CN116445493A - 一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 - Google Patents
一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116445493A CN116445493A CN202211216666.1A CN202211216666A CN116445493A CN 116445493 A CN116445493 A CN 116445493A CN 202211216666 A CN202211216666 A CN 202211216666A CN 116445493 A CN116445493 A CN 116445493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tva
- subgroup
- mutated
- alv
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 108010061610 Tva receptor Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 abstract description 4
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 5
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- LSIWVWRUTKPXDS-DCAQKATOSA-N Pro-Gln-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LSIWVWRUTKPXDS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 2
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 description 1
- 241000323253 Avian leukosis virus ev/J Species 0.000 description 1
- 241000714235 Avian retrovirus Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用。所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第58位的氨基酸G突变为N、第59位的H突变为D，第69位的W突变为L、第70位的G突变为PQR。本发明发现Tva作为A亚群及K亚群禽白血病病毒的共受体分子，将其关键功能性氨基酸位点G58、H59、W69及G70突变后，构建相应的Tva表达质粒，将其转染Tva缺失的DF‑1细胞后，其无法介导A、K亚群ALV感染宿主细胞，丧失了其作为禽白血病病毒受体的功能。本发明的提出为进一步研究Tva基因的功能及建立同时抗A、K亚群ALV感染的细胞系提供了技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用，本发明属于生物技术领域。
背景技术
禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。根据宿主范围、病毒囊膜基因以及血清学交叉反应性的不同，ALV被划分为A-K 11个亚群。目前在我国家禽中流行较为广泛的为A、B、J、K四个亚群。其中ALV-A及ALV-K的受体分子均为Tva，ALV-B的受体分子为Tvb，ALV-J的受体分子为chNHE1。由于ALV主要以垂直传播为主，所以也是重要的家禽种源疫病。因而，ALV的流行不仅给我国的养禽业带来了严重的经济损失，同时也严重威胁我国家禽种源安全。
ALV属于α-反转录病毒属，具有典型禽反转录病毒的基因组结构，为有囊膜的RNA病毒。囊膜病毒感染宿主细胞的第一步也是至关重要的一步即囊膜蛋白与宿主细胞表面受体蛋白结合。因此，受体分子是建立抗ALV感染的抗病技术理想的基因编辑靶标分子。但由于部分ALV受体分子在维持细胞的正常生理活动过程中发挥重要功能，因此，不能通过完全敲除受体分子来实现抗ALV的感染。而由于ALV的囊膜蛋白通过与受体上的特异性氨基酸相互作用才能进入宿主细胞，因此，受体分子上与病毒囊膜蛋白互作的关键氨基酸位点是理想的基因编辑靶点，因其编辑后既破坏了受体分子介导ALV感染宿主细胞的能力，又不影响其正常的生理功能。
Tva是ALV-A及ALV-K两个亚群ALV的受体分子，同时也是维生素B12摄取的细胞受体分子之一，因此，Tva对于鸡的生长至关重要。所以不能通过敲除Tva来实现同时抗ALV-A及ALV-K的感染，只能通过对Tva与ALV-A及ALV-K囊膜蛋白相互作用的关键氨基酸位点替换，使其既保留介导维生素B12摄取的功能，又能完全抵抗ALV-A及ALV-K的感染。
本发明人前期研究发现，Tva的G58、H59、W69及G70氨基酸是Tva介导ALV-A及ALV-K进入宿主细胞的关键功能性氨基酸位点，破坏这4个位点，ALV-A及ALV-K就不能进入宿主细胞。鉴于此，本发明通过对Tva的这四个关键功能性氨基酸位点进行突变，并对突变后的Tva介导ALV-A及ALV-K进入宿主细胞的功能进行了评价，以期为进一步构建同时抗ALV-A及ALV-K的细胞或基因编辑鸡奠定基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种突变后的Tva基因；
本发明的目的之二在于提供一种突变后的Tva基因在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发现了Tva作为A亚群禽白血病病毒(ALV-A)及K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的共受体分子，将其关键功能性氨基酸位点G58、H59、W69及G70突变后，构建相应的Tva表达质粒，将其转染Tva缺失的DF-1细胞后，其无法介导ALV-A及ALV-K感染宿主细胞，即替换后的Tva完全丧失了作为ALV-A及ALV-K受体的能力。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种突变后的禽白血病病毒受体基因Tva，为了维持突变后Tva蛋白结构的正确，将Tva的相应氨基酸位点替换为其同源蛋白人的低密度脂蛋白受体蛋白(huLDLR4，为ALV的非功能性受体)的相应氨基酸，所述的突变后的禽白血病病毒受体基因Tva所编码的Tva蛋白的第58位的氨基酸G(Gly)突变为N(Asn)、第59位的H(His)突变为D(Asp)，第69位的W(Trp)突变为L(Leu)、第70位的G(Gly)突变为PQR(Pro-Gln-Arg)。
