CN116445483A

CN116445483A - 红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116445483A
Application number: CN202211533243.2A
Authority: CN
Inventors: 贾永红; 吴月燕; 俞辰杰
Original assignee: Zhejiang Wanli University
Current assignee: Zhejiang Wanli University
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2023-07-18

Abstract

本发明从红比利时杜鹃(Rhododendron×hybridum Hort)花瓣组织中获得一个具有较高启动活性的启动子，该启动子全长1235bp，能高效启动黄酮醇合成酶(Flavonol synthesis，FLS)基因的表达，通过对该启动子的顺式作用元件分析发现，MYB对FLS基因的转录作用明显；因此，通过加强或者减弱MYB的作用，可以直接作用于FLS基因的表达，从而实现花色控制的目标。本发明提供了还提供了所述基因启动子的制备方法，确定了通过调控FLS基因转录水平控制花色呈现的技术，本发明所提供的启动子在花色育种研究领域具有理论研究与实践应用价值。

Description

红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物育种研究领域，具体而言，涉及一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子及其制备方法和应用。

背景技术

启动子是位于基因编码区第一外显子起始密码子ATG上游区长约1000-2000bp不等的一段DNA序列。该段DNA序列不仅能与RNA聚合酶结合启动基因转录，更重要的是它能与转录因子结合启动下游目的基因的转录。结合启动子的转录因子的种类与数量影响下游目的基因的转录水平。研究表明，基因启动子的长度和序列差别很大。不同基因具有不同的启动子，即使是同一物种的同一家族基因的启动子也各不相同。因此，对启动子的研究，包括DNA序列、顺式作用元件组成、功能、转录因子结合位点与种类等方面的研究，不但能提高对下游基因转录水平的认识，而且筛选得到的高转录活性的启动子可以应用于植物分子育种研究，在理论研究和实践应用方面都具有重要作用。

比利时杜鹃花是一种从比利时引种到我国的西洋杜鹃，该花由皋月杜鹃(Rhododendron indicum)、映山红(R.simsii)及毛白杜鹃(R.mucronatum)等品种经长期、反复杂交而育成的一种园艺花卉新品种，该品种花色艳丽、颜色多样，花期多、花期长，具有较高的经济价值。近年来，受气候、环境等因素影响，比利时杜鹃花的环境适应性下降，逐渐呈现品种退化的迹象，特别是花色的种类和色泽度都有所下降。因此，亟待加强比利时杜鹃花花色性状的机制研究。

FLS是类黄酮代谢通路中的一种酶，可催化二氢黄酮醇氧化形成黄酮醇苷元，之后在尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)催化下发生糖基化修饰，最终形成稳定、多样的黄酮醇衍生物。因FLS干扰了类黄酮代谢通路下游的花色苷代谢通路中花色苷的合成，因此FLS对花色呈现具有负调控作用。因此，如果抑制FLS基因的转录水平，则可以提高花色呈现效果。而目前，红比利时杜鹃花瓣来源的FLS基因(黄酮醇合成酶基因)启动子及其相关报道还较少，对其技术的研究也比较欠缺。

发明内容

本发明要解决的其中一个技术问题是提供一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子，以填补该领域的技术空缺，进而提高花色的呈现效果。

为解决上述问题，本发明提供了一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子，所述启动子的序列包括：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(b)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中发生一处或多处点突变，但依然具备黄酮醇合成酶基因启动子功能的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体由所述的启动子与pCAMBIE1301质粒经基因重组技术构建。

本发明还提供了一种用于启动子扩增的重组细胞，所述重组细胞由所述的重组载体与大肠杆菌感受态DH5α制备而成。

本发明还提供了一种用于瞬时转化的重组细胞，所述重组细胞由所述的重组载体与根农杆菌GV3101制备而成。

本发明要解决的其中一个技术问题是提供上述启动子的制备方法，以填补该领域的技术空缺。

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于所述红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的方法，包含以下步骤：以红比利时杜鹃花瓣DNA为模板，使用3条特异性引物扩增，得到所述启动子，且所述3条特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3以及SEQ ID NO.4所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的应用，以解决目前红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子在花色呈现效果领域研究与开发不足的问题。

