代、缺失和/或插入并且具有与衍生它们的未修饰蛋白质相似的生物和功能活性。本文所用的术语“氨基酸同一性”是指在比较窗口中，序列在逐个氨基酸基础上相同的程度。因此，“序列同一性的百分比”通过以下计算：在比较窗口中对两个优化对齐的序列进行比较，确定两个序列中出现的相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数量以得出匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数量(即窗口大小)，并且将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。
对于本发明的所有方面和实施例，“变体”通常与相应的野生型蛋白质的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性。序列同一性也可以是与全长多核苷酸或多肽的片段或部分的序列同一性。因此，序列可以与全长参考序列仅具有50％的整体序列同一性，但特定区域、结构域或亚单位的序列可与参考序列共享80％、90％或高达99％的序列同一性。
术语“野生型”是指从天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最经常观察到的基因，并且因此被任意设计成该基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰型”、“突变体”或“变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时，显示出序列修饰(例如取代、截断或插入)、翻译后修饰和/或功能性质(例如改变的特性)的基因或基因产物。注意，可以分离天然存在的突变体；这些是通过当与野生型基因或基因产物相比它们具有改变的特性的事实来识别的。用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在本领域是众所周知的。例如，通过在编码突变单体的多核苷酸中相关位置处用精氨酸(CGT)的密码子替换蛋氨酸(ATG)的密码子使得精氨酸(R)取代蛋氨酸(M)。用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在本领域也是众所周知的。例如，非天然存在的氨基酸可以通过在用于表达突变单体的IVTT系统中包括合成的氨酰基-tRNA来引入。可替选地，它们可以通过在大肠杆菌中表达突变单体来引入，该突变体单体在特定氨基酸的合成(即非天然存在的)类似物存在的情况下，对特定氨基酸是营养缺陷型。如果突变单体是使用部分肽合成法产生的，则它们也可以通过裸连接法来生产。保守的取代用相似的化学结构、相似的化学性质或相似的侧链体积的其他氨基酸替换氨基酸。引入的氨基酸可具有与它们所替换的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替选地，保守的取代可以引入另一种芳香族或脂肪族的氨基酸代替现存的芳香族或脂肪族氨基酸。保守性氨基酸的改变在本领域是众所周知的，并且可以依照以下表1中定义的20种主要氨基酸的特性来选择。在氨基酸具有相似的极性时，这也可以参照表2中的氨基酸侧链的亲水性(hydropathy)等级来确定。
表1-氨基酸的化学特性
表2–亲水性等级
突变的或修饰的蛋白质、单体或肽也可以以任何方式和在任何位点进行化学修饰。突变的或修饰的单体或多肽可以通过分子与一个或多个半胱氨酸的附接(半胱氨酸连接)、分子与一个或多个赖氨酸的附接、分子与一个或多个非天然氨基酸的附接、表位的酶修饰或末端的修饰来进行化学修饰。用于实施这类修饰的合适方法在本领域中是众所周知的。修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过任何分子的附接进行化学修饰。例如，修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过染料或荧光基团的附接而进行化学修饰。
使用果糖基转移酶的方法
在一方面，本公开涉及一种减少受试者的果糖摄取的体内方法。该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。在另一方面，本公开涉及一种减少经受试者蔗糖代谢而形成果糖的体内方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。该方法可以是治疗性方法或非治疗性方法，如本文更详细地描述的。该方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少受试者的果糖摄取。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少经受试者蔗糖代谢而形成果糖。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少受试者的果糖摄取的试剂中的用途。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少经受试者蔗糖代谢而形成果糖的试剂中的用途。
如以下详细解释的，施用分离的果糖基转移酶导致蔗糖(通常因消化食物中的糖而存在)转化为果寡糖，例如菊糖和/或果聚糖(levan)。换句话说，果糖基转移酶是催化该反应的酶。本文更详细地描述了用于所公开的方法的果糖基转移酶。
因此，在一方面中，本文提供的方法是一种在受试者体内产生果寡糖的方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而将蔗糖转化为果寡糖。果寡糖典型地是菊糖或果聚糖，最通常地菊糖。方法可以是治疗性方法或非治疗性方法，如本文更详细地描述的。该方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于在受试者体内产生果寡糖。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于在受试者体内产生果寡糖的试剂中的用途。
1804年由Rose首次报道，菊糖是天然存在的果聚糖类型的低聚糖，从土木香(Inula helenum)(土木香(Elecampane))中分离的碳水化合物。那个世纪晚期(1879)，Friedrich Flueckinger和Daniel Hanbury在“Pharmacographia:a history of theprinciple drugs of vegetable origin met within Great Britain and BritishIndia”中提到了菊糖。菊糖以高浓度天然存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣根(chicory root)、大蒜、芦笋根中，并且在洋葱、韭菜、香蕉和小麦中以较少含量存在(Kaur&Gupta 2002)。因此，在典型的西方饮食中，菊糖的平均每日摄入量范围在1g和10g之间，其中欧洲人的摄入量(3-11g)高于美国人的摄入量(1-4g)Coussement 1999)。
菊糖由通过糖苷键连接的重复β-D-果糖基单元和链式成核的ɑ-D-葡糖基组成。短的菊糖链(少于10个果糖单位)也被称为低聚果糖。菊糖与称为果聚糖的成分相似的低聚糖的区别在于聚合物中糖苷键的性质：在菊糖中，键是(2→1)，而在果聚糖中的键是(2→6)。这些结构之间的关系如下所示：
本文提供的方法至少部分是基于这样的认识，即果寡糖(例如菊糖和果聚糖)不能被受试者例如哺乳动物(例如人)自然地代谢。相应地，这种果寡糖通常被认为是“无热量”的膳食纤维。体内果寡糖(例如菊糖和果聚糖)的产生减少了体内的酶(例如蔗糖酶、异麦芽糖酶糖苷水解酶和转化酶)用于代谢为其的组成单体(葡萄糖和果糖)的蔗糖的量。换句话说，通过降低这些酶的蔗糖底物(substrate)的浓度，减少了游离葡萄糖，尤其是游离的果糖的产生。因为降低了体内游离的葡萄糖和果糖的浓度，所以减少了这些分子的摄入。
所公开的方法的进一步优点是其中产生的果寡糖(例如菊糖)，除了由蔗糖减少引起的那些益处外，还与它本身的健康益处有关。因此，施用分离的果糖基转移酶具有协同优势，因为降低蔗糖水平和增加果寡糖(例如菊糖)水平都有双重益处。
由果寡糖(例如菊糖)引起的健康益处的一个主要驱动因素是结肠微生物群的变化。与许多膳食纤维不同，果寡糖(例如菊糖)的发酵是选择性的。这种果寡糖可以被与肠道健康相关的菌种，包括乳杆菌属(lactobacilli)、双歧杆菌属(bifidobacteria)和梭杆菌属(fusobacteria)代谢，从而导致它们的增殖。这种增殖减少肠道中的致病性/机会性细菌，例如某些大肠杆菌(E.coli)、梭状芽孢杆菌属(Clostridia)和念珠菌属(Candida)菌株的比例。因此，本文提供的方法和用途可包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，以便改善受试者的微生物群系，例如通过促进例如乳杆菌属(lactobacilli)、双歧杆菌属(bifidobacteria)和梭杆菌属(fusobacteria)细菌的增殖。在减少肝细胞内和肌细胞内脂质方面的进一步益处与果寡糖(例如菊糖)有关。
在本文提供的方法中产生的果寡糖(例如菊糖或果聚糖)的长度典型是至少2个、例如至少3个、例如至少4个、例如至少5个、例如至少10个、例如至少20个、例如至少30个、例如至少40个、例如至少50个、例如至少100个单体单位。果寡糖的长度通常是2个至200个单体单位、例如5至100个单体单位、例如10至80个单体单位、例如20至60个单体单位、例如30至50个单体单位。
典型地，在本文提供的方法中，将果糖基转移酶以营养品组合物或药物组合物的形式，或以食物组合物或食品的形式向受试者施用。本文还明确提供了这种组合物本身。本文更详细地描述了营养品组合物和药物组合物。本文更详细地描述了食物组合物和食品。
将分离的果糖基转移酶或包括这种果糖基转移酶的组合物典型地向受试者口服施用。
果糖基转移酶
本文所公开的方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶酶类。
如本领域的技术人员所理解的，任何合适的分离的果糖基转移酶可用于本文提供的方法和产品。
本文使用的，术语“分离的”是指细胞外的酶。酶典型地从细胞宿主中纯化。如本文使用的分离的酶不在细菌或真菌宿主内提供。向生物体施用包括果糖基转移酶酶类的细菌或真菌不相当于向生物体施用分离的酶。因此，术语“分离的酶”不包括整个细胞，例如细菌或真菌细胞。
然而，本领域的技术人员将理解，术语“分离的酶”不要求除了酶之外没有其他物质存在。如本文更详细地解释的，“分离的酶”可以以营养品组合物或药物组合物的形式施用。“分离的酶”可包括在食物组合物或食品中。也可能存在杂质。然而，通常不存在杂质，例如，酶基本上是纯化的。通常，如本文定义的包括分离的酶的组合物可基本上不含有或含有杂质，例如宿主DNA(例如来自其中可以表达酶的生物体(例如细菌或酵母)的DNA)。如下更详细解释的，营养品组合物典型地包括分离的酶和一种或多种赋形剂、稀释剂或其他营养学上可接受的添加剂。相似地，药物组合物典型地包括分离的酶和一种或多种赋形剂、稀释剂或其他药学上可接受的添加剂。如本文所述的包括分离的酶的食物组合物或食品典型地包括分离的酶和一种或多种碳水化合物、脂肪、脂质、调味剂、着色剂等。
所公开的方法中使用的果糖基转移酶酶类是功能性的，即其能够将蔗糖转化为果寡糖(例如菊糖和/或果聚糖)。变性的酶典型地是没有功能性的。因此，向受试者施用食品(其中已经用果糖基转移酶酶类或表达果糖基转移酶酶类的生物体预处理食品)不相当于向受试者施用分离的果糖基转移酶。在这种食品中，预处理食品的酶典型地是变性或失活的，使得其是没有功能性的，例如经烹饪工艺期间的加热处理(例如烘烤)。这与本公开的实施例形成对比，其中在食品中施用酶，使得其在体内，例如在消化系统内，例如在小肠和/或胃中保留酶的活性。
酶可以在细胞宿主中细胞内表达，并且通过从宿主中纯化而分离。例如，细胞内的酶可以经细胞裂解随后纯化细胞裂解物来分离。
可替选地，果糖基转移酶可以是细胞外的酶，例如由生物体通过分泌到表达基质中表达的酶。这种酶可以通过表达基质的纯化来分离，而不需要细胞裂解。
果糖基转移酶可以作为细胞内的酶在细胞生物体中自然地表达，并且进行修饰，以便作为细胞外的酶从细胞排出。例如，果糖基转移酶可以通过缺失例如蛋白质序列的C末端处的细胞壁锚定结构域来修饰，以便促进分泌到表达基质中。如果蛋白质序列中存在，则可以通过删除信号肽来修饰果糖基转移酶。
果糖基转移酶可以在任何合适的生物体中表达。蛋白质的表达对于本领域的技术人员是常规的，并且在例如参考文献，例如Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第4版,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2012)；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 114),John Wiley&Sons,NewYork(2016)中描述。
典型地，用于所公开的方法的果糖基转移酶在细胞中，例如在细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞中表达。典型地使用细菌细胞。许多细菌被认为是一般认为安全(GenerallyRecognised as Safe，GRAS)，并且因此适合人消化。虽然所公开的方法集中在施用分离的酶，但从GRAS生物体中产生这种酶有利于赋予分离的酶GRAS状态。相应地，在一些实施例中，用于表达用于所公开的方法的果糖基转移酶的细菌被认证为是GRAS。当使用细菌来表达用于所公开的产品和方法的果糖基转移酶酶类时，可以使用任何合适的细菌。在一些其他实施例中，用于表达用于所公开的方法的果糖基转移酶的酵母被认证为GRAS。当使用酵母来表达用于所公开的产品和方法的果糖基转移酶时，可以使用任何合适的酵母。例如，果糖基转移酶典型地由来自埃希氏杆菌(Escherichia)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、酵母菌(Saccharomyces)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、毕赤酵母(Pichia)属、木霉菌(Trichoderma)属或曲霉菌(Aspergillus)属的生物体，优选地大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、里氏木霉菌(T.reesei)、黑曲霉菌(A.niger)或米曲霉菌(A.oryzae)的生物体表达或可通过上述生物体表达获得。例如，果糖基转移酶典型地由以下表达或可通过以下表达获得：来自埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属或芽孢杆菌属的生物体，例如埃希氏杆菌属或芽孢杆菌属，优选地大肠杆菌、酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，果糖基转移酶由以下表达或可通过以下表达获得：来自埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属或毕赤酵母属的生物体，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。相应地，在一些实施例中，所公开的方法包括在埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属、毕赤酵母属、木霉菌属或曲霉菌属，例如埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属或毕赤酵母属的生物体中表达果糖基转移酶酶类，分离果糖基转移酶，然后向受试者施用分离的果糖基转移酶。在一些实施例中，所公开的方法包括在大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母、里氏木霉菌、黑曲霉菌或米曲霉菌，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或巴斯德毕赤酵母中表达果糖基转移酶，分离果糖基转移酶，然后向受试者施用分离的果糖基转移酶。在一些实施例中，所公开的方法包括在埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属或芽孢杆菌属，例如埃希氏杆菌属或芽孢杆菌属的生物体，优选地大肠杆菌或枯草芽孢杆菌生物体中表达果糖基转移酶，分离果糖基转移酶，然后向受试者施用分离的果糖基转移酶。
如果需要，用于所公开方法的果糖基转移酶可以通过细胞裂解来分离。细胞裂解可以用任何合适的方法进行。例如，细胞可以是物理裂解，例如使用弗氏压碎器(Frenchpress)，或通过在合适的缓冲液中的声裂法(sonication)。这种缓冲液是例如从Qiagens商业获得的。
不纯的酶溶液可以通过任何合适的方法纯化，用于所公开的方法。典型地，果糖基转移酶可以使用对于本领域的技术人员是容易得到的合适的色谱法(chromatographic)纯化。合适的层离法包括离子交换色谱法(例如阴离子交换或阳离子交换层析)、尺寸排除色谱法(size exclusion chromatography)和/或疏水性作用色谱法。也可以使用亲和色谱。可以使用任何合适的亲和系统。例如，果糖基转移酶可以用标签，例如多组氨酸标签(例如HHHH、HHHHHH或HHHHHHHH)标记，并且在含金属的柱，例如镍或钴硝酰乙酸柱上纯化。其他纯化标签包括肽标签，例如链球菌(Strep)(WSHPQFEK)、FLAG标签(DYKDDDDK)、人流感血凝素(HA)(YPYDVPDYA)、Myc标签(EQKLISEED)和V5标签(GKPIPNPLLGLDST)等，其可使用合适的柱纯化。纯化标签可以是可裂解或不可裂解的。选择合适的纯化技术对于本领域的技术人员是常规的。
在另一方面，用于本文提供的方法的果糖基转移酶可以在无细胞表达系统中表达。例如，果糖基转移酶酶类可以由体外转录/翻译(in vitro transcription/translation，IVTT)从合适的表达质粒表达。进行IVTT的试剂盒可从供应商，例如NewEngland Biolabs(NEB)商购获得。
果糖基转移酶可以是能够将蔗糖转化为一种或多种果寡糖的任何合适的酶。
相应地，在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的果糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。这类方法可以是本文所述的治疗性或非治疗性的。这类方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且体内产生一种或多种果寡糖的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。这类方法可以是本文所述的治疗性或非治疗性的。这类方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。
本文还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少受试者的果糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖。所述用途可包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生一种或多种果寡糖。所述用途可包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少受试者的果糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖的试剂中的用途。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生一种或多种果寡糖的试剂中的用途。
方法典型地还涉及减少葡萄糖的产生，尽管通常其水平低于果糖的减少。例如，菊糖中的初始单体典型地是葡萄糖，并且因此通过产生菊糖，减少了游离的葡萄糖水平。
相应地，在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生一种或多种果寡糖的方法，其包括向受试者施用一种分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。这种方法可以是本文所述的治疗性或非治疗性的。这种方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。
本文还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖。所述用途可以包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。还提供了一种果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)，用于减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生一种或多种果寡糖。所述用途可包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而在体内将蔗糖转化为一种或多种果寡糖。还提供了果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生一种或多种果寡糖的试剂中的用途。还提供了果糖基转移酶(例如分离的果糖基转移酶)在制造用于减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生一种或多种果寡糖的试剂中的用途。
最通常，果糖基转移酶是菊糖蔗糖酶或果聚糖蔗糖酶。
果糖基转移酶可以是能够将蔗糖转化为菊糖的菊糖蔗糖酶。果糖基转移酶可以是EC类2.4.1.9的菊糖蔗糖酶。
相应地，在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的果糖摄取并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的果糖和葡萄糖摄取并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖和葡萄糖并且在体内产生菊糖的方法，其包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。这种方法可以是本文所述的治疗性或非治疗性的。这种方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。
