CN116440949A - 一种负载席夫碱的团簇酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载希夫碱的铜团簇酶及其制备方法以及在催化和测定氧化应激标志物3‑硝基酪氨酸方面的应用。本发明所述的负载希夫碱的铜团簇酶是由对苯二甲醛与组氨酸在碱性条件下生成蓝绿色荧光的希夫碱，半胱氨酸与铜离子在希夫碱产物溶液中直接被还原生成红色发光的铜纳米簇。该材料的合成在水相中、室温下完成，操作简便，且具有酶的活性可催化还原3‑硝基酪氨酸，同时还能利用铜纳米簇被增强的荧光与希夫碱形成比率荧光，发光指示3‑硝基酪氨酸的含量，此复合材料兼具催化和发光传感功能。

Description

一种负载席夫碱的团簇酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于催化、传感、发光分析技术领域，具体涉及一种负载希夫碱的铜团簇酶及其制备方法和应用，特别涉及这种材料在催化和测定3-硝基酪氨酸方面的应用。
背景技术
人体中3-硝基酪氨酸（3-NT）是体内活性氧与蛋白质的酪氨酸反应形成的氧化损伤产物。国内外研究发现许多疾病如心血管疾病、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、类风湿关节炎、2型糖尿病等的病变组织中存在3-硝基酪氨酸。3-硝基酪氨酸是一种氧化损伤的标志物，一种重要的评估人体氧化应激水平的生物标志物。目前，3-硝基酪氨酸的分析方法主要有高效液相色谱、液质、气质串联液质等多种方法，也有一些快速、便捷的3-硝基酪氨酸测定方法被公开。中国专利公布号CN 107085022 A，2017年，潘育方等，3-硝基酪氨酸的分子印迹电化学传感器的制备及应用，公开了一种利用分子印迹电化学传感器测定3-硝基酪氨酸的方法。中国专利公布号CN 115181279 A，2022年，林宏艳等，用于检测人体的生物标志物3-硝基酪氨酸的荧光型金属-有机框架材料及其应用，公开了一种利用金属有机框架材料荧光检测3-硝基酪氨酸的方法。
现有的3-硝基酪氨酸测定方法有的需要复杂耗时的预处理和大型分析仪器，分析成本高，有的需要专业人员操作，因此，快速、便捷、低成本的3-硝基酪氨酸测定方法是迫切需要的，对相关疾病的诊疗具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶，一种既具有催化活性又具有双色荧光发射的人造酶材料，能像天然酶一样催化3-硝基酪氨酸的反应，又是一种发光指示剂能定量测定3-硝基酪氨酸的含量。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述负载希夫碱的团簇酶的制备方法，一种容易合成，无需专业人员操作的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了这种负载希夫碱的团簇酶作为一种催化剂在催化3-硝基酪氨酸反应方面的应用。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了这种负载希夫碱的铜团簇酶作为一种比色探针，通过颜色转变可视化的快速测定3-硝基酪氨酸的含量。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸方法。
本发明所要解决的第六个技术问题是提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶定量测定3-硝基酪氨酸的方法。
技术方案：为解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶，所述负载希夫碱的铜团簇酶是希夫碱与铜离子、半胱氨酸在还原剂作用下形成的铜团簇反应形成的希夫碱负载的铜团簇材料。
其中，所述希夫碱是将对苯二甲醛和组氨酸在碱性条件下合成得到。
其中，所述的负载希夫碱的铜团簇酶的粒径为2-5 nm。
其中，所述的负载希夫碱的铜团簇酶，具有希夫碱的蓝色和铜纳米簇的红色双重荧光发射。
其中，所述负载希夫碱的铜团簇酶中铜纳米簇作为催化单元，又是发光单元，与希夫碱形成比例发光探针，利用催化反应希夫碱能量传移敏化铜纳米簇的发光。
其中，所述的负载希夫碱的铜团簇酶可催化降解3-硝基酪氨酸（3-NT）。