为了解决上述问题，本发明提供了一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的应用，所述应用包括所述的启动子应用于包括杜鹃花在内的园艺植物的花色育种研究与实践应用中。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明从红比利时杜鹃花瓣组织中获得一种高活性的FLS基因启动子，通过对获得序列顺式作用元件、功能、转录因子结合位点与种类的分析，确定出一条通过出干扰该基因表达而提高花色呈现的一种方法，提出了通过调控FLS基因转录水平控制花色呈现的技术。本发明提供的启动子及其应用在花色育种研究领域具有理论研究与实践应用价值。

附图说明

图1为红比利时杜鹃FLS基因启动子14种顺式作用元件的类型、位置与数量图表；

图2为红比利时杜鹃花瓣中FLS基因启动子顺式作用元件类型及其在序列中的位置示意图；

图3为重组载体中FLS基因启动子序列的分析图；

图4为重组载体中FLS基因启动子序列的分析图；

图5为烟草叶片瞬转脱色结果；图5中，A为FLS基因启动子重组载体染色结果，B为1301阳性载体染色结果，C为阴性载体染色结果，各3个重复。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明上述以及下述的FLS基因启动子即为黄酮醇合成酶基因启动子。

本发明提供了一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子，所述启动子的序列包括：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

本发明还提供了一种用于所述红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的方法，包含以下步骤：以红比利时杜鹃花瓣DNA为模板，使用3条特异性引物扩增，得到所述启动子，且所述3条特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的应用，所述应用包括所述的启动子应用于包括杜鹃花在内的园艺植物的花色育种研究与实践应用中。

以下结合具体的实验数据，以及实验方法对本发明上述的技术方案进行展开的描述：

实施例：

1、杜鹃花FLS基因启动子克隆

(一)红比利时杜鹃DNA的抽提

实验所用红比利时杜鹃的花瓣采自宁波北仑亿润花卉有限公司。采样植株要求健康、花朵繁茂、花色艳丽，实验花瓣要求瓣面干净匀称、色彩均匀、无虫斑。活体植株的花瓣先用洗瓶清洗表面浮尘，采集花瓣并迅速液氮冷冻。冷冻花瓣样品在实验室中采用CTAB法提取杜鹃基因组DNA备用。

(二)Tail-PCR引物设计与验证

参照Genome Walking Kit(CodeNo.6108)试剂盒的说明书，设计3条R端引物SP1、SP2、SP3(表1)，与试剂盒中的4条随机引物分别配对，进行3轮巢式PCR扩增。另外，设计两条OFR验证引物FLS-F、FLS-R(如表1所示)：

表1：Tail-PCR中3条R端引物SP1、SP2、SP3与FLS的OFR验证引物

(三)Tail-PCR实验过程

以红比利时杜鹃基因组DNA为模板，使用Vazyme公司的phantamaxfidelity DNApolymerase试剂盒，参照说明书PCR程序，以设计好的SP1、SP2、SP3等三条引物为下游引物，以试剂盒内的4条随机引物(AP1、AP2、AP3和AP4)为上游引物，分别进行三轮PCR扩增。三轮扩增实验过程如下：

第一轮PCR扩增(20个循环)：模板为红比利时基因组DNA，4条随机引物AP1、AP2、AP3、AP4与SP1引物分别配对进行4组第一轮PCR扩增，扩增程序为如下：

②1st PCR反应条件如下：

第二轮PCR扩增(20个循环)：分别取第一轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP2引物再次分别配对进行4组第二轮PCR扩增，扩增程序如下：

②2nd PCR反应条件如下：

第三轮CPR扩增(25个循环)：分别取第二轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP3引物再次分别配对进行4组第三轮PCR扩增(25个循环)。