本文还提供了一种分离的菊糖蔗糖酶，用于：(i)减少受试者的果糖摄取并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖；(ii)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖；(iii)减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖；(iv)减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖；(v)减少受试者的果糖和葡萄糖摄取并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖；或(vi)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖和葡萄糖并且在体内产生菊糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为菊糖。还提供了分离的菊糖蔗糖酶在制造根据以上(i)至(vi)中任何一个应用的试剂中的用途。
在其他实施例中，果糖基转移酶是能够将蔗糖转化为果聚糖的果聚糖蔗糖酶。果糖基转移酶可以是EC类2.4.1.10的果聚糖蔗糖酶。
相应地，在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的果糖摄取并且在体内产生果聚糖的方法，其包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生果聚糖的方法，其包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生果聚糖的方法，其包括给受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。在一些实施例中，该方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生果聚糖的方法，其包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。在一些实施例中，提供的方法是一种减少受试者的果糖和葡萄糖摄取并且在体内产生果聚糖的方法，其包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。在一些实施例中，方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖和葡萄糖并且在体内产生果聚糖的方法，其包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。这种方法可以是本文所述的治疗性或非治疗性方法。这种方法可以是不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体的非治疗性方法。
本文还提供了一种分离的果聚糖蔗糖酶，用于：(a)减少受试者的果糖摄取并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖；(b)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖；(c)减少受试者的葡萄糖摄取并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖；(d)减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖；(e)减少受试者的果糖和葡萄糖摄取并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖；或(f)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖和葡萄糖并且在体内产生果聚糖，其中所述用途包括向受试者施用分离的果聚糖蔗糖酶，并且从而在体内将蔗糖转化为果聚糖。还提供了分离的果聚糖蔗糖酶在制造根据以上(a)至(f)中任何一个应用的试剂中的用途。
通常，果糖基转移酶对蔗糖具有高亲和力。典型地，果糖基转移酶对蔗糖具有小于15.6mM、例如小于12mM、例如小于10mM、例如小于5mM的米歇利斯常数(Michaelisconstant，KM)。
典型地，果糖基转移酶能够在低浓度蔗糖的条件下将蔗糖转化为果寡糖(例如菊糖)。低浓度的蔗糖典型地被认为有利于蔗糖水解(水解为果糖和葡萄糖)而不是转果糖基化(transfructosylation)。然而，即使在低蔗糖浓度的条件下，典型地本文所述的果糖基转移酶能够保持与水解相比高的转果糖基化比例(即高的T/H比例)。例如，在约0.5％(例如约0.5％w/w或w/v)的蔗糖浓度下，本文所述的果糖基转移酶典型地能够将蔗糖转化为果寡糖，以至少0.05、例如至少0.1、例如至少0.2、例如至少0.25或至少0.3的T/H比例。在约1％(例如约1％w/w或w/v)的蔗糖浓度下，本文所述的果糖基转移酶典型地能够将蔗糖转化为果寡糖，以至少0.1、例如至少0.2、例如至少0.3、例如至少0.4、例如至少0.42的T/H比例。
典型地，在体温(例如在约37℃)和在约pH 4至约pH 9(例如约pH 6至约pH8)条件下，果糖基转移酶是有活性的。有时，在约1至约2的pH条件下，果糖基转移酶的活性可以小于50％、例如小于40％、例如小于30％、例如小于20％、例如小于10％、例如小于5％、例如小于4％、小于3％、小于2％或小于1％，在约4至约9的pH条件下，果糖基转移酶活性最高。有时，在pH约1至约2，例如pH约1.5的条件下，果糖基转移酶可能没有活性。人胃的pH典型地为约1.5，而小肠的pH典型地近似6-8。
在一些实施例中，在pH为约1至约2，例如为约1.5的条件下，果糖基转移酶不变性。在一些实施例中，尽管pH在约1至约2，例如约1.5的条件下，果糖基转移酶基本上可以是酶促失活的(例如可以在pH为约1至2的条件下具有在pH约4至约9条件下果糖基转移酶的最大活性的50％的酶活性，如以上定义的)，如果暴露于较高pH的条件下，果糖基转移酶可以保持活性。因此，在一个实例中，可以将果糖基转移酶施用至受试者，其中其暴露于例如在胃中低pH值条件下，并且在这种环境中，果糖基转移酶可以基本上是失活的；并且在例如在小肠中较高pH的区域(regions)中，果糖基转移酶可以是酶活性的。在一些实施例中，在低pH条件下，例如pH为约1至约2，在约0.1小时至约10小时，例如约0.5小时至约5小时，例如约2小时至约4小时的一段时间内，果糖基转移酶可能不变性。
在一些实施例中，果糖基转移酶的序列是未知的。然而，通常果糖基转移酶的序列是已知的。果糖基转移酶的序列可以使用本领域的常规技术，包括经基因测序、埃德曼降解(Edman degradation)等来确定。
典型地，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:1至10中任何一个的多肽或其功能变体。如本文使用的，功能变体是包括与参考序列(例如SEQ ID NO:1-10之一)相关但不同的氨基酸序列的变体，并且其保留了催化蔗糖产生一种或多种果寡糖的能力。
功能变体可以是本文所述的酶或氨基酸序列的功能片段、衍生物或变体。如本领域的技术人员所理解的，氨基酸序列的片段包括这种序列的缺失变体，其中删除一个或多个，例如至少1个、2个、5个、10个、20个、50个、100个、200个或300个氨基酸。缺失可以发生在原生序列的C-末端或N-末端或原生序列内。典型地，一个或多个氨基酸的缺失不影响紧接地围绕酶的活性位点的残基。氨基酸序列的衍生物包括翻译后修饰的序列，其包括在体内或体外修饰的序列。许多不同的蛋白质修饰是本领域技术人员已知的，并且包括为氨基酸残基引入新功能的修饰、为保护反应性氨基酸残基的修饰或为将氨基酸残基偶联到化学部分的修饰，例如连接体上的反应性官能团。
氨基酸序列的衍生物包括这种序列的添加变体，其中一个或多个，例如至少1个、2个、5个、10个、20个、50个、100个、200个或300个氨基酸被添加到或引入到原生序列中。添加可以发生在原生序列的C-末端或N-末端或原生序列内。典型地，一个或多个氨基酸的添加不影响紧接地围绕酶的活性位点的残基。
氨基酸序列的变体包括序列，其中原生序列中一个或多个氨基酸，例如至少1个、2个、5个、10个、20个、50个、100个、200个或300个氨基酸残基被交换为一个或多个非原生残基。因此，这种变体可以包括点突变，或可以更深入，例如，可以使用原生化学连接以将非原生氨基酸序列拼接到部分原生序列，以产生原生酶的变体。氨基酸序列的变体包括携带天然存在的氨基酸和/或非天然的氨基酸的序列。上述氨基酸序列的变体、衍生物和功能片段至少保留了原生/野生型序列的一些活性/功能。优选地，当与原生/野生型序列相比时，上述序列的变体、衍生物和功能片段具有增加的/改善的活性/功能。
变体典型地与相应的野生型蛋白质的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％全序列同一性。序列同一性典型地在至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的参考序列内确定。序列同一性可以在包括蛋白质活性位点的序列的区域确定。
相应地，在一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:1的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性的多肽。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:2的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:2具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:2具有至少70％同源性或同一性的多肽。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:3的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:3具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:3具有至少70％同源性或同一性的多肽。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:4的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:4具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:4具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:4的多肽的变体是根据SEQ ID NO:4a的多肽；其中SEQ IDNO:4a对应于SEQ ID NO:4的残基39至701。换句话说，SEQ ID NO:4a省略了SEQ ID NO:4的残基1至38。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:5的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:5具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:5具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:5的多肽的变体是根据SEQ ID NO:5a的多肽；其中SEQ IDNO:5a对应于SEQ ID NO:5的残基32至453。换句话说，SEQ ID NO:5a省略了SEQ ID NO:5的残基1至31。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:6的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:6具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:6具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:6的多肽的变体是根据SEQ ID NO:6a的多肽；其中SEQ IDNO:6a对应于SEQ ID NO:6的残基39至701。换句话说，SEQ ID NO:6a省略了SEQ ID NO:6的残基1至38。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:7的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:7具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:7具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:7的多肽的变体是根据SEQ ID NO:7a的多肽；其中SEQ IDNO:7a对应于SEQ ID NO:7的残基20至654。换句话说，SEQ ID NO:7a省略了SEQ ID NO:7的残基1至19。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:8的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性的多肽。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:9的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:9具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:9具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:9的多肽的变体是根据SEQ ID NO:9a的多肽；其中SEQ IDNO:9a对应于SEQ ID NO:9的残基30至472。换句话说，SEQ ID NO:9a省略了SEQ ID NO:9的残基1至29。
在另一个实施例中，果糖基转移酶是或包括根据SEQ ID NO:10的多肽或其功能变体；例如，果糖基转移酶可以由在整个序列上与SEQ ID NO:10具有至少70％同源性或同一性的多肽组成或包括在整个序列上与SEQ ID NO:10具有至少70％同源性或同一性的多肽。在一些实施例中，根据SEQ ID NO:10的多肽的变体是根据SEQ ID NO:10a的多肽；其中SEQID NO:10a对应于SEQ ID NO:10的残基30至484。换句话说，SEQ ID NO:10a省略了SEQ IDNO:10的残基1至29。
果糖基转移酶酶类的活性位点可以通过任何合适的方法来确定。活性位点可以例如在底物(substrate)存在的情况下通过X-射线晶体学来确定。活性位点可以通过基于类似的酶，例如相关的果糖基转移酶的实验上或理论上确定的结构的生物学信息同源模型来确定。活性位点可以通过基因研究来确定，例如，通过突变或删除酶的部分，并且将所做的改变与所产生的变体的活性联系起来。在序列列表中以灰色/黑体/黑体和下划线显示与对应于SEQ ID NO:1至10的多肽的活性位点相关的残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置126至483的氨基酸序列评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置126、128、129、131、153、156、157、158、159、160、161、162、163、194、195、196、197、198、213、215、221、223、225、277、278、279、280、281、282、283、298、378、379、380、381、382、383、397、399、401、402、457、458、459、476、479、480、481、482和483的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:1中以灰色/黑体/黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:2、3、4和6中以灰色/黑体/黑体和下划线显示相应的残基。为了避免疑问，SEQ ID NO:2中相应的残基包括位置127、129、130、132、154、157、158、159、160、161、162、163、164、195、196、197、198、199、214、216、222、224、226、278、279、280、281、282、283、284、299、379、380、381、382、383、384、398、400、402、403、458、459、460、477、480、481、482、483和484。SEQ ID NO:3中相应的残基包括位置126、128、129、131、153、156、157、158、159、160、161、162、163、194、195、196、197、198、213、215、221、223、225、277、278、279、280、281、282、283、298、378、379、380、381、382、383、397、399、401、402、457、458、459、476、479、480、481、482和483。在SEQ ID NO:4中相应的残基包括位置231、233、234、236、258、261、262、263、264、265、266、267、268、300、301、302、303、304、319、321、327、329、331、381、382、383、384、385、386、387、402、482、483、484、485、486、487、501、503、505、506、561、562、563、580、584、585、586和587。SEQ ID NO:6中相应的残基包括位置231、233、234、236、258、261、262、263、264、265、266、267、268、300、301、302、303、304、319、321、327、329、331、381、382、383、384、385、386、387、402、482、483、484、485、486、487、501、503、505、506、561、562、563、580、583、584、585、586和587。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、161、162、194、196、197、213、223、277、278、281、282、298、379、381、382、399、402、457、458和480的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:1中以黑体/黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:2、3、4和6中以黑体/黑体和下划线显示相应的残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、162、196、197、281、282、298、379、381、399、402、457、458和480的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:1中以黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:2、3、4和6中以黑体和下划线显示相应的残基。
在不受理论约束的情况下，发明人认为，位置126、128、129、131、153、156、157、158、159、160、161、162、163、194、195、196、197、198、213、215、221、223、225、277、278、279、280、281、282、283、298、378、379、380、381、382、383、397、399、401、402、457、458、459、476、479、480、481、482和483的部分或全部包括在SEQ ID NO:1的蛋白质活性位点中。例如，果糖基转移酶可与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，其中序列同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置126、128、129、131、153、156、157、158、159、160、161、162、163、194、195、196、197、198、213、215、221、223、225、277、278、279、280、281、282、283、298、378、379、380、381、382、383、397、399、401、402、457、458、459、476、479、480、481、482和483；优选地SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、161、162、194、196、197、213、223、277、278、281、282、298、379、381、382、399、402、457、458和480；更优选地SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、162、196、197、281、282、298、379、381、399、402、457和480确定的。果糖基转移酶可与SEQ ID NO:1的序列具有100％序列同一性，其中序列的同一性是相对于SEQ ID NO:1的位置126、128、129、131、153、156、157、158、159、160、161、162、163、194、195、196、197、198、213、215、221、223、225、277、278、279、280、281、282、283、298、378、379、380、381、382、383、397、399、401、402、457、458、459、476、479、480、481、482和483；优选地SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、161、162、194、196、197、213、223、277、278、281、282、298、379、381、382、399、402、457、458和480；更优选地SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、162、196、197、281、282、298、379、381、399、402、457和480评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:5或5a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:5的位置47至387的氨基酸序列评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:5或5a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:5的位置47、49、50、52、73、75、80、81、82、83、84、85、86、117、118、119、120、121、204、205、206、208、209、210、211、228、292、293、294、295、296、311、312、313、316、325、361、362、363、374、376、377和387的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:5中以灰色/黑体/黑体和下划线显示这些残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:5或5a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:5的位置47、49、50、73、80、81、82、83、84、85、86、117、119、120、121、204、205、210、211、228、292、293、295、296、311、313、316、361、362、374和377的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:5中以黑体/黑体和下划线显示这些残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:5或5a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:5的位置49、50、73、82、83、84、85、86、119、120、210、211、293、295和361的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:5中以黑体和下划线显示这些残基。