其中，所述的负载希夫碱的铜团簇酶具有双重荧光指示功能，能通过蓝色荧光转变为红色荧光快速指示3-硝基酪氨酸的含量。
为解决上述第二个技术问题，本发明所述负载希夫碱的铜团簇酶制备方法包括如下步骤：
（1）制备希夫碱溶液：将组氨酸的水溶液与对苯二甲醛的二甲基亚砜溶液混合，搅拌并加入氢氧化钠溶液反应，反应6小时后直至溶液颜色变为黄色为止，得到希夫碱溶液，室温保存备用；
（2）制备负载希夫碱的铜团簇酶：在制备的希夫碱溶液中滴加酸使溶液pH值为7~8，加入半胱氨酸的水溶液与硝酸铜溶液构成混合液，剧烈搅拌，得到负载希夫碱的铜团簇酶溶液；置于4 ℃冰箱备用。
其中，步骤（1）中所述对苯二甲醛：组氨酸的摩尔比为1~2：1。
其中，步骤（1）中所述加入氢氧化钠溶液的浓度约为0.1~1 M；所述对苯二甲醛的二甲基亚砜溶液中溶剂二甲基亚砜的体积百分比浓度为20 %。
其中，步骤（2）的混合液中半胱氨酸：组氨酸：铜离子摩尔比为10：2~5：1。
为解决上述第三个技术问题，本发明提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶在催化3-硝基酪氨酸反应中的应用。
为解决上述第四个技术问题，本发明提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶在定量测定3-硝基酪氨酸中的应用。
为解决上述第五个技术问题，本发明提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸方法，具体步骤如下：将一定量的所述的负载希夫碱的铜团簇酶溶液加入到含有3-硝基酪氨酸的溶液中，混合均匀，根据负载希夫碱的铜团簇酶中铜纳米簇的荧光强度测定催化3-硝基酪氨酸的效率。
为解决上述第六个技术问题，本发明提供了一种负载希夫碱的铜团簇酶定量测定3-硝基酪氨酸的方法，具体步骤如下：首先将一定量的所述的负载希夫碱的铜团簇酶溶液加入到一系列已知浓度的3-硝基酪氨酸标准溶液中，混合均匀反应，测定溶液在615 nm和485 nm的荧光强度，并绘制615 nm/485 nm的荧光比率与3-硝基酪氨酸标准溶液浓度的工作曲线，然后在相同条件下测定3-硝基酪氨酸样品溶液的615 nm/485 nm的荧光比率，根据工作曲线和样品溶液的荧光比率得到样品中3-硝基酪氨酸的量。
有益效果：与现有技术相比，本发明的负载希夫碱的铜团簇酶具有以下优点：
1）本发明的负载希夫碱的铜团簇酶既具有较高催化活性又具有双色荧光发射，相比天然酶，无机酶稳定，使用寿命长、成本低。
2）本发明的负载希夫碱的铜团簇酶无需其它试剂的参与可直接催化还原3-硝基酪氨酸，并能荧光显示催化效率。
3）本发明的负载希夫碱的铜团簇酶以发光颜色转变指示3-硝基酪氨酸的含量，灵敏度高，是一种灵敏、快速可视化的3-硝基酪氨酸测定方法。
4）本发明的负载希夫碱的铜团簇酶的制备方法简单、无需复杂有机合成和专业人员操作。
附图说明
图1 负载希夫碱的铜团簇酶的透射电镜图；
图2希夫碱溶液的荧光光谱图；
图3铜团簇的荧光光谱图；
图4负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸的紫外吸收光谱图；
图5 负载希夫碱的铜团簇酶在不同浓度的3-硝基酪氨酸存在下的荧光光谱图；
图6 负载希夫碱的铜团簇酶荧光检测3-硝基酪氨酸的工作曲线。
实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1 负载希夫碱的铜团簇酶的制备
希夫碱的制备：将2 mL的组氨酸（2 mM）水溶液与2 mL对苯二甲醛（2 mM）的二甲基亚砜（DMSO）溶液混合，构成对苯二甲醛：组氨酸的摩尔比为1：1的混合溶液，在激烈搅拌下向混合溶液中加入1 mL氢氧化钠溶液（0.1 M），搅拌约6小时后，溶液由无色变为黄色直至不变，得到希夫碱溶液。图2是制备的希夫碱溶液的荧光光谱图，希夫碱发射在485 nm。
负载希夫碱的铜团簇酶的制备：取1 mL上述制备的希夫碱溶液，滴加醋酸使溶液的pH值为7，加入2 mL半胱氨酸（1 mM）水溶液与0.1 mL硝酸铜水溶液（2 mM），构成半胱氨酸：组氨酸：铜离子摩尔比为10：4：1的溶液，混合搅拌1小时，以10000 转/分钟的速率离心10分钟，获得的上清液作为负载希夫碱的铜团簇酶溶液。图1是制备的负载希夫碱的铜团簇酶的