②3rd PCR反应条件如下：

以上三轮PCR扩增结果表明，第三轮扩增产物中AP1-SP3扩增结果有明显条带，割胶回收此位置约2000bp的电泳条带。回收产物末端加A尾后，连接pMD19-T载体，构建T克隆，转化大肠杆菌后并经引物对FLS-F和SP3验证后，挑取阳性克隆送样测序，测序引物为通用引物M13(-47)，测序结果拼接后得到FLS基因的启动子序列，结果SEQ ID NO.1所示。

2、红比利时杜鹃花FLS基因启动子的顺式作用元件分析

借助PlantCARE对获得的1235个启动子序列做顺式作用元件分析。启动子序列如SEQ ID NO.1所示。启动子上顺式元件的名称、数量和位置如图1所示，图2为红比利时杜鹃花瓣中FLS基因启动子顺式作用元件类型及其在序列中的位置示意图。

3、重组载体的构建

PstI和NcoI双酶切pCambia1301载体，切除gus基因前的35S Promoter，回收载体骨架后和FLSP片段进行重组反应。反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布Kana抗性平板，37℃过夜培养后挑取8个抗性菌落，用上述扩增引物进行PCR鉴定阳性菌落后，挑取15号克隆进行测序。双向测序引物为M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC，Gus-R:GAAAAGGGTCCTAACCAAGA。结果显示，重组载体中所获得的启动子序列与Tail-PCR实验所获得的启动子序列完全一致，证明重组载体构建成功。测序结果及分析结果见图3、4所示。

4、重组载体转化拟南芥验证活性

(一)农杆菌注射接种本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

采用冻融法将重组质粒转化农杆菌株GV3101感受态(同时转化pCambia1301空载体和去除gus基因的1301载体分别作为阳性和阴性对照)，涂布在加有抗生素(含kana50mg/L、Rif 25mg/L、Gen 25mg/L)的LB培养基平板，挑取抗性单克隆进行PCR验证后，接入5ml YEP液体培养基(含上述同样抗生素)中，在28℃、160rmp转速的培养箱中过夜培养。培养物离心收集后用5ml的重悬液(含10mM MgCl₂、10mM MES、150μM As)重悬并室温静止3h。静置后的农杆菌注射5叶期的本氏烟草(约生长1个月)的叶片(下表皮)，每株可以注射2-3个叶片(处于植株的相同位置，生长状态、大小相近)，每个处理注射3片，设为3个重复。注射后的植株在25℃黑暗过夜后，转移到16h光照，8h黑暗条件下生长。

(二)GUS染色

农杆菌注射后3-5天，采集注射叶接种部位(3个重复)，加GUS染液于37℃过夜染色。染色后的叶片再用75％的乙醇脱色(去除叶绿素)，也于37℃过夜。倒掉脱色乙醇后再用75％乙醇清洗后观察并拍照，结果如图5所示。

如图5所示，FLS基因启动子重组载体的染色明显，表明本启动子活性显著。

通过启动子上顺式作用原件的分析发现，MYB对FLS基因的转录作用明显。因此，通过加强或者减弱MYB的作用，可以直接作用于FLS基因的表达，从而实现花色控制的目标。

通过上述实施例，也是进一步地证明了，本发明所提供的红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子和应用能够用在包括杜鹃花在内的园艺植物的花色育种研究与实践应用中，从而提高花色的呈现效果。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物基因工程领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子，其特征在于：所述启动子的序列包括：

(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由权利要求1所述的启动子与pCAMBIE1301质粒经基因重组技术构建。

3.一种用于启动子扩增的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞由权利要求2所述的重组载体与大肠杆菌感受态DH5α制备而成。

4.一种用于瞬时转化的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞由权利要求2所述的重组载体与根农杆菌GV3101制备而成。

5.一种用于制备权利要求1所述红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的方法，其特征在于，包含以下步骤：以红比利时杜鹃花瓣DNA为模板，使用3条特异性引物扩增，得到所述启动子，且所述3条特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示。

6.一种红比利时杜鹃花瓣来源的黄酮醇合成酶基因启动子的应用，其特征在于：所述应用包括将权利要求1所述的启动子应用于包括杜鹃花在内的园艺植物的花色育种研究与实践应用中。