在不受理论约束的情况下，发明人认为，位置47、49、50、52、73、75、80、81、82、83、84、85、86、117、118、119、120、121、204、205、206、208、209、210、211、228、292、293、294、295、296、311、312、313、316、325、361、362、363、374、376、377和387的部分或全部被包括在SEQID NO:5的蛋白质活性位点中。例如，果糖基转移酶可与SEQ ID NO:5或5a具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，其中序列同一性是相对于SEQ ID NO:5或5a的位置47、49、50、52、73、75、80、81、82、83、84、85、86、117、118、119、120、121、204、205、206、208、209、210、211、228、292、293、294、295、296、311、312、313、316、325、361、362、363、374、376、377和387；优选地位置47、49、50、73、80、81、82、83、84、85、86、117、119、120、121、204、205、210、211、228、292、293、295、296、311、313、316、361、362、374和377；更优选地位置49、50、73、82、83、84、85、86、119、120、210、211、293、295和361确定的。果糖基转移酶可与SEQ ID NO:5或5a的序列具有100％序列同一性，其中序列的同一性是相对于SEQ ID NO:5的位置47、49、50、52、73、75、80、81、82、83、84、85、86、117、118、119、120、121、204、205、206、208、209、210、211、228、292、293、294、295、296、311、312、313、316、325、361、362、363、374、376、377和387；优选地位置47、49、50、73、80、81、82、83、84、85、86、117、119、120、121、204、205、210、211、228、292、293、295、296、311、313、316、361、362、374和377；更优选地位置49、50、73、82、83、84、85、86、119、120、210、211、293、295和361评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54至389的氨基酸序列评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、60、61、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、113、114、115、116、117、138、140、151、187、188、263、265、266、290、299、300、301、304、306、336、337、338、339、340、341、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、386、387、388和389的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:8中以灰色/黑体/黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:7中以灰色/黑体/黑体和下划线显示相应的残基。为了避免疑问，SEQ ID NO:7中相应的残基包括位置38、39、40、41、42、43、44、45、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、97、98、99、100、101、122、124、135、171、172、271、273、274、299、308、309、310、313、315、348、349、350、351、352、353、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、399、400、401和402。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、73、74、75、76、77、78、81、115、116、187、188、265、266、290、304、338、339、340、366、368、370、371、372、373、374和389的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:8中以黑体/黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:7中以黑体/黑体和下划线显示相应的残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、74、75、116、265、338、339、366、370、372和373的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:8中以黑体和下划线显示这些残基。在SEQ ID NO:7中以黑体和下划线显示相应的残基。
在不受理论约束的情况下，本发明人认为，SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、60、61、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、113、114、115、116、117、138、140、151、187、188、263、265、266、290、299、300、301、304、306、336、337、338、339、340、341、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、386、387、388和389的部分或全部被包括在SEQ ID NO:8的蛋白质的活性位点中。例如，果糖基转移酶可与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，其中序列同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、60、61、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、113、114、115、116、117、138、140、151、187、188、263、265、266、290、299、300、301、304、306、336、337、338、339、340、341、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、386、387、388和389；优选地位置54、55、56、57、58、59、73、74、75、76、77、78、81、115、116、187、188、265、266、290、304、338、339、340、366、368、370、371、372、373、374和389；更优选地位置54、55、56、57、58、59、74、75、116、265、338、339、366、370、372和373确定的。果糖基转移酶可与SEQ ID NO:8的序列具有100％序列同一性，其中序列的同一性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、60、61、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、113、114、115、116、117、138、140、151、187、188、263、265、266、290、299、300、301、304、306、336、337、338、339、340、341、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、386、387、388和389；优选地位置54、55、56、57、58、59、73、74、75、76、77、78、81、115、116、187、188、265、266、290、304、338、339、340、366、368、370、371、372、373、374和389；更优选地位置54、55、56、57、58、59、74、75、116、265、338、339、366、370、372和373评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:9或9a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置54至406的氨基酸序列评估的。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:9或9a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置54、56、57、59、80、83、84、85、86、87、88、89、90、132、133、134、135、136、150、151、153、161、208、213、214、215、216、217、218、219、233、311、312、313、314、315、329、331、333、334、382、383、384、400、403、404、405和406的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:9中以灰色/黑体/黑体和下划线显示这些残基。在SEQID NO:10中以灰色/黑体/黑体和下划线显示相应的残基。为了避免疑问，SEQ ID NO:10中相应的残基包括位置63、65、66、68、89、92、93、94、95、96、97、98、99、141、142、143、144、145、159、160、162、170、218、223、224、225、226、227、228、229、243、321、322、323、324、325、339、341、343、344、392、393、394、410、413、414、415和416。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:9或9a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置56、57、80、84、85、86、87、88、89、90、132、134、135、151、213、217、218、233、311、313、314、331、334、382、383、400、404和406的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:9中以黑体/黑体和下划线显示这些残基。
在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:9或9a具有至少70％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置56、57、86、87、88、134、135、217、218、233、311、313、331、334、382和404的部分或全部评估的。在SEQ ID NO:9中以黑体和下划线显示这些残基。
在不受理论约束的情况下，本发明人认为，位置54、56、57、59、80、83、84、85、86、87、88、89、90、132、133、134、135、136、150、151、153、161、208、213、214、215、216、217、218、219、233、311、312、313、314、315、329、331、333、334、382、383、384、400、403、404、405和406的部分或全部被包括在SEQ ID NO:9的蛋白质活性位点中。例如，果糖基转移酶可与SEQ IDNO:9或9a具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性，其中序列同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置54、56、57、59、80、83、84、85、86、87、88、89、90、132、133、134、135、136、150、151、153、161、208、213、214、215、216、217、218、219、233、311、312、313、314、315、329、331、333、334、382、383、384、400、403、404、405和406；优选地位置56、57、80、84、85、86、87、88、89、90、132、134、135、151、213、217、218、233、311、313、314、331、334、382、383、400、404和406；更优选地位置56、57、86、87、88、134、135、217、218、233、311、313、331、334、382和404确定的。果糖基转移酶可与SEQ ID NO:9或9a的序列具有100％序列同一性，其中序列的同一性是相对于SEQ ID NO:9的位置54、56、57、59、80、83、84、85、86、87、88、89、90、132、133、134、135、136、150、151、153、161、208、213、214、215、216、217、218、219、233、311、312、313、314、315、329、331、333、334、382、383、384、400、403、404、405和406；优选地位置56、57、80、84、85、86、87、88、89、90、132、134、135、151、213、217、218、233、311、313、314、331、334、382、383、400、404和406；更优选地位置56、57、86、87、88、134、135、217、218、233、311、313、331、334、382和404评估的。
序列同源性或同一性可如上所述，例如基于讨论中的序列与参考序列(例如SEQID NO:1、5、5a、8、9或9a)的序列比对确定。
因此，在一些实施例式中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1、2、3、4、4a、5、5a、6、6a、7、7a、8、9、9a、10或10a的任何一个具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于相关序列中以灰色/黑体/黑体和下划线标记的位置评估的。在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1、2、3、4、4a、5、5a、6、6a、7、7a、8、9、9a、10或10a的任何一个具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于相关序列中以黑体/黑体和下划线标记的位置评估的。在一些实施例中，果糖基转移酶与SEQ ID NO:1、2、3、4、4a、5、5a、6、6a、7、7a、8、9、9a、10或10a的任何一个具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性，其中所述同源性或同一性是相对于相关序列中以黑体和下划线标记的位置评估的。
典型地，在一个实施例中，果糖基转移酶包括对应于SEQ ID NO:1的A182位置处的丙氨酸。例如，在SEQ ID NO:2中，对应于SEQ ID NO:1的A182的位置是A183。在SEQ ID NO:3中，对应于SEQ ID NO:1的A182的位置是A182。在SEQ ID NO:4中，对应于SEQ ID NO 1的A182的位置是V287。在SEQ ID NO:6中，对应于SEQ ID NO:1的A182的位置是A287。
典型地，在另一个实施例中，果糖基转移酶包括：
-对应于SEQ ID NO:8的F372的位置处的苯丙氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的G373的位置处的甘氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的N77的位置处的天冬酰胺，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的G340的位置处的甘氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的E371的位置处的谷氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的A374的位置处的丙氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的T79的位置处的苏氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的S82的位置的丝氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的S299的位置处的丝氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的T301的位置处的苏氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的A336的位置处的丙氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的W364的位置处的色氨酸。
例如，在SEQ ID NO:7中，对应于SEQ ID NO:8的F372的位置是Y385；对应于SEQ IDNO:8的G373的位置是E386；对应于SEQ ID NO:8的N77的位置是D61；对应于SEQ ID NO:8的G340的位置是A352；对应于SEQ ID NO:8的E371的位置是Q384；对应于SEQ ID NO:8的A374的位置是Q387；对应于SEQ ID NO:8的T79位置是D63；对应于SEQ ID NO:8的S82的位置是A66；对应于SEQ ID NO:8的S299对应的位置是Q308；对应于SEQ ID NO:8的T301的位置是S310；对应于SEQ ID NO:8的A336的位置是S348；和对应于SEQ ID NO:8的W364的位置是F377。
更优选地，果糖基转移酶包括：
-对应于SEQ ID NO:8的F372的位置处的苯丙氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的G373的位置处的甘氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的N77的位置处的天冬酰胺，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的G340的位置处的甘氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的E371的位置处的谷氨酸，和/或
-对应于SEQ ID NO:8的A374的位置处的丙氨酸。
仍更优选地，果糖基转移酶包括对应于SEQ ID NO:8的F372的位置处的苯丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:8的G373的位置处的甘氨酸。
典型地，果糖基转移酶在水性溶液中是可溶的。溶解度可以表示为总平均亲水性(Grand Average of Hydropathy，GRAVY)评分，其可以基于果糖基转移酶的氨基酸序列来确定。GRAVY评分的计算对本领域的技术人员是常规的。GRAVY值典型地通过将每个残基的亲水性值相加(Kyte和Doolittle；J Mol Biol 1982 157(1):105-32)并且除以序列的长度来计算。GRAVY评分可以使用，例如在https://www.bioinformatics.org/sms2/protein_gravy.html中的免费可获得的软件容易地确定。典型地，用于本文提供的产品和方法的果糖基转移酶具有-0.4或比-0.4更负，例如最多-0.5，例如最多-0.6的溶解度GRAVY评分。实施例中提供了一些示例性果糖基转移酶的GRAVY评分。典型地，果糖基转移酶是具有-0.4或比-0.4更负的GRAVY评分的菊糖蔗糖酶。
典型地，本文提供的产品和方法中使用的果糖基转移酶来源于乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、链霉菌属、曲霉菌属或梭菌属的生物体。更典型地，果糖基转移酶来源于格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、琼脂芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜明串珠菌、绿色产色链霉菌、棘孢曲霉菌、聚多曲霉菌或丙酮丁醇梭菌物种的生物体。
本领域的技术人员会理解，提到蛋白质来源于给定的生物体是指讨论中的天然表达蛋白质的原始宿主生物体。提到蛋白质“来源于”特定的生物体不意味着蛋白质必须在这种生物体中实际表达。例如，经常使用适当的表达载体转化的表达生物体(例如大肠杆菌)来表达由其他生物体天然地产生的蛋白质。从业者参考了Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,NewYork(2012)；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement114),John Wiley&Sons,New York(2016)，以进一步讨论使用非天然表达系统以便产生蛋白质。果糖基转移酶的来源生物体可以基于序列的所需特性来选择。所需特性包括果糖基转移酶的活性、其在储存时的稳定性、其对蛋白酶的抗性等。蛋白酶抗性可以如实施例中的描述的来确定。
因此，例如，果糖基转移酶可来源于乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、链霉菌属、曲霉菌属或梭菌属的生物体；并且可以在生物体，例如埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属、毕赤酵母属、木霉菌属或曲霉菌属；优选地大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母、里氏木霉菌、黑曲霉菌或米曲霉菌的生物体中表达。果糖基转移酶可来源于格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、琼脂芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜明串珠菌、绿色产色链霉菌、棘孢曲霉菌、聚多曲霉菌或丙酮丁醇梭菌物种的生物体；并且可在生物体例如埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属、毕赤酵母属、木霉菌属或曲霉菌属，优选地大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母、里氏木霉菌、黑曲霉菌或米曲霉菌生物体中表达。果糖基转移酶可以来自乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、链霉菌属、曲霉菌属或梭菌属的生物体；并且可以在生物体，例如埃希氏菌或芽孢杆菌属的细菌或酵母菌属的酵母中表达。果糖基转移酶可来源于格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、琼脂芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜明串珠菌、绿色产色链霉菌、棘孢曲霉菌、聚多曲霉菌或丙酮丁醇梭菌物种的生物体；并且可在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母中表达。果糖基转移酶可来源于乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、链霉菌属、曲霉菌属或梭菌属的生物体；并且可在任何合适的GRAS生物体例如GRAS细菌、酵母或真菌，例如GRAS细菌或酵母中表达。
营养品组合物
如上所提及，在本文提供的方法的一个实施例中，将果糖基转移酶以营养品组合物的形式向受试者施用。本文也明确地提供了这种组合物本身。
本文使用的营养品组合物典型地包括果糖基转移酶，例如本文所述的果糖基转移酶和一种或多种营养学上可接受的填充剂、稳定剂、着色剂或调味剂。
用于营养品组合物的适合的赋形剂包括：
-填充剂，例如乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、植物纤维素、碳酸钙等；
-稳定剂，例如维生素A、C、E、硒、氨基酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；
-抗附着剂；
-粘合剂，例如乳糖、蔗糖、微晶纤维素、苹果醇、山梨醇、木糖醇、淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；
-稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；
-崩解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羧基乙酸淀粉钠；
-润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；
-染料和其他着色剂，例如FD&C蓝1号(亮蓝FCF)、FD&C蓝2号(靛蓝)、FD&C绿3号(固绿FCF)、FD&C红40号(诱惑红AC)、FD&C红3号(赤藓红)、FD&C黄5号(柠檬黄)、FD&C黄6号(日落黄)；
-调味剂，例如甜杏仁油、苯甲醛、DL-薄荷醇、乙酸乙酯、乙基香兰素、L-薄荷醇、水杨酸甲酯、薄荷油、薄荷精和香兰素；
-泡腾剂的混合物；
-甜味剂；以及
-润湿剂，例如卵磷脂、聚山梨酯和十二烷基硫酸盐；
任何上述赋形剂的任何合适的组合可用于本文提供和详细地描述的营养品组合。这种营养品制剂可以以已知的方式，例如，通过混合、粒化、压片、糖溶衣或膜包衣工艺的方法制造。
典型地，本文所述的营养品组合物被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。粉末可以通过例如冻干法(lyophilisation)的方式获得。
用于口服施用的液体分散体可以是糖浆剂、乳剂和混悬剂。糖浆剂可包含作为载体，例如糖或糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。混悬剂和乳剂可包含载体，例如天然胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。可配制糖浆剂来避免使用蔗糖。
营养品组合物配方的选择在本领域技术人员的能力范围内，并且可能取决于因素例如文化、社会或商业偏好、产品的最终消费者、任何特定食品目标等。
典型地，本文所述的营养品组合物适合用于向受试者口服施用。因此，本文公开的包括使用本文所述的营养品组合物的方法典型地包括向受试者口服施用该营养品组合物。
典型地，营养品组合物旨在将活性剂(即果糖基转移酶)释放到身体的适当部位，其中其在转化蔗糖中可以是活跃的。例如，营养品组合物可以在小胃肠道中，例如在小肠中释放活性果糖基转移酶。相应地，本文所述的营养品组合物可包括肠溶衣。可以使用本领域已知的任何合适的肠溶衣材料。合适的材料包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素(HMPC)和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基乙酸纤维素琥珀酸(羟丙纤维素乙酸酯琥珀酸、HMPAS)、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、紫胶(shellac)、乙酸纤维素偏苯三酸酯(cellulose acetate trimellitate)、海藻酸钠、玉米朊(zein)等。
典型地，营养品组合物作为膳食补充剂提供。组合物可以与使用说明一起作为试剂盒提供。组合物可以以补充剂的形式提供，在消化食物之前、之中或之后服用。
典型地，营养品组合物仅包括一般被认为安全的成分(GRAS)。组合物的成分典型地是食品级组分。
在适当的储存条件下，对于延长的一段时间，果糖基转移酶在营养品组合物中典型地是稳定的。例如，当在适当的条件下储存时，果糖基转移酶可以稳定超过1天、1个月、1年等。果糖基转移酶的必要稳定性可以基于其应用和其中提供的组合物的形式来确定，并且可以使用本领域已知的方法，包括使用高纯度试剂和在适当条件下储存来控制。
典型地，营养品组合物将含有高达85wt％的本文所述的果糖基转移酶。其可含有高达50wt％、高达40wt％、高达30wt％、高达20wt％或高达10wt％的果糖基转移酶。
典型地，营养品组合物在生理条件下，在约0.5小时至5小时内、例如在约1小时至3小时内、例如在约2小时内，可含有足够的果糖基转移酶，以产生约1g至约100g、例如约2g至约50g、例如约5g至约20g、例如约10g的果寡糖。因此，营养品组合物可包括每单位剂量约1mg至约10000mg的果糖基转移酶、例如约10mg至约1000mg、例如约50mg的果糖基转移酶。
营养品组合物可包括每单位剂量约1mg至约100mg、例如约2m至约50mg、例如约5mg至约20mg、例如约7mg至约15mg、例如约10mg的果糖基转移酶。
营养品组合物可以能够在生理条件下，在约1分钟至约1小时内，例如在约10分钟至约45分钟内，例如在约15分钟至约30分钟内，可以能够作用于约1％至约100％(例如％w/w或％w/v)、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的蔗糖分子。
本领域的技术人员理解，“可用的果糖”代表待转化的蔗糖中存在的果糖。如本文所解释的，每个蔗糖分子包括一个葡萄糖单位和一个果糖单位，使得100％可用的果糖单体单位的转化相当于并入50％单体单位的蔗糖。因此，根据第一种近似方法(对果糖基转移酶生成的果寡糖上末端葡萄糖单位进行折算)，样品中存在的所有蔗糖分子的100％的转化率相当于蔗糖中糖类单位的50％转化(果糖单位的100％转化/并入)。
因此，营养品组合物在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，可以能够将约1％至约100％、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的果糖转化为/并入果寡糖。换句话说，本文提供的营养品组合物在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，可以能够将约1％至约50％、例如约1％至约40％、例如约5％至约30％、例如约10％至约20％的可用的蔗糖中存在的糖类单位转化为/并入果寡糖。
可以将营养品组合物以任何合适的施用频率向受试者施用。例如，营养品组合物可以以每天至少一次、例如一天约1次和约20次之间、例如一天约1次和约10次之间、例如一天2次和5次之间、例如一天约3次或4次施用。
典型地，在非治疗性方法中使用营养品组合物。相应地，本文提供了本文所述的营养品组合物在减少受试者的果糖摄取；经蔗糖代谢来减少形成果糖；减少葡萄糖的摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)中的用途。还提供了减少受试者的果糖摄取；经蔗糖代谢来减少形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)，其包括向受试者施用本文所述的营养品组合物。进一步提供了用于减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)的本文所述的营养品组合物。还进一步提供了一种本文所述的分离的果糖基转移酶在制造用于(典型地非治疗性)减少果糖的摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖的摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的本文所述的营养品组合物中的用途。本文更详细地描述了这种方法和用途。
药物组合物
在本文提供的方法的另一个实施例中，将果糖基转移酶以药物组合物的形式向受试者施用。本文也明确提供了这种组合物本身。
本文使用的药物组合物典型地包括果糖基转移酶，例如本文所述的果糖基转移酶和一种或多种药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在药物组合物中用于这种用途的合适组分包括：
-填充剂，例如乳糖、蔗糖、硬脂酸镁、葡萄糖、植物纤维素、碳酸钙等；
-稳定剂，例如维生素A、C、E、硒、氨基酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；
-抗附着剂；
-粘合剂，例如乳糖、蔗糖、微晶纤维素、苹果醇、山梨醇、木糖醇、淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；
-稀释剂，例如乳糖、右旋糖、糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；
-崩解剂，例如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或羧基乙酸淀粉钠；
-润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；
-染料和其他着色剂，例如FD&C蓝1号(亮蓝FCF)、FD&C蓝2号(靛蓝)、FD&C绿3号(固绿FCF)、FD&C红40号(诱惑红AC)、FD&C红3号(赤藓红)、FD&C黄5号(柠檬黄)、FD&C黄6号(日落黄)；
-调味剂，例如甜杏仁油、苯甲醛、DL-薄荷醇、乙酸乙酯、乙基香兰素、L-薄荷醇、水杨酸甲酯、薄荷油、薄荷精和香兰素；
-泡腾剂的混合物；
-甜味剂；以及
-润湿剂，例如卵磷脂、聚山梨酯和十二烷基硫酸盐；
任何上述赋形剂的任何合适的组合可用于本文提供和详细地描述的药物组合物。这种药物制剂可以以已知的方式，例如，通过混合、粒化、压片、糖溶衣或膜包衣工艺的方法制造。
典型地，本文所述的药物组合物被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。粉末可以通过例如冻干法(lyophilisation)的方式获得。
用于口服施用的液体分散体可以是糖浆剂、乳剂和混悬剂。糖浆剂可包含作为载体，例如糖或糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。混悬剂和乳剂可包含载体，例如天然胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。可配制糖浆剂来避免使用蔗糖。
典型地，本文所述的药物组合物适合用于向受试者口服施用。因此，本文公开的包括使用本文所述的药物组合物的方法典型地包括向受试者口服施用该药物组合物。
典型地，药物组合物旨在将活性剂(即果糖基转移酶)释放到身体的适当部位，其中其在转化蔗糖中可以是活跃的。相应地，本文所述的药物组合物可包括肠溶衣。可以使用本领域已知的任何合适的肠溶衣材料。合适的材料包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、醋酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素(HMPC)和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基乙酸纤维素琥珀酸(羟丙纤维素乙酸酯琥珀酸、HMPAS)、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、紫胶、乙酸纤维素偏苯三酸酯、海藻酸钠、玉米朊等。
在适当的储存条件下，对于延长的一段时间，果糖基转移酶在药物组合物中典型地是稳定的。例如，当在适当的条件下储存时，果糖基转移酶可以稳定超过1天、1个月、1年等。果糖基转移酶的必要稳定性可以基于其应用和其中提供的组合物的形式来确定，并且可以使用本领域已知的方法，包括使用高纯度试剂和在适当条件下储存来控制。
优选地，药物组合物是无菌的和无热原的。
典型地，药物组合物将含有高达85wt％的本文所述的果糖基转移酶。其可含有高达50wt％、高达40wt％、高达30wt％、高达20wt％或高达10wt％的果糖基转移酶。
典型地，药物组合物在生理条件下，在约0.5小时至5小时内、例如在约1小时至3小时内、例如在约2小时内，可含有足够的果糖基转移酶，以产生约1g至约100g、例如约2g至约50g、例如约5g至约20g、例如约10g的果寡糖。因此，药物组合物可包括每单位剂量约1mg至约1000mg的果糖基转移酶、例如约10mg至约1000mg、例如约50mg至约500mg的果糖基转移酶。
药物组合物可包括每单位剂量约1mg到约100mg、例如约2mg到约50mg、例如约5mg到约20mg、例如约7mg到约15mg、例如约10mg的果糖基转移酶。
药物组合物可以能够在生理条件下，在约1分钟至约1小时内，例如在约10分钟至约45分钟内，例如在约15分钟至约30分钟内，可以能够作用于约1％至约100％(例如％w/w或％w/v)、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的(例如过量的)蔗糖。因此，药物组合物在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，将约1％至约100％、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的(例如过量的)果糖转化为/并入果寡糖。换句话说，本文提供的药物组合物可以能够在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，将约1％至约50％、例如约1％至约40％、例如约5％至约30％、例如约10％至约20％(例如过量的)的可用的蔗糖中存在的糖类单位转化为/并入果寡糖。
可以将药物组合物以任何合适的施用频率向受试者施用。例如，药物组合物可以以每天至少一次、例如一天约1次和约20次之间、例如一天约1次和约10次之间、例如一天2次和5次之间、例如一天约3次或4次施用。
本文还提供了本文所述的组合物，例如本文所述的药物组合物，用于药物。
典型地，在治疗性方法中使用药物组合物。相应地，本文提供了用于减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖的摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的方法的本文所述的药物组合物。还提供了减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的方法(例如治疗性方法)，其包括向受试者施用本文所述的药物组合物。还进一步提供了一种本文所述的分离的果糖基转移酶在制造用于(典型地治疗性)减少果糖的摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖的摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲和/或增加饱腹感的本文所述的药物组合物中的用途。本文更详细地描述了这种方法和用途。
食物组合物和食品
本文还提供了包括本文所述的果糖基转移酶的食物组合物。在本文这种食物组合物也被称为食品。这种组合物可以按照本文提供的方法和用途向受试者施用。
本文所述的食物组合物或食品典型地包括果糖基转移酶，例如本文所述的果糖基转移酶和一种或多种碳水化合物、脂肪、脂质、调味剂、着色剂等。
本文所述的食物组合物和食品可包括：
-糖来源，例如玉米糖、右旋糖、果糖、葡萄糖、果糖葡萄糖糖浆(high-fructoseglucose syrup)、蜂蜜、枫糖浆、龙舌兰糖浆(agave syrup)、转化糖(invert sugar)、异类葡萄糖(isoglucose)、左旋糖、麦芽糖、糖蜜和蔗糖；
-淀粉来源，例如玉米、木薯、红薯、小麦(例如作为面粉，例如以面包或意大利面的形式)、土豆、高粱、大麦、大米等；
-水果，例如阿萨伊苹果、杏、鳄梨、香蕉、越桔(bilberry)、黑莓、黑加仑(blackcurrant)、蓝莓、波森莓(boysenberry)、樱桃、云莓(cloudberry)、山楂(crabapple)、蔓越莓(cranberry)、西洋李子(damson)、枣(date)、火龙果(dragonfruit)、榴莲(durian)、接骨木果(elderberry)、无花果(fig)、枸杞(goji berry)、醋栗莓(gooseberry)、葡萄、葡萄柚(grapefruit)、番石榴(guava)、菠萝蜜(jackfruit)、红枣(jujube)、猕猴桃(kiwifruit)、金橘(kumquat)、柠檬、酸橙(lime)、洛根莓(loganberry)、荔枝(lychee)、芒果、甜瓜(melon)、桑葚(mulberry)、油桃(nectarine)、橙子、小柑橘(clementine)、柑桔(mandarine)、橘子(tangerine)、木瓜(papaya)、西番莲(passionfruit)、巴婆果(pawpaw)、桃、梨、柿子(persimmon)、芭蕉(plantain)、李子(plum)、菠萝(pineapple)、石榴(pomegranate)、柚子(pomelo)、木梨(quince)、覆盆子(raspberry)、红加仑(redcurrant)、无核小蜜橘(satsuma)、酸角(tamarind)、柚子(yuzu)等；
-蔬菜，例如朝鲜蓟(artichoke)、茄子(aubergine)、芦笋(asparagus)、豆芽(beansprouts)、豆类(beans)、鹰嘴豆(chickpeas)、扁豆(lentils)、豌豆(peas)、西兰花(花茎甘蓝)(broccoli(calabrese))、抱子甘蓝(brussels sprouts)、卷心菜、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、莴苣(endive)、茴香(fennel)、绿叶蔬菜，例如小白菜(bokchoy)、甜菜(甜菜叶)(chard(beet greens))、芥蓝菜(collard greens)、羽衣甘蓝(kale)、芥菜(mustard greens)、生菜(lettuce)、蘑菇(mushrooms)、秋葵(okra)、洋葱(onions)、韭黄(chives)、大蒜(garlic)、韭菜(leek)、红葱(shallot)、葱(scallion)、辣椒、大黄茎(rhubarb)、甜菜根(beetroot)、胡萝卜、块根芹(celeriac)、芋头(taro)、生姜、欧洲防风草(parsnip)、芜菁甘蓝(rutabaga)、小萝卜(radish)、土豆、红薯(sweet potato)、山药(yam)、芜菁(turnip)、甜玉米、南瓜(squash)、小胡瓜(courgette)、黄瓜(cucumber)、番茄、水田芥(watercress)等。
-坚果和种子，例如杏仁(almonds)、巴西坚果、腰果(cashew nuts)、榛子(hazelnuts)、夏威夷果(macadamias)、美洲山核桃(pecans)、松子(pine nuts)、开心果(pistachios)、核桃(walnuts)、花生(peanuts)、南瓜籽(pumpkin seeds)、亚麻籽(flaxseeds)、芝麻(sesame seeds)、罂粟籽(poppy seeds)、葵花籽、车前草籽(psyllium seeds)和奇亚籽(chia seeds)。
-脂肪和脂质，例如植物脂肪(例如可可脂、玉米油、葵花籽油、大豆油、棉花油、花生油、橄榄油、菜籽油(canola oil)、南瓜籽油(pumpkin seed oil)、红花油(saffloweroil)、葡萄籽油、芝麻油糠油(sesame oil bran oil)、摩洛哥坚果油(argan oil)、棕榈油(palm oil)、亚麻籽油(linseed oil)、椰子油)和动物脂肪(例如猪油(lard)、牛油(tallow)和乳脂(butterfat)，以及鱼油，例如鱼肝油(cod liver oil)和鲑鱼油(salmonoil))；
-动物产品，例如肉、鱼和蛋。
-染料和其他着色剂，例如FD&C蓝1号(亮蓝FCF)、FD&C蓝2号(靛蓝)、FD&C绿3号(固绿FCF)、FD&C红40号(诱惑红AC)、FD&C红3号(赤藓红)、FD&C黄5号(柠檬黄)、FD&C黄6号(日落黄)；
-调味剂，例如甜杏仁油、苯甲醛、DL-薄荷醇、乙酸乙酯、乙基香兰素、L-薄荷醇、水杨酸甲酯、薄荷油、薄荷精和香兰素；
-甜味剂，例如阿洛酮糖(allulose)、安赛蜜钾(acesulfame potassium)、阿斯巴甜(aspartame)、甜蜜素(cyclamate)、罗汉果甜苷(mogrosides)、糖精(saccharin)、甜菊糖苷(甜菊)(steviol glycosides(stevia))、三氯蔗糖(sucralose)和糖醇(sugaralcohols)。
示例性的食品包括糖果例如巧克力、甜点例如冰淇淋、冰激凌、冰糕、酸奶、芝士蛋糕、法兰(flan)、蛋挞(tarts)、烘焙食物例如蛋糕、糕点和馅饼(甜的和咸的二者)，面包制品等。
优选地，食品包括蔗糖。
典型地，将本文所述的食品口服施用至受试者。因此，本文公开的包括使用本文所述的食品的方法典型地包括向受试者施用食品。
典型地，配制的食品旨在将活性剂(即果糖基转移酶)释放到身体的适当部位，其中其在转化蔗糖中可以是活跃的。例如，食品可被配制成在小胃肠道，例如在小肠和/或胃中释放活性果糖基转移酶。
食品可以配置成使得其中包括的果糖基转移酶在食品被消化之前被阻止作用于食品中的任何蔗糖。这可以通过以下方式实现：将果糖基转移酶封装，使得其在食品被消化之前不能接触蔗糖；将包括果糖基转移酶的食品的部分与包括蔗糖的食品的部分物理地分离；或将食品配制成具有在食品被消化之前与显著的蔗糖转化的不适宜的状态。可替选地，果糖基转移酶可以被配制或选择，使得其在体外具有低活性，但在体内具有高活性，例如通过选择或修饰果糖基转移酶，使得其具有pH或温度依赖性活性，其中活性pH或温度在体内，例如在小肠中提供，但在食品消化之前不提供食品。
典型地，食物组合物或食品仅包括一般被认为安全的成分(GRAS)。
在适当的储存条件下，对于延长的一段时间，果糖基转移酶在食品中典型地是稳定的。例如，当在适当的条件下储存时，果糖基转移酶可以稳定超过1天、1个月、1年等。储存食品的合适条件可以包括温度，例如-25℃至-15℃，例如-20℃至-18℃(例如，对于以冷冻形式销售的食品例如冰淇淋、冰激凌、冰糕和其他)；温度，例如约0℃至约10℃，例如约4℃至约7℃(例如，例如，对于以冷藏形式销售的食品，例如酸奶和冷藏甜点)；或温度，例如约15℃至约25℃，例如约18℃至约20℃(例如，对于典型地在环境温度下销售的食品，例如巧克力和烘焙食物、例如蛋糕和糖果)。储存食品的合适条件包括在有氧条件下(例如在存在空气的情况下)或无氧条件下(例如在惰性，例如氮气环境下)。食品可以以锡纸、包、盒、袋或任何其他合适的容器的形式提供。
果糖基转移酶的必要稳定性可以基于其应用和其中提供的组合物的形式来确定，并且可以使用本领域已知的方法，包括使用高纯度试剂和在适当条件下储存来控制。
典型地，食品将含有高达10wt％的本文所述的果糖基转移酶。其可含有高达5wt％、高达4wt％、高达3wt％、高达2wt％或高达1wt％的果糖基转移酶。
典型地，食品在生理条件下，在约0.5小时至5小时内、例如在约1小时至3小时内、例如在约2小时内，可含有足够的果糖基转移酶，以产生约1g至约100g、例如约2g至约50g、例如约5g至约20g、例如约10g的果寡糖。
因此，食品可包括每人份约0.1mg至约1000mg的果糖基转移酶、例如约1mg至约100mg、例如约10mg至约50mg的果糖基转移酶。食品可包括每人份约1mg到约100mg、例如约2mg到约50mg、例如约5mg到约20mg、例如约7mg到约15mg、例如约10mg的果糖基转移酶。
食品可以能够在生理条件下，在约1分钟至约1小时内，例如在约10分钟至约45分钟内，例如在约15分钟至约30分钟内，可以含有足够的果糖基转移酶，以作用于约1％至约100％(例如％w/w或％w/v)、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的蔗糖(例如食品中的蔗糖分子)。因此，食品在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，可含有足够的果糖基转移酶，其能够将约1％至约100％、例如约1％至约80％、例如约5％至约50％、例如约10％至约40％、例如约20％至约30％的可用的果糖(例如食品中可用的果糖)转化为果寡糖。换句话说，本文提供的食品在生理条件下，在约1分钟至约1小时内、例如在约10分钟至约45分钟内、例如在约15分钟至约30分钟内，可含有足够的果糖基转移酶，以能够将约1％至约50％、例如约1％至约40％、例如约5％至约30％、例如约10％至约20％的可用的蔗糖(例如食品中的蔗糖)中存在的糖类单位转化为果寡糖。
受试者可消化本文所述的食品，一天约1次和约20次之间、例如一天2次和5次之间、例如一天约3次或4次。
典型地，在非治疗性背景下消化食品。相应地，本文提供了本文所述的食品在减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖的摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲；和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)中的用途。还提供了减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲；和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)，其包括向受试者施用本文所述的食品。进一步提供了本文所述的食品用于减少受试者的果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲；和/或增加饱腹感的方法(例如非治疗性方法)。还进一步提供了一种本文所述的分离的果糖基转移酶用于在制造用于(典型地非治疗性)减少受试者果糖摄取；减少经蔗糖代谢形成果糖；减少葡萄糖摄取和/或减少经蔗糖代谢形成葡萄糖；产生果寡糖；抑制食欲；和/或增加饱腹感的本文所述的食品中的用途。本文更详细地描述了这种方法和用途。
治疗性和非治疗性功效
本文所述的果糖基转移酶有益于减少果糖摄取和减少经蔗糖的代谢形成葡萄糖和果糖。因此，它们可用于控制受试者在消化食物例如糖后所吸收的能量。
相应地，如本文更详细地描述的，提供了一种减少受试者的果糖摄取的体内方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。典型地，方法是非治疗性方法。典型地，依照本文提供的方法非治疗性使用分离的果糖基转移酶不包括通过手术或疗法治疗人体或动物体。还提供了一种分离的果糖基转移酶，用于减少受试者体内的果糖摄取。还提供了一种分离的果糖基转移酶，用于制造减少受试者体内的果糖摄取的试剂。
如本文更详细地描述的，提供了一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖的体内方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。典型地，该方法是非治疗性方法。典型地，依照本文提供的方法非治疗性使用分离的果糖基转移酶不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体。还提供了一种分离的果糖基转移酶，用于减少经受试者蔗糖代谢形成果糖。进一步提供了一种分离的果糖基转移酶，用于制造减少经受试者体内蔗糖代谢形成果糖的试剂。
然而，本文所述的果糖基转移酶还具有其他治疗性和非治疗性用途。
在一个方面中，施用分离的果糖基转移酶可用于抑制受试者的食欲和/或增加饱腹感。先前已显示外源菊糖通过控制食欲对体重管理具有有益的影响(例如，参见https://doi.org/10.1186/s12986-015-0033-2上得到的Guess等,Nutrition&Metabolism 12 36(2015))。本发明人已经认识到，类似的有益效果将由按照本文提供的方法在体内产生菊糖和相关的果寡糖引起。在不受理论约束的情况下，提出一种抑制食欲的机制是刺激果寡糖产生肽YY。肽YY也被称为肽酪氨酸，并且是由回肠和结肠的细胞释放的短的(36个氨基酸)肽，对进食有反应。在血液、肠道和其他外周元素(element)中，PYY起到降低食欲的作用；相似地，当直接注入中枢神经系统时，PYY也是减少食欲的(Woods S.C.；D'Alessio D.A.(2008).“Central control of body weight and appetite”.J Clin EndocrinolMetab.93(11Suppl 1):S37-50)。
相应地，本文提供了一种抑制受试者的食欲的方法，其包括向受试者施用本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物。还提供了一种增加受试者的饱腹感的方法，其包括向受试者施用本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物。典型地这种方法是非治疗性方法。还提供了本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物，用于抑制受试者的食欲。还提供了本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物，用于增加受试者的饱腹感。进一步提供了一种本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物在制造用于抑制受试者的食欲的试剂中的用途。还提供了一种本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物在制造用于增加受试者的饱腹感的试剂中的用途。
可以将果糖基转移酶为美容目的向受试者施用。这种目的可以包括将果糖基转移酶非治疗性施用至希望改善其身体外观的受试者。例如，在一个实施例中，本文提供了一种改善受试者的身体外观的方法(例如非治疗性和/或美容的方法)，其包括以一定量向受试者口服施用本文所述的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物，来降低受试者的食欲和/或增加饱腹感，并且重复所述施用，直到出现美容上理想的体重减轻。
用于这种方法和用途的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物或食品。典型地，可以向受试者口服使用分离的果糖基转移酶或组合物。
在另一方面中，施用分离的果糖基转移酶可用于治疗或预防代谢综合征。代谢综合征是以下五种病症中至少三种的集合：腹部肥胖、高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)。代谢综合征与发展心血管疾病和2型糖尿病的风险有关。代谢综合征可以通过存在糖尿病、糖耐量受损、空腹血糖受损或胰岛素抵抗的任何一项，以及以下两项来诊断：
-血压≥140/90mmHg
-血脂异常：甘油三酯(TG)≥1.695mmol/L和HDL胆固醇≤0.9mmol/L(男性)，≤1.0mmol/L(女性)
-向心性肥胖：腰：臀比例>0.90(男性)；>0.85(女性)，或BMI>30kg/m2
-微量白蛋白尿：尿白蛋白排泄比≥20μg/min或白蛋白：肌酐比例≥30mg/g。
过量的蔗糖消耗和代谢与代谢综合征有关(例如，参见Malik等,Diabetes Care2010 33(11)2477-2483)。在不受理论约束的情况下，相信通过降低可用于代谢的蔗糖的浓度，代谢综合征可以通过按照本文提供的方法施用分离的果糖基转移酶来解决。
相应地，本文提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的代谢综合征。还提供了一种治疗或预防需要其的受试者的代谢综合征的方法，方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物。进一步提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物在制造治疗受试者的代谢综合征的药物中的用途。这种方法和用途中使用的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物。典型地，向受试者口服施用分离的果糖基转移酶或组合物。
当应用于非治疗性方法和用途时，可将果糖基转移酶施用于受试者，其不患有和/或不处于患有以下的风险：代谢综合征(例如不患有和/或不处于患有腹部肥胖、高血压(例如≥140/90mmHg)、高血糖、高血清甘油三酯(例如≥1.695mmol/L)、低血清高密度脂蛋白(HDL)(例如≤0.9mmol/L(男性)，≤1.0mmol/L(女性)的风险)，心血管疾病，2型糖尿病，糖尿病(diabetes mellitus)，糖耐量受损，空腹血糖受损或胰岛素抵抗，血压升高，血脂异常；向心性肥胖(例如，腰：臀比>0.90(男性)；>0.85(女性)，或BMI>30kg/m2)和/或微量白蛋白尿(例如尿白蛋白排泄比≥20μg/min或白蛋白：肌比≥30mg/g))。
本文提供了一种维持健康受试者的健康的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，可选地以本文所述的组合物形式。还提供了一种分离的果糖基转移酶，可选地以本文所述组合物的形式，用于维持健康个体的健康。
过量的蔗糖消耗和代谢也与肥胖直接有关。如果受试者具有超过30kg/m2的体重指数(BMI)(定义为受试者的体重除以其身高的平方)，则可认为受试者肥胖。如果受试者具有25kg/m2和30kg/m2之间的BMI，则可认为受试者超重。在不受理论约束的情况下，相信通过降低可用于代谢的蔗糖的浓度，肥胖症可以通过按照本文提供的方法施用分离的果糖基转移酶来解决。如本文使用的，解决或治疗肥胖症可包括解决或治疗具有超过30kg/m2的BMI或25kg/m2和30kg/m2之间的BMI的受试者。
相应地，本文提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的肥胖症。还提供了一种治疗或预防需要其的受试者的肥胖症的方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物。进一步提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物在制造用于治疗受试者的肥胖症的药物中的用途。这种方法和用途中使用的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物。典型地，向受试者口服施用分离的果糖基转移酶或组合物。
当应用于非治疗性方法和用途时，果糖基转移酶可被施用至不超重和/或不肥胖的受试者。例如，在本文提供的非治疗性方法和用途中，可以将果糖基转移酶施用至具有低于约30kg/m2，例如低于约25kg/m2的BMI的受试者。
糖尿病是与体内过量蔗糖水平有关的另一种疾病。糖尿病通常与胰岛素缺乏有关。1型糖尿病是由于自身免疫反应引起的β细胞丧失而导致胰腺产生的胰岛素减少的结果。2型糖尿病是由胰岛素抵抗引起的。妊娠糖尿病是另一种形式的糖尿病。在不受理论约束的情况下，相信按照本文提供的方法施用分离的果糖基转移酶可以降低体内蔗糖水平，并且因此对治疗或预防糖尿病具有益的影响。按照本文提供的方法施用分离的果糖基转移酶也可以有益地降低如本文所述的体内葡萄糖水平。
相应地，本文提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的糖尿病。还提供了一种治疗或预防需要其的受试者的糖尿病的方法，该方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物。进一步提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物在制造用于治疗受试者的糖尿病的药物中的用途。通常，糖尿病是2型糖尿病。这种方法和用途中使用的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物。典型地，向受试者口服施用分离的果糖基转移酶或组合物。
当应用于非治疗性方法和用途时，可以将果糖基转移酶施用至没有患糖尿病和/或没有患糖尿病风险的受试者。可以向具有约4mM至约5.5mM或约6mM的空腹血糖水平和/或低于约7.8mM的餐后(例如餐后90分钟)血糖水平的受试者施用果糖基转移酶。在一些实施例中，不可以向具有4-7mM，例如超过约6mM的空腹血糖水平，和/或超过7.8mM的餐后(例如餐后90分钟)血糖水平的受试者施用果糖基转移酶。
另一种与体内过量蔗糖水平有关的病症是非酒精性脂肪肝疾病。食用蔗糖产生的高果糖水平通过刺激肝脏中的新脂肪生成和减少脂肪的β-氧化来促进肝脏中的脂肪积累。此外，果糖激酶迅速代谢果糖，导致肝脏中细胞内ATP水平降低，这可能会增加氧化应激(oxidative stress)，损害蛋白质合成和线粒体肝功能。按照所公开的方法施用分离的果糖基转移酶减少人体吸收的果糖水平，并且因此对治疗或预防非酒精性脂肪肝疾病具有有益影响。
相应地，本文提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的非酒精性脂肪肝疾病。还提供了一种治疗或预防需要其的受试者的非酒精性脂肪肝疾病的方法，方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物。进一步提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物在制造用于治疗受试者的非酒精性脂肪肝疾病的药物中的用途。这种方法和用途中使用的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物。典型地，向受试者口服施用分离的果糖基转移酶或组合物。
当应用于非治疗性方法和用途时，可以将果糖基转移酶施用至没有患有非酒精性脂肪肝疾病和/或没有患有非酒精性脂肪肝疾病风险的受试者。
另一种使用分离的果糖基转移酶治疗的病症是便秘。便秘是最常见的健康障碍之一，尤其是在老年人群中。菊糖是人不能消化的，并且其在结肠中的发酵可以导致细菌细胞数量的增加和消化物中更高的水含量，其有助于肠道功能。相应地，按照所公开的方法施用分离的果糖基转移酶促进菊糖产生，并且因此对治疗或预防便秘具有有益影响。
相应地，本文提供了一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物，用于治疗或预防需要其的受试者的便秘。还提供了一种治疗或预防需要其的受试者的便秘的方法，该方法包括向受试者施用一种分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物。进一步提供了分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的药学上可接受的组合物在制造用于治疗受试者的便秘的药物中的用途。这种方法和用途中使用的组合物可以是本文所述的营养品或药物组合物。典型地，向受试者口服施用分离的果糖基转移酶或组合物。
当应用于非治疗性方法和用途时，可以向没有患有便秘和/或处于患有便秘风险的受试者施用果糖基转移酶。
本文提供的方法和用途(特别是本文所述的治疗性方法和用途)可以包括将分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物与一种或多种另外的疗法或组合物一起施用。例如，果糖基转移酶或组合物可与治疗肥胖症的常规疗法一起施用。这种试剂包括奥利司他(orlistat)、氯卡色林(lorcaserin)、利拉鲁肽(liraglutide)、芬特明-托吡酯(phentermine-topiramate)、二甲双胍(metformin)和纳曲酮-安非他酮(naltrexone-bupropion)。在单独配制的情况下，可以将这两种试剂同时地或单独地施用。它们可以以试剂盒，可选地与它们的使用说明一起的形式提供。
可替选地或另外地，将本文提供的果糖基转移酶或组合物施用至正在或已经接受手术，例如通过胃囊带术(gastric banding)治疗的受试者。例如，受试者可能已经接受了腹腔镜可调节胃束带术(laparoscopic adjustable gastric banding)、胃旁路术(Roux-en-Y gastric bypass)、垂直袖状胃胃切除术(vertical-sleeve gastrectomy)或胆胰转流术(biliopancreatic diversion)。
如本文所述的，可以将本文提供的分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物施用至任何合适的受试者。
在一方面中，受试者是哺乳动物，特别是人。然而，其也可以是非人类的。优选的非人类动物包括但不限于灵长类动物，例如狨猴(marmosets)或猴子，商业化养殖的动物，例如马、牛、羊或猪，和宠物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠(guinea pigs)、雪貂(ferrets)、沙鼠(gerbils)或仓鼠(hamsters)。