其中，优选的，所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
进一步的，本发明还提出了所述突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)在研究Tva基因的功能以及其在制备抗A亚群及K亚群禽白血病病毒的生物材料中的应用。
其中，优选的，所述的生物材料为抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的质粒所转染的细胞或抗A亚群及K亚群禽白血病基因编辑鸡。
其中，更优选的，所述的细胞为DF-1细胞。
再进一步的，本发明还提出了一种构建抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞的方法，所述的方法包括将含有所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)的载体转化Tva敲除的DF-1细胞的步骤。
其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：
(1)将所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)连接至pCAGGS载体中，得到的载体命名为pCAGGS-Tva-M；
(2)取Tva敲除的DF-1细胞，铺至12孔板，15-20h后转染pCAGGS-Tva-M，得到同时抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞。
更进一步的，本发明还提出了按照所述的方法构建得到的抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
禽白血病是由禽白血病病毒引起的一种严重危害家禽的肿瘤性疾病，其病原为禽白血病病毒，为有囊膜的逆转录病毒。目前尚无有效的疫苗和药物对其进行治疗，因此，只能对种鸡群进行净化，需要耗费大量的人力物力。尽管如此，不少种鸡群因为禽白血病病毒的感染而被全部淘汰，其不仅给养殖场造成严重的经济损失，同时，也严重威胁家禽的种源安全，因此，新型抗ALV感染技术的探索尤为重要。
由于ALV复制需要大量宿主因子的参与，因此，以宿主因子为靶点进行抗病研究是目前新型ALV防控策略的研究方向。由于病毒进入宿主细胞并建立感染至关重要的一个步骤是病毒的囊膜蛋白与受体分子的结合，一旦病毒无法与受体结合，其无法进入宿主细胞。因此，受体分子是研究新型ALV防控策略最好的靶标分子。
目前国内流行较为广泛并且危害较为严重的ALV-A及ALV-K的唯一受体分子均为Tva，因此，Tva可作为同时抵抗ALV-A及ALV-K的基因编辑靶标分子。本发明通过对ALV-A及ALV-K的受体的关键氨基酸位点G58、H59、W69及G70同时替换后，结果表明，替换后的Tva完全丧失了介导ALV-A及ALV-K进入宿主细胞的能力。本发明的提出为进一步研究Tva基因的功能及建立同时抗ALV-A及ALV-K感染的细胞系或基因编辑鸡提供了技术手段。
附图说明
图1为分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞系的ALV-A荧光毒株感染水平；
图2为分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞系的ALV-A野生型毒株感染水平；
图3为分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞系的ALV-K荧光毒株感染水平；
图4为分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞系的ALV-K野生型毒株感染水平。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1抗A、K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的构建
1材料与方法
1.1主要实验材料
DF-1细胞及表达绿色荧光蛋白的重组荧光病毒ALV-A-GFP、ALV-K-GFP毒株为本实验室保存；ALV-A(RAV-1)及ALV-K(JS14LH01)野生型毒株为本实验室分离；红色荧光AlexaFluor 546羊抗鼠抗体均购自Thermo公司；pMD-18T载体购自TAKARA公司；pCas9-GFP质粒、pCAGGS质粒为本实验室保存；ALV特异性单克隆抗体2E5鼠源MAb为本实验保存。
1.2DF-1-TvaKO细胞系的构建
使用E-CRISP在线软件(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcris/html)设计Tva敲除引导RNA(gRNA)序列(CCACTCCAGCGGGTAGCAGT)，并将该序列与U6启动子及gRNAscaffold融合表达后插入到pMD-18T载体，构建Tva-sgRNA敲除质粒。将pCas9-GFP质粒及Tva-sgRNA质粒共转入DF-1细胞内，培养48h后，使用流式细胞分选仪筛选带有GFP荧光的细胞，按照5个细胞/孔的稀释比例将其接入96孔板中，7d后于光学显微镜下观察筛选单克隆细胞系并扩大培养，得到的细胞系命名为DF-1-TvaKO。使用基因组提取试剂盒提取DF-1-TvaKO细胞系的基因组，以Tva-CX-F(GTTCTTTGGCGCAGTGCTC)及Tva-CX-R(CGCTGCAGCTGAGCTTTATG)为引物扩增替换序列，回收扩增产物进行测序鉴定。
1.3质粒构建
以DF-1的cDNA为模板，使用引物P1(TGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCATGGTGCGGTTGTTGGAG)及P2(GAGGGAAAAAGATCTGCTAGCTCGAGTCAGTCCCATCTTACCAC)扩增Tva基因的全长，通过琼脂糖凝胶电泳实验证明片段扩增正确并回收产物，将其连接至pCAGGS载体中，并命名为pCAGGS-Tva-WT，野生型Tva基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步，通过融合PCR扩增的方式，使用引物P1与P3(GCAGCTCGTCCCGTCCATCGTCGCAGTCGGGGTCGTTGTCGCAGAGCCACTCCAG)及P2与P4(CGACTGCGACGATGGACGGGACGAGCTGCCGCAGCGTTGCGGAGCGAGCGGGAGC)，分别扩增Tva，通过琼脂糖凝胶电泳实验证明片段扩增正确并回收产物，以二者的回收产物为模板，使用引物P1及P2扩增，将Tva编码蛋白的第58位的氨基酸G(Gly)突变为N(Asn)、第59位的H(His)突变为D(Asp)，第69位的W(Trp)突变为L(Leu)、第70位的G(Gly)突变为PQR(Pro-Gln-Arg)，将突变后的Tva全长连接至pCAGGS载体中，并命名为pCAGGS-Tva-M，突变后的Tva基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