受试者可能是超重或肥胖的。例如，人类受试者可能具有超过25kg/m2、超过30kg/m2；或超过35kg/m2的BMI。受试者可以是男性或女性。受试者的年龄约10岁至约80岁，例如约16岁或约18岁至约65岁；例如约20岁至约60岁，例如约25岁至约55岁，例如约30岁到约50岁。受试者可以具有任何种族或遗传背景。
可以将本文所述的试剂施用至受试者，以便防止一种或多种病理症状，例如肥胖症或代谢综合征的症状的发生或复发。这是预防。在本实施例中，受试者可以是无症状的。受试者典型地是处于肥胖症或代谢综合征风险的人。向这种受试者施用预防有效量的试剂或制剂。预防性有效量是防止肥胖症或代谢综合征的一种或多种症状发生的量。
可以向受试者施用本文所述的试剂，以便治疗一种或多种病理症状，例如症状或肥胖症或代谢综合征。在本实施例中，受试者典型地是有症状的。向这种受试者施用治疗有效量的试剂或制剂。治疗有效量是有效改善疾病的一个或多个症状的量。
试剂(即分离的果糖基转移酶或包括分离的果糖基转移酶的组合物)可以以各种剂型施用。典型地，它是口服施用的，例如片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。本文更详细地描述了这种制剂。
然而，对于某些应用，试剂也可以不经肠道，无论是皮下地、静脉地、肌肉地、胸骨内地(intrasternally)、经皮地或通过输注技术(infusion techniques)施用。用于吸入、注射或输注的溶液可含有例如无菌水作为载体，或优选地它们可以以无菌的、水性的、等渗盐溶液的形式。也可使用适合于通过无针注射，例如经皮地注射递送的药物组合物。
试剂也可作为栓剂施用。
在某些情况下，试剂可以经吸入施用。制剂可以配制成溶液或混悬剂，用于吸入(气溶胶)施用。本发明的化合物、组合物或组合可通定量吸入器(metered dose inhaler，MDI)或雾化器，例如电子或喷射雾化器(jet nebulizer)施用。可替选地，本发明的化合物、组合物或组合可以配制成粉末状药物，用于吸入施用，这种制剂可以通过干粉吸入器(drypowder inhaler，DPI)施用。当配制成用于吸入施用时，本发明的化合物、组合物或组合可以以颗粒的形式递送，其具有1μm至100μm，优选地1μm至50μm，更优选地1μm至20μm，例如3μm至10μm，例如4μm至6μm的总气体动力学中位数直径(mass median aerodynamic diameter，MMAD)。当本发明的化合物、组合物或组合以雾化的气溶胶(nebulized aerosol)形式递送时，提到的颗粒直径定义了气溶胶的液滴的MMAD。MMAD可以通过任何合适的技术例如激光衍射(laser diffraction)来测量。
在使用中，向受试者施用治疗性或预防性有效量的试剂。可以根据各种参数，尤其是根据所使用的试剂；待治疗受试者的年龄、体重和状况；施用途径；和所需疗程确定剂量。医生或营养师将能够确定任何特定受试者所需的施用途径和剂量。根据特别的试剂或抑制剂的活性，待治疗受试者的年龄、体重和状况，疾病的类型和严重程度以及施用频率和途径，典型的每日剂量是约0.01mg/kg至100mg/kg，优选地约0.1mg/kg至50mg/kg，例如约1mg/kg至10mg/kg的体重。优选地，每日剂量水平是5mg至2g。
在治疗性和非治疗性方法和用途二者中，待施用的试剂的量足以将生理上有用量的蔗糖转化为果寡糖。例如，尽管受试者之间的小肠体积变化相当大，但典型地体积是在150至250mL的区域内，例如大约180mL。可以施用足够的试剂以导致约10至100μg/mL，例如约20至约70μg/mL，例如约50μg/mL的小肠浓度(small intestinal concentration)。例如，可以施用约1mg至约100mg，例如约2mg至约50mg，例如约5mg至约20mg，例如约10mg的剂量。
应当理解，尽管本文已经讨论了根据本发明的方法的特定实施方式、具体配置以及材料和/或分子，但在不背离本发明的范围和精神的情况下，可以进行形式和细节上的各种改变或修饰。提供以下实施例以更好地说明特定实施例，并且它们不应该被认为是对本申请的限制。特别地，有许多测定方法用于评估果寡糖的形成、酶的活性等，并且因此任何特定测定的阴性结果都不是决定性的。
实施例
在实施例中，提到SEQ ID NO:4、5、6、7、9和10是指4a、5a、6a、7a、9a和10a的多肽。换句话说，提到SEQ ID NO:4、5、6、7、9和10是指减去信号肽的多肽序列。
实施例1：表达果糖基转移酶候选物的细胞生长
在37℃，将产生SEQ ID NO:4、5或7的蛋白质的用pAVE1(pET28a(+)衍生的表达质粒)转化的大肠杆菌BL21(DE3)lacIQ细胞在LB培养基中生长，直到达到0.6的OD600。用0.1mMIPTG诱导培养物，将其移至28℃，并且另外培养12h。
在28℃，将产生SEQ ID NO:1、2、3、6、8、9或10的蛋白质的用pAVE1转化的大肠杆菌BL21(DE3)lacIQ细胞在复合自动诱导培养基中生长26小时15分钟。
实施例2：候选酶的纯化
用商购获得的Protino Ni-IDA2000试剂盒纯化候选酶。200mL(SEQ ID NO:1/2/3/5/6/8/9/10)或400mL(SEQ ID NO:4/7)培养物如以上所述进行生长，在4℃以4,500RPM离心15min收获。解冻细胞沉淀并且重新悬浮于每克细胞沉淀的5mL LEW缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，使用NaOH调节到pH 8)。将苯基甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)添加到0.2mM。将细胞悬浮液在70％振幅下超声处理15秒脉冲和15秒中断的5个周期。裂解液在4℃以15,000RPM离心30min，并且通过0.2μm膜过滤，然后将上清液添加到LEW缓冲液平衡的Protino Ni-IDA2000柱。用2x 4mL LEW洗涤缓冲液洗涤蛋白结合柱，然后用3x 3mL洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，使用NaOH将pH调节至8.0)洗脱。使用Amicon离心过滤器通过五轮离心将洗脱液交换到pH 7.0的50mM磷酸二氢钾缓冲液中。每轮离心在4℃以4,500RPM进行20分钟。最后，将纯化的蛋白质补充到10％的甘油中并且在-20℃储存。纯度通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行测定。使用ImageJ和三种定义的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)标准品，通过凝胶密度测定法对纯化的蛋白质的浓度进行定量。
实施例3：果糖基转移酶初始活性筛选
选择SEQ ID NO:1-10的果糖基转移酶(FTase)(菊糖蔗糖酶或果聚糖蔗糖酶)，用于分析。对FTase最初在细胞裂解液中进行活性筛选。
在细胞裂解物中测定蔗糖消化是确定酶活性的一种快速方法。将用pAVE1编码的FTase转化的大肠杆菌BL21(DE3)lacIQ在20、28或37℃，在深孔板的500μl LB、最小自动诱导或复合自动诱导培养基中生长6、12或24h(诱导后，自动诱导培养物在近似135min后达到OD600＝0.6)。通过在4℃，以4,500RPM离心15min来收获细胞。将细胞沉淀重新悬浮于160μlSIF(-/-)缓冲液，然后加入溶菌酶至最终浓度为1mg/mL。细胞悬浮液在37℃下孵育30min，然后在4℃以4,500RPM离心30min。将75μl可溶性裂解液与25μl蔗糖混合并且在37℃孵育2h。通过在95℃孵育10min来淬灭反应。如下所述测定10μl反应混合物中的游离葡萄糖。以1：100稀释SEQ ID NO:1、4、5、8和10的样品。
在几种表达条件的组合下的大肠杆菌中表达FTase。将可溶的细胞裂解物部分与蔗糖在没有胰蛋白酶或胆汁盐(SIF-/-)的模拟肠条件下孵育。通过释放游离葡萄糖来监测活性(图1)。所有的SEQ ID NO:1-10都显示出强大的活性，释放更多实质上超过0.4mg/mL葡萄糖。结果如图1所示。SEQ ID NO:2、4、7和8以一式两份(2a/b、4a/b、7a/b、8a/b)被加载。
实施例4：果糖基转移酶的精制表达和纯化
在最初的筛选中鉴定的最佳表达条件用于每种酶。使用固定化镍亲和色谱纯化FTase(图2)。FTase的可量化产率在0.5mg/L培养物(SEQ ID NO:7)至32.7mg/L培养物(SEQID NO:1)之间变化。SEQ ID NO:2和4的蛋白质的产率不能通过凝胶密度法进行量化。SEQID NO:7的纯化带的分子质量(MW，～50kDa)低于预期的(70kDa)。SAS-PAGE凝胶和量化表达水平如图2所示。
实施例5：模拟肠液中纯化的菊糖蔗糖酶活性的表征
在不具有(SIF+/-)和具有(SIF+/+)胰蛋白酶的情况下，在具有胆汁酸的模拟肠液中，使用500mM蔗糖作为底物，评估纯化的FTase的活性(Brodkorb,A.等,(2019)NatureProtocols,14(4),第991-1014页)。通过释放游离的总单糖(葡萄糖和果糖)和游离葡萄糖来评估FTase的活性。使用游离葡萄糖和游离果糖之间的差异来监测果寡糖(FOS)产生(图3)。
在具有(SIF+/+)和不具有(SIF+/-)30mg/mL胰蛋白酶的情况下，在模拟肠液(SIF，6.8mM KCl、0.8mM KH2PO4、123.4mM NaCl、0.33mM MgCl2(H2O)6、8.4mM HCl、0.6mM CaCl2(H2O)2)，10mM胆汁酸(B8756，Sigma，平均分子量＝422.6g/mol)中分析FTase。30mg/mL胰蛋白酶被验证为含有100U/mL胰蛋白酶活性，其中在25℃的46mM Tris-HCl 11.5mM CaCl2中，在pH 8.1下，每分钟1U水解1μmol的对甲苯-磺酰基-L-精氨酸甲酯(p-toluene-sulfonyl-L-arginine methyl ester，TAME)。考虑到唾液和胃相到肠相的连续稀释，从INFOGEST 2.0方案调整SIF缓冲液的组成(Brodkorb等，2019)。淀粉酶、胃脂肪酶和胃蛋白酶被排除在外，因为底物不包括淀粉或脂类，而且pH值高于胃蛋白酶的完全抑制水平(Johnston、N.等,(2007)The Laryngoscope,117(6),第1036-1039页；Piper,D.W.和Fenton,B.H.(1965)Gut、6(5),第506-508页)。每个反应由60μl的100μg/mL菊糖蔗糖酶(inulosucrase)和540μl的1.11XSIF缓冲液组成。反应体积在37℃孵育，并且在5min、10min、30min和60min后收集100μl样品。样品在95℃灭活10min，并且如下所述测定水解和转糖基化速率。
模拟肠液中菊糖蔗糖酶的水解和转糖基化的速率基本上如Salim,A.S.等,(2017)‘Enzymatic synthesis of fructo-oligosaccharides by recombinant levansucrasefrom Leuconostoc mesenteroides Lml7’,Bulgarian Chemical Communications,第49卷,Special Issue D(第259-264页)。简而言之，根据制造商的说明，使用己糖激酶、葡萄糖-6P-脱氢酶和磷酸葡萄糖异构酶(K-FRUGL,Megazyme International Ireland Ltd.,Wicklow,Ireland)，在酶促测定中测量总游离D-葡萄糖和D-果糖(总单糖)。使用ClarioStar plus(BMG)分光光度计进行比色测量。通过省略磷酸葡萄糖异构酶测量游离葡萄糖(不包括果糖)。测定的线范围被确定为0.01-0.8g/L葡萄糖。相应地，将样品稀释至<0.8g/L葡萄糖。游离果糖浓度由游离D-葡萄糖和D-果糖(总单糖)的组合与单独的游离D-葡萄糖的差异计算。
蔗糖的水解(1)产生游离果糖和葡萄糖，而转果糖基化(2)导致果糖并入菊糖纤维和游离葡萄糖：
因此，游离果糖的量是部分水解的蔗糖(非转果糖基化)的直接测量。
(3)frc游离＝mon-glc
每个水解和转果糖基化反应都释放葡萄糖。通过从葡萄糖的总量中减去游离的果糖，得到源于转果糖基化的葡萄糖的量。由于蔗糖是葡萄糖：果糖的1:1化学计量，转果糖基化产生的葡萄糖是FOS中果糖的直接测值。
(4)frcFOS＝glc-frc游离
以便确定转果糖基化比例，
在没有胰蛋白酶的情况下，四种FTase(SEQ ID NO:1、3、6和8)将超过19％(17.7g/L)的总可用的果糖(500mM游离果糖＝90g/L)并入FOS(图3A)。在有胰蛋白酶的情况下，所有FTase的活性都降低了。SEQ ID NO:1显示出最小的活性降低；SEQ ID NO:1在存在胰腺蛋白酶(15.5g/L)的情况下产生的FOS比不存在胰腺蛋白酶的情况(18.9g/L)下少18％(60min)。在存在和不存在胰蛋白酶的情况下，SEQ ID NO:10的果聚糖蔗糖酶都是活跃的，但展现出高比例的水解与转果糖基化。
实施例6：SEQ ID NO:1-8的果糖基转移酶的GRAVY评分
使用https://www.bioinformatics.org/sms2/protein_gravy.html上可得的工具，为每个SEQ ID NO:1-8的蛋白质确定GRAVY评分。结果显示在以下表中。
SEQ ID NO: GRAVY评分
1 -0.601
2 -0.663
3 -0.636
4 -0.611
5 -0.604
6 -0.628
7 -0.205
8 -0.497
实施例7：低蔗糖浓度下FTase的活性
在低蔗糖浓度下，FTase的活性典型地对体内的最佳性能是有益的。具体地，保持转果糖化与水解相比的高比例(T/H)是重要的，尤其是在有利于水解的更低蔗糖浓度下。
测试了SEQ ID NO:1、3、6和8在一系列生理学上相关的蔗糖浓度下的活性。在包括胰蛋白酶、新鲜猪胆汁并且在约pH 5.5的模拟十二指肠条件下进行实验(Houghton等,FoodChemistry.2014 15；151:352-7)。将5μg/mL FTase在模拟十二指肠条件，与蔗糖在37℃下孵育30分钟。如上所述，测定游离葡萄糖和果糖的浓度。
结果如图4所示。在低的蔗糖浓度下，所有测试的FTase保留了有用的转果糖化活性。对于所有测试的FTase，T/H随着蔗糖浓度的降低而降低。在低的蔗糖浓度下，SEQ IDNO:1和6保持特别高的T/H。例如，SEQ ID NO:1的T/H，在17.2％蔗糖时是0.63，在1％蔗糖时为0.42，并且在0.5％蔗糖时，为0.29。
该实施例证实，使用本文所述的FTase，即使在生理上相关的蔗糖浓度下也可以实现显著的蔗糖转化。
实施例8：蔗糖转化的酶浓度依赖性
在模拟十二指肠条件(Houghton等,Food Chemistry.2014 15；151:352-7)，在37℃，125mM蔗糖(4.2％或4.2g/100mL)，30min下，测试更高浓度的FTase。如上所述，从游离葡萄糖和果糖的释放推断出FOS的产生。
结果显示在图5中，观察到FOS的产生与FTase浓度的增加呈线性增长。50μg/mLFTase(SEQ ID NO:1)在30min内将47.9±3.3％的可用的果糖转化为FOS。
该实施例证实，使用实际上可获得量的本文所述的FTASE，可以实现显著和快速的蔗糖转化。
实施例9：蔗糖转化为FOS的速度
在模拟十二指肠条件(Houghton等,Food Chemistry.2014 15；151:352-7)，在37℃，125mM蔗糖下，用10μg/mL SEQ ID NO:1测试将蔗糖转化为FOS的速度。当所有时间点完成后，停止反应，并且测定游离葡萄糖/果糖以推断FOS的产生。
结果如图6所示。在最初的16min内FOS的产生呈线性的。在16min内，将8.2±3.5％的可用的果糖转化为FOS，其中15-30min是在小肠中蔗糖吸收的生理上相关的时间段。
该实施例证实了，即使在低的FTase浓度下，使用本文所述的FTase也可以实现显著的蔗糖转化。转化是快速的并且发生在生理上相关的时间段内。
实施例10：商购获得的巧克力棒的蔗糖转化。
在动态肠道模型中测试了FTase与商购获得的巧克力棒(吉百利的牛奶巧克力)的性能(Houghton等,Food Chemistry.2014 15；151:352-7)。肠道模型以50％的原始方法(最终完全体积＝95mL)并且在37℃运行。用顶置搅拌器混合消化物。将半份(22.5g，含有～11.3g蔗糖巧克力切成小块，并且在添加到静息(resting)的合成的胃液(总体积＝35mL)之前与合成的唾液混合。合成的胃液包括0.5mg/mL胃蛋白酶和0.04mg/mL胃脂肪酶。使用蠕动泵以恒定的速度添加分泌物。胃分泌物以0.25mL/min添加，持续1h(总体积＝50mL)。在消化物中添加12.5mL新鲜的猪胆汁，随后添加475μg的SEQ ID NO:1(全肠道容积处的浓度＝5μg/mL)。用与SEQ ID NO:1当量体积的水进行对照反应。将包括7mg/mL胰蛋白酶在内的合成的胰腺分泌物以0.25mg/mL添加，持续2h(最终总体积＝95mL)。在每个时间点，如上所述，在测定游离葡萄糖/果糖之前，对样品进行灭活，以测定转化为FOS的可用的果糖的量。
结果如图7所述。在15min内将2.5±1.5％的可用的果糖转化为FOS，在30min内将4.5±0.5％的可用的果糖转化为FOS。蔗糖的转化持续了至少90min，在90min内将15.8±4.5％的可用的果糖并入FOS。
该实施例证实，本文所述的FTase酶能够在生理上和商业上相关的组合物中，包括在脂肪和脂质、其他碳水化合物和其他食物颗粒存在的情况下，将大量的蔗糖转化为FOS，即使在低的FTase浓度，也不会被这些组分抑制。
序列表的详细说明
SEQ ID NO:1显示了来自格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)DSM 20604的基因inuGB的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:2显示了来自格氏乳杆菌DSM 20243的基因inuGA的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:3显示了来自约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)NCC 553的基因inuJ的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:4显示了来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)TMW1.106的基因inu的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:5显示了来自琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)的基因inuO的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:6显示了来自罗伊氏乳杆菌TMW1.106的基因inu的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:7显示了来自棘孢曲霉菌(Aspergillus acleatus)的AaFT32A基因的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:8显示了来自聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)的基因sft的果糖基转移酶的的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:9显示了来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DSM 7＝ATCC 23350的基因sacB的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:10显示了来自巨大芽孢杆菌(B.megaterium)DSM319的基因sacBK315A的果糖基转移酶的氨基酸序列。以灰色/黑体/黑体和下划线显示的残基的部分或所有被认为与蛋白质的活性位点有关。
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:4
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SEQ ID NO:6
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SEQ ID NO:7
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序列表
<110> 依纽洛克斯有限公司
<120> 果糖基转移酶的用途
<130> N420339WO
<150> GB 2017421.5
<151> 2020-11-03
<160> 18
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 565
<212> PRT
<213> 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)
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<213> 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)
<400> 6
Asp Thr Asn Thr Glu Asn Asn Asp Ser Ser Thr Val His Val Thr Thr
1 5 10 15
Gly Asp Asn Asp Ile Ala Val Lys Ser Ala Ile Leu Gly Ser Gly Gln
20 25 30
Val Ser Ala Ala Ser Asp Ala Thr Ile Lys Asn Ser Ala Asn Ala Asn
35 40 45
Ser Ala Ser Ser Ala Ala Asn Thr Gln Asn Ser Asn Ser Gln Val Ala
50 55 60
Ser Ser Ala Ala Thr Thr Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ser Ser Asn
65 70 75 80
Asn Thr Asp Ser Lys Ala Ala Gln Glu Asn Ala Asn Thr Ala Lys Asn
85 90 95
Asp Asp Thr Gln Lys Ala Ala Pro Ala Asn Glu Ser Ser Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Glu Pro Ala Val Asn Val Asn Asp Ser Ser Ala Ala Lys Asn Asp
115 120 125
Asp Gln Gln Ser Ser Lys Lys Asn Thr Thr Ala Lys Leu Asn Lys Asp
130 135 140
Ala Glu Asn Val Val Lys Lys Ala Gly Ile Asp Pro Asn Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asp Asp Gln Ile Lys Ala Leu Asn Lys Met Asn Phe Ser Lys Ala Ala
165 170 175
Lys Ser Gly Thr Gln Met Thr Tyr Asn Asp Phe Gln Lys Ile Ala Asp
180 185 190
Thr Leu Ile Lys Gln Asp Gly Arg Tyr Thr Val Pro Phe Phe Lys Ala
195 200 205
Ser Glu Ile Lys Asn Met Pro Ala Ala Thr Thr Lys Asp Ala Gln Thr
210 215 220
Asn Thr Ile Glu Pro Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Val Gln Asp
225 230 235 240
Val Arg Thr Gly Gln Val Ala Asn Trp Asn Gly Tyr Gln Leu Val Ile
245 250 255
Ala Met Met Gly Ile Pro Asn Gln Asn Asp Asn His Ile Tyr Leu Leu
260 265 270
Tyr Asn Lys Tyr Gly Asp Asn Glu Leu Ser His Trp Lys Asn Ala Gly
275 280 285
Pro Ile Phe Gly Tyr Asn Ser Thr Ala Val Ser Gln Glu Trp Ser Gly
290 295 300
Ser Ala Val Leu Asn Ser Asp Asn Ser Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg
305 310 315 320
Val Asp Thr Ser Asp Asn Asn Thr Asn His Gln Lys Ile Ala Ser Ala
325 330 335
Thr Leu Tyr Leu Thr Asp Asn Asn Gly Asn Val Ser Leu Ala Gln Val
340 345 350
Ala Asn Asp His Ile Val Phe Glu Gly Asp Gly Tyr Tyr Tyr Gln Thr
355 360 365
Tyr Asp Gln Trp Lys Ala Thr Asn Lys Gly Ala Asp Asn Ile Ala Met
370 375 380
Arg Asp Ala His Val Ile Glu Asp Asp Asn Gly Asp Arg Tyr Leu Val
385 390 395 400
Phe Glu Ala Ser Thr Gly Leu Glu Asn Tyr Gln Gly Glu Asn Gln Ile
405 410 415
Tyr Asn Trp Leu Asn Tyr Gly Gly Asp Asp Ala Phe Asn Ile Lys Ser
420 425 430
Leu Phe Arg Ile Leu Ser Asn Asp Asp Ile Lys Ser Arg Ala Thr Trp
435 440 445
Ala Asn Ala Ala Ile Gly Ile Leu Lys Leu Asn Lys Asp Glu Lys Asn
450 455 460
Pro Lys Val Ala Glu Leu Tyr Ser Pro Leu Ile Ser Ala Pro Met Val
465 470 475 480
Ser Asp Glu Ile Glu Arg Pro Asn Val Val Lys Leu Gly Asn Lys Tyr
485 490 495
Tyr Leu Phe Ala Ala Thr Arg Leu Asn Arg Gly Ser Asn Asp Asp Thr
500 505 510
Trp Met Asn Ala Asn Tyr Ala Val Gly Asp Asn Val Ala Met Val Gly
515 520 525
Tyr Val Ala Asp Ser Leu Thr Gly Ser Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Ser
530 535 540
Gly Val Val Leu Thr Ala Ser Val Pro Ala Asn Trp Arg Thr Ala Thr
545 550 555 560
Tyr Ser Tyr Tyr Ala Val Pro Val Ala Gly Lys Asp Asp Gln Val Leu
565 570 575
Val Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Asn Gly Val Ala Gly Lys Gly Met
580 585 590
Asp Ser Thr Trp Ala Pro Ser Phe Leu Leu Gln Ile Asn Gln Asp Asn
595 600 605
Thr Thr Thr Val Leu Ala Lys Met Thr Asn Gln Gly Asp Trp Ile Trp
610 615 620
Asp Asp Ser Ser Glu Asn Leu Asp Met Ile Gly Asp Leu Asp Ser Ala
625 630 635 640
Ala Leu Pro Gly Glu Arg Asp Lys Pro Val Asp Trp Asp Leu Ile Gly
645 650 655
Tyr Gly Leu Lys Pro His Asp
660
<210> 7
<211> 635
<212> PRT
<213> 棘孢曲霉菌(Aspergillus aculeatus)
<400> 7
Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala His Ile
20 25 30
Leu Pro Ala Glu Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Thr Asp
35 40 45
Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly
50 55 60
Ile Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp Thr Ser
65 70 75 80
Asp Asn Gly Ser Phe Leu Ile Gln Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val
85 90 95
Ala Val Phe Asp Gly Ala Val Ile Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro
100 105 110
Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro Ile His Trp Ser Ile
115 120 125
Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp
130 135 140
Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gln Gly Pro Val Ile Ala Asp
145 150 155 160
His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe
165 170 175
Arg Ser Ala Arg Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Val Ala
180 185 190
Arg Asn Glu Thr Ala Val Gln Gln Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys
195 200 205
Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly
210 215 220
Pro Ala Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe
225 230 235 240
Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gln Glu Ala Thr Asn Ser
245 250 255
Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe
260 265 270
Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gln
275 280 285
Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Leu Pro
290 295 300
Ile Val Pro Gln Val Ser Ser Ile His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly
305 310 315 320
Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gln Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser
325 330 335
Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser Gly
355 360 365
Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gln
370 375 380
Tyr Glu Gln Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gln Gln Gly Trp Thr Gly
385 390 395 400
Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gln Thr Val Glu Asn Val
405 410 415
Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly
420 425 430
Glu Ser Asp Asn Gln Thr Ala Thr Leu Arg Thr Leu Gly Ile Thr Ile
435 440 445
Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala
450 455 460
Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gln Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gln
465 470 475 480
Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Gln Leu Glu Phe Pro
485 490 495
Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gln Ser Gly Phe Glu Ile Leu Ala
500 505 510
Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser
515 520 525
Leu Val Val Asp Arg Ser Gln Thr Ser Ala Ala Ala Pro Thr Asn Pro
530 535 540
Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val
545 550 555 560
Ile Glu Asn Gly Gln Glu Gln Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val
565 570 575
Val Asp Asn Ala Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu
580 585 590
Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gln Ile Arg Phe
595 600 605
Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gln Phe Arg Asn Val Ser Val Ser
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn
625 630 635
<210> 8
<211> 682
<212> PRT
<213> 聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)
<400> 8
Met Lys Leu Pro Ser Ser Leu Asp Ile Leu Leu Ala Arg Gln Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Thr Glu Val Asp Tyr Asp Ser Pro Pro Pro Asp Leu Thr Thr
20 25 30
Leu Pro Glu Asn Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val
35 40 45
Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Asn Asp
50 55 60
Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Tyr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Ile Asn
85 90 95
Pro Asn Gly Gly Tyr Ile Ile Val Ala Gly Gly Pro Asn Asp Pro Glu
100 105 110
Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Asp Leu Pro
115 120 125
Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu
130 135 140
Pro Tyr Thr Pro Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Asp Asp
145 150 155 160
Gly Gly His His Phe Asp Lys Leu Asp Arg Gly Pro Val Ile Pro Leu
165 170 175
Pro Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe
180 185 190
Gln Asn His Glu Val Asp Glu Val Thr Gly Ser Asp Pro Asp Thr Trp
195 200 205
Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Gly Ile Phe
210 215 220
Leu Tyr Arg Asn Gln Asp Ser Ser Phe Glu Asn Trp Glu Tyr Leu Gly
225 230 235 240
Glu Trp Trp Gln Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asp Gly Thr Trp
245 250 255
Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Phe Ser Leu
260 265 270
Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly His Thr Phe Met Thr Ile Gly
275 280 285
Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gln Pro Ser Val Thr Ser Met His
290 295 300
Ala Met Leu Trp Ala Ala Gly Asn Val Ser Ser Glu Asn Gly Glu Asn
305 310 315 320
Val Thr Phe Thr Pro Tyr Met Ala Gly Ala Leu Asp Trp Gly Met Ala
325 330 335
Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr Ser Gln Ala Ser
340 345 350
Glu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Trp Val Trp Leu Thr
355 360 365
Gly Asp Glu Phe Gly Ala Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ala Gln Gln Gly
370 375 380
Trp Gln Asn Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Ser Ile His Thr Ile
385 390 395 400
Gln Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ile His Glu Thr Ala Ser Trp Arg
405 410 415
Val Ala Glu His Gly Gly Glu Arg Arg Ser Gly Gly Val Glu Leu Glu
420 425 430
Thr Leu Gly Ile Asn Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Val Ser
435 440 445
Ser Gly Thr Ser Phe Glu Glu Pro Ser Arg Asp Ile Asn Glu Ser Gly
450 455 460
Thr Ile Pro Phe Glu Arg Ser Pro Thr Ser Arg Phe Phe Ala Leu Glu
465 470 475 480
Ala Gln Ile Ser Phe Pro Gln Ser Ala Arg Asp Ser Glu Val Gln Ser
485 490 495
Gly Phe Gln Ile Leu Ala Ser Glu Leu Glu Trp Thr Thr Ile Tyr Tyr
500 505 510
Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile Val Ile Asp Arg Asn His Thr Ser Ala
515 520 525
Ala Ser Glu Thr Thr Pro Gly Leu Gly Thr Val Thr Glu Ser Gly Arg
530 535 540
Ile Arg Leu Phe Asp Ile Ala Gly Gly Cys Asp His Asp Gly His Gly
545 550 555 560
Gly His Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp His Asn Gly Asp Gly Asp His
565 570 575
Ser Gly Asp Gly Asp His Asn Asp Asp Asp Asp His Asn Val Asp Gly
580 585 590
Asp Asp Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gln Lys Arg Asp Gly Pro Cys Asp
595 600 605
Lys Asp His Asp Lys Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp
610 615 620
Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Ser Arg Phe Val Val Ser Thr
625 630 635 640
Trp Val Arg Pro Trp Tyr Thr Asn Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe His
645 650 655
Asn Gly Glu Gly Glu Val Ser Phe Asp Asn Ile Ala Val His Asp Gly
660 665 670
Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Asn
675 680
<210> 9
<211> 443
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 9
Lys Glu Asn Asn Gln Lys Ala Tyr Lys Glu Thr Tyr Gly Val Ser His
1 5 10 15
Ile Thr Arg His Asp Met Leu Gln Ile Pro Lys Gln Gln Gln Asn Glu
20 25 30
Lys Tyr Gln Val Pro Gln Phe Asp Gln Ser Thr Ile Lys Asn Ile Glu
35 40 45
Ser Ala Lys Gly Leu Asp Val Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala
50 55 60
Asp Gly Thr Val Ala Glu Tyr Asn Gly Tyr His Val Val Phe Ala Leu
65 70 75 80
Ala Gly Ser Pro Lys Asp Ala Asp Asp Thr Ser Ile Tyr Met Phe Tyr
85 90 95
Gln Lys Val Gly Asp Asn Ser Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg
100 105 110
Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys Phe Asp Ala Asn Asp Pro Ile Leu Lys
115 120 125
Asp Gln Thr Gln Glu Trp Ser Gly Ser Ala Thr Phe Thr Ser Asp Gly
130 135 140
Lys Ile Arg Leu Phe Tyr Thr Asp Tyr Ser Gly Lys His Tyr Gly Lys
145 150 155 160
Gln Ser Leu Thr Thr Ala Gln Val Asn Val Ser Lys Ser Asp Asp Thr
165 170 175
Leu Lys Ile Asn Gly Val Glu Asp His Lys Thr Ile Phe Asp Gly Asp
180 185 190
Gly Lys Thr Tyr Gln Asn Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Asn Tyr
195 200 205
Thr Ser Gly Asp Asn His Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Val Glu Asp
210 215 220
Lys Gly His Lys Tyr Leu Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asn
225 230 235 240
Gly Tyr Gln Gly Glu Glu Ser Leu Phe Asn Lys Ala Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Asn Phe Phe Arg Lys Glu Ser Gln Lys Leu Gln Gln Ser Ala
260 265 270
Lys Lys Arg Asp Ala Glu Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ile Ile Glu
275 280 285
Leu Asn Asn Asp Tyr Thr Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Thr
290 295 300
Ser Asn Thr Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ala Asn Val Phe Lys Met
305 310 315 320
Asn Gly Lys Trp Tyr Leu Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr
325 330 335
Ile Asp Gly Ile Asn Ser Asn Asp Ile Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser
340 345 350
Asn Ser Leu Thr Gly Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Lys Thr Gly Leu Val
355 360 365
Leu Gln Met Gly Leu Asp Pro Asn Asp Val Thr Phe Thr Tyr Ser His
370 375 380
Phe Ala Val Pro Gln Ala Lys Gly Asn Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr
385 390 395 400
Met Thr Asn Arg Gly Phe Phe Glu Asp Lys Lys Ala Thr Phe Gly Pro
405 410 415
Ser Phe Leu Met Asn Ile Lys Gly Asn Lys Thr Ser Val Val Lys Asn
420 425 430
Ser Ile Leu Glu Gln Gly Gln Leu Thr Val Asn
435 440
<210> 10
<211> 455
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 10
Lys Gly Asn Asp Ser Lys Asp Phe Asn Asn Ser Tyr Gly Ile Ser His
1 5 10 15
Ile Thr Arg Asp Asn Met Val Lys Ile Pro Gln Gln Gln Asn Ser Asp
20 25 30
Gln Phe Lys Val Pro Ala Phe Asp Glu Ser Thr Ile Lys Asn Ile Ala
35 40 45
Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ala Ser Gly Asn Thr Ile Asp Leu Asp Val
50 55 60
Trp Asp Ser Trp Pro Leu Gln Asn Ala Asp Gly Thr Val Ala Thr Tyr
65 70 75 80
His Gly Tyr Gln Ile Val Phe Ala Leu Ala Gly Asp Pro Lys Asp Ser
85 90 95
Asn Asp Thr Ser Val Tyr Leu Phe Tyr Lys Lys Ala Gly Asp Lys Ser
100 105 110
Ile Asp Ser Trp Lys Asn Ala Gly Arg Val Phe Lys Asp Ser Asp Lys
115 120 125
Phe Val Pro Asn Asp Pro His Leu Lys Asn Gln Thr Gln Glu Trp Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Thr Leu Thr Lys Asp Gly Lys Val Arg Leu Phe Tyr Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Ser Gly Lys Gln Tyr Gly Lys Gln Thr Leu Thr Thr Ala Gln
165 170 175
Val Asn Met Ser Gln Pro Asn Asp Asn Thr Leu Lys Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Phe Asp Gly Asp Gly Lys Ile Tyr Gln Thr
195 200 205
Val Gln Gln Phe Ile Asp Glu Gly Gly Tyr Asp Thr Gly Asp Asn His
210 215 220
Thr Leu Arg Asp Pro His Tyr Ile Glu Asp Asn Gly His Lys Tyr Leu
225 230 235 240
Val Phe Glu Ala Asn Thr Gly Thr Glu Asp Gly Tyr Gln Gly Glu Asp
245 250 255
Ser Leu Tyr Asn Arg Ala Tyr Tyr Gly Gly Asn Asn Pro Phe Phe Gln
260 265 270
Ser Glu Lys Lys Lys Leu Leu Glu Gly Ser Asn Lys Glu Lys Ala Ser
275 280 285
Leu Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ile Ile Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Thr
290 295 300
Leu Lys Lys Val Met Lys Pro Leu Ile Thr Ser Asn Thr Val Thr Asp
305 310 315 320
Glu Ile Glu Arg Ala Asn Ile Phe Lys Lys Asp Gly Lys Trp Tyr Leu
325 330 335
Phe Thr Asp Ser Arg Gly Ser Lys Met Thr Ile Asp Gly Ile Gly Gln
340 345 350
Asp Asp Val Tyr Met Leu Gly Tyr Val Ser Asn Thr Leu Thr Gly Lys
355 360 365
Tyr Lys Pro Leu Asn Asp Thr Gly Leu Val Leu His Met Asp Leu Asp
370 375 380
Pro Asn Asp Lys Thr Phe Thr Tyr Ser His Phe Ala Val Pro Gln Thr
385 390 395 400
Lys Gly Asp Asn Val Val Ile Thr Ser Tyr Met Thr Asn Arg Gly Phe
405 410 415
Tyr Glu Asp Asn His Ser Thr Phe Ala Pro Ser Phe Leu Val Asn Ile
420 425 430
Asp Gly Ser Lys Thr Ser Val Val Lys Asp Arg Val Leu Glu Gln Gly
435 440 445
Gln Leu Thr Val Asp Glu Asp
450 455
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚组氨酸标签
<400> 11
His His His His
1
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚组氨酸标签
<400> 12
His His His His His His
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚组氨酸标签
<400> 13
His His His His His His His His
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌标签
<400> 14
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG标签
<400> 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人流感血凝素(HA)标签
<400> 16
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myc标签
<400> 17
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
1 5
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V5标签
<400> 18
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10

Claims (41)

1.一种减少受试者的果糖摄取的体内方法，所述方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
2.一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖的体内方法，所述方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
3.一种减少受试者的葡萄糖摄取和/或减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖的体内方法，所述方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是一种在受试者体内产生果寡糖的方法，所述方法包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而将蔗糖转化为所述果寡糖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶是菊糖蔗糖酶或果聚糖蔗糖酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶是EC类2.4.1.9的菊糖蔗糖酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是一种减少受试者的果糖摄取并且在体内产生菊糖的方法，所述方法包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法是一种减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖的方法，所述方法包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为菊糖。
9.根据权利要求1至5中任一项的所述方法，其中所述果糖基转移酶是EC类2.4.1.10的果聚糖蔗糖酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶包括根据SEQ IDNO:1至10中任何一个的多肽或其功能变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶：
i)与SEQ ID NO:1具有至少70％同源性，其中所述同源性是相对于SEQ ID NO:1的位置128、129、153、158、159、160、162、196、197、281、282、298、379、381、399、402、457、458和480评估的；或
ii)与SEQ ID NO:5具有至少70％同源性，其中所述同源性是相对于SEQ ID NO:5的位置49、50、73、82、83、84、85、86、119、120、209、210、293、295和361评估的；或
iii)与SEQ ID NO:8具有至少70％同源性，其中所述同源性是相对于SEQ ID NO:8的位置54、55、56、57、58、59、74、75、116、265、338、339、366、370、372和373评估的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶包括对应于SEQID NO:1的A182位置处的丙氨酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶包括对应于SEQID NO:8的F372位置处的苯丙氨酸和/或包括对应于SEQ ID NO:8的G373位置处的甘氨酸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶具有-0.4或比-0.4更负的溶解度GRAVY评分。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶来源于乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、链霉菌属、曲霉菌属或梭菌属的生物体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶来源于格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、琼脂芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜明串珠菌、绿色产色链霉菌、棘孢曲霉菌、聚多曲霉菌或丙酮丁醇梭菌物种的生物体。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述果糖基转移酶由来自埃希氏杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属、芽孢杆菌属、毕赤酵母属、木霉菌属或曲霉菌属，优选地大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母、里氏木霉菌、黑曲霉菌或米曲霉菌的生物体表达或可通过上述生物体表达获得。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中果糖基转移酶包括在营养品组合物中，所述营养品组合物包括所述果糖基转移酶和一种或多种营养学上可接受的填充剂、稳定剂、着色剂或调味剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述营养品组合物被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者口服所述果糖基转移酶或所述营养品组合物。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是非治疗性方法；优选地，其中所述方法不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体。
22.一种分离的果糖基转移酶，用于：
i)减少受试者的果糖摄取；
ii)减少经受试者蔗糖代谢形成果糖；
iii)减少受试者的葡萄糖摄取和/或减少经受试者蔗糖代谢形成葡萄糖；
iv)在受试者体内产生果寡糖，所述用途包括向受试者施用分离的果糖基转移酶，从而将蔗糖转化为所述果寡糖；
23.根据权利要求22所述的使用的分离的果糖基转移酶，其中：
i)所述分离的果糖基转移酶是用于减少受试者的果糖摄取并且产生菊糖，并且所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为所述菊糖；或
ii)所述分离的果糖基转移酶是用于减少经受试者蔗糖代谢形成果糖并且在体内产生菊糖，和所述用途包括向受试者施用分离的菊糖蔗糖酶，从而在体内将蔗糖转化为所述菊糖。
24.根据权利要求22或23所述的使用的分离的果糖基转移酶，其中所述果糖基转移酶如权利要求5、6或9至19中任一项所定义。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的使用的分离的果糖基转移酶，其中所述用途包括向所述受试者口服所述分离的果糖基转移酶；
其中所述用途可选地包括向所述受试者口服施用药学上可接受的组合物或营养学上可接受的组合物的形式的所述分离的果糖基转移酶。
26.一种营养品组合物，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种营养学上可接受的填充剂、稳定剂、着色剂或调味剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物是膳食补充剂。
28.一种药学上可接受的组合物，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的组合物，其中所述分离的果糖基转移酶如权利要求4至17中任一项所定义。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于口服施用；优选地，其中所述组合物(i)包括肠溶衣和/或(ii)被配制成片剂、锭剂、糖锭、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的组合物，其用于药物。
32.一种食物组合物或食品，其包括分离的果糖基转移酶和一种或多种碳水化合物、脂肪、脂质、调味剂或着色剂。
33.根据权利要求32所述的食物组合物或食品，其包括蔗糖。
34.根据权利要求32或33所述的组合物，其中所述分离的果糖基转移酶如权利要求4至17中任一项所定义。
35.一种抑制受试者的食欲和/或增加受试者的饱腹感的方法，其包括向受试者施用分离的果糖基转移酶或施用根据权利要求26至34中任一项的组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述分离的果糖基转移酶如权利要求4至19中任一项所定义。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述方法是非治疗性方法；优选地，其中所述方法不包括通过疗法或手术治疗人体或动物体。
38.一种分离的果糖基转移酶，其可选地如权利要求4至19中任一项所定义；或一种药学上可接受的组合物，其根据权利要求28至30中任一项所述，用于治疗或预防需要其的受试者的代谢综合征、糖尿病、非酒精性脂肪肝疾病或便秘。
39.一种分离的果糖基转移酶，其可选地如权利要求4至19中任一项所定义；或一种药学上可接受的组合物，其根据权利要求28至30中任一项所述，用于治疗或预防需要其的受试者的肥胖症。
40.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其包括向所述受试者口服施用所述分离的果糖基转移酶或组合物。
41.根据权利要求38或39所述的使用的分离的果糖基转移酶或药学上可接受的组合物，其中所述用途包括向所述受试者口服施用所述分离的果糖基转移酶或所述药学上可接受的组合物。
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