1.4ALV-A及ALV-K荧光毒株感染水平的检测
取DF-1-TvaKO细胞系，以5×105个cell/孔的密度铺至12孔板，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M各三个平行孔，转染后16h接ALV-A荧光毒株(ALV-A-GFP)(105.0TCID50/mL)100μL/孔，各设置三个平行孔。接毒72h后通过倒置荧光显微镜观察GFP荧光比例，检测感染ALV-A-GFP毒株的比例。
取DF-1-TvaKO细胞系，以5×105个cell/孔的密度铺至12孔板，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M各三个平行孔，转染后16h接ALV-K荧光毒株(ALV-K-GFP)(105.0TCID50/mL)100μL/孔，各设置三个平行孔。接毒72h后通过倒置荧光显微镜观察GFP荧光比例，检测感染ALV-K-GFP毒株的比例。
1.5ALV-A及ALV-K野生型毒株感染水平的检测
取DF-1-TvaKO细胞系，以5×105个cell/孔的密度铺至12孔板，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M各三个平行孔，转染后16h接ALV-A(RAV-1)毒株(105.5TCID50/mL)100μL/孔，每组设置3个平行孔。接毒72h后用4％多聚甲醛固定，以2E5鼠源MAb(1:100倍稀释)为一抗，以Alexa Fluor 546羊抗鼠抗体(1:1000倍稀释)为二抗，利用IFA检测感染ALV-A(RAV-1)毒株的比例。
取DF-1-TvaKO细胞系，以5×105个cell/孔的密度铺至12孔板，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M各三个平行孔，转染后16h接ALV-K(JS14LH01)毒株(105.5TCID50/mL)100μL/孔，每组设置3个平行孔。接毒72h后用4％多聚甲醛固定，以2E5鼠源MAb(1:100倍稀释)为一抗，以Alexa Fluor 546羊抗鼠抗体(1:1000倍稀释)为二抗，利用IFA检测感染ALV-K(JS14LH01)毒株的比例。
2结果
2.1Tva的关键功能性氨基酸位点G58、H59、W69及G70突变后对其介导ALV-A进入宿主细胞的功能评价
将DF-1-TvaKO细胞系接种至12孔板中，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M，转染后16h接ALV-A-GFP荧光毒株。接毒72h后观察GFP荧光比例。结果显示，与转染pCAGGS-Tva-WT的DF-1-TvaKO细胞相比，转染pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞接ALV-A-GFP毒株后无GFP荧光。表明pCAGGS-Tva-M丧失了介导ALV-A-GFP毒株感染的能力(图1)。
同样的，将DF-1-TvaKO细胞系接种至12孔板中，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M，转染16h后分别接ALV-A野生型毒株，接毒后72h进行间接免疫荧光实验检测。结果显示，与转染pCAGGS-Tva-WT的DF-1-TvaKO细胞相比，转染pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞接ALV-A野生型毒株后无ALV-A野生型毒株(红色荧光)感染。表明pCAGGS-Tva-M丧失了介导ALV-A野生型毒株感染的能力(图2)。
2.2Tva的关键功能性氨基酸位点G58、H59、W69及G70突变后对其介导ALV-K进入宿主细胞的功能评价
将DF-1-TvaKO细胞系接种至12孔板中，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M，转染后16h接ALV-K-GFP荧光毒株。接毒72h后观察GFP荧光比例。结果显示，与转染pCAGGS-Tva-WT的DF-1-TvaKO细胞相比，转染pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞接ALV-K-GFP毒株后无GFP荧光。表明pCAGGS-Tva-M丧失了介导ALV-K-GFP毒株感染的能力(图3)。
同样的，将DF-1-TvaKO细胞系接种至12孔板中，16h后分别转染pCAGGS-Tva-WT及pCAGGS-Tva-M，转染16h后分别接ALV-K野生型毒株，接毒后72h进行间接免疫荧光实验检测。结果显示，与转染pCAGGS-Tva-WT的DF-1-TvaKO细胞相比，转染pCAGGS-Tva-M的DF-1-TvaKO细胞接ALV-K野生型毒株后无ALV-K野生型毒株(红色荧光)感染。表明pCAGGS-Tva-M丧失了介导ALV-K野生型毒株感染的能力(图4)。
Claims (8)
1.一种突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第58位的氨基酸G突变为N、第59位的H突变为D，第69位的W突变为L、第70位的G突变为PQR。
2.如权利要求1所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)在研究Tva基因的功能以及其在制备抗A亚群及K亚群禽白血病病毒的生物材料中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物材料为抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的质粒所转染的细胞或抗A亚群及K亚群禽白血病基因编辑鸡。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细胞为DF-1细胞。
6.一种构建抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括将含有权利要求1或2所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)的载体转化Tva敲除的DF-1细胞的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的突变后的禽白血病病毒受体基因(Tva)连接至pCAGGS载体中，得到的载体命名为pCAGGS-Tva-M；
(2)取Tva敲除的DF-1细胞，铺至12孔板，15-20h后转染pCAGGS-Tva-M，得到同时抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞。
8.按照权利要求6或7所述的方法构建得到的抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211216666.1A CN116445493A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211216666.1A CN116445493A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116445493A true CN116445493A (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=87130842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211216666.1A Pending CN116445493A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116445493A (zh) |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211216666.1A patent/CN116445493A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Beer et al. | Characterization of novel simian immunodeficiency viruses from red-capped mangabeys from Nigeria (SIVrcmNG409 and-NG411) | |
| CN104962581B (zh) | 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株 | |
| Clark et al. | A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species | |
| US20160040135A1 (en) | Recombinant Modified Vaccinia Ankara (MVA) Vaccinia Virus Containing Restructured Insertion Sites | |
| CN110079541B (zh) | 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用 | |
| CN106967748B (zh) | 无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprv h/f蛋白疫苗的构建 | |
| RU2377248C2 (ru) | Устойчивые к грибкам растения и их использование | |
| CN1289682C (zh) | 通过使用牛痘ati启动子表达改良的安卡拉痘苗病毒中的基因 | |
| CN110468155A (zh) | 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用 | |
| Sprygin et al. | Capripoxviruses, leporipoxviruses, and orthopoxviruses: Occurrences of recombination | |
| CN114058619A (zh) | Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用 | |
| CN110029128A (zh) | 一种高效重组且无筛选标记的痘苗病毒载体及其建立方法 | |
| CN1759177A (zh) | 腺病毒血清型34载体,核酸及其由此产生的病毒 | |
| CN116445493A (zh) | 一种突变后的Tva基因及其在抗A亚群及K亚群禽白血病病毒感染中的应用 | |
| CN116376850A (zh) | B3基因型嵌合麻疹病毒减毒株和制备方法及用途 | |
| CN104975043A (zh) | 构建重组mva病毒的带有标记基因自删除系统的穿梭载体 | |
| CN105385666B (zh) | 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建 | |
| CN105274089B (zh) | 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 | |
| CN111349616B (zh) | 一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用 | |
| CN114292823A (zh) | 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用 | |
| CN107653254B (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组orf5基因及其制备方法 | |
| CN104651322A (zh) | 一种重组狂犬病病毒的构建及培养方法 | |
| JPH03505523A (ja) | 組換え痘瘡ウイルスの選択方法 | |
| KR20220018016A (ko) | J 아군 조류 백혈병 바이러스에 대한 저항성을 가진 유전자 변형된 가금류를 만드는 방법 | |
| CN115704033A (zh) | 一种突变后的k亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗k亚群禽白血病病毒感染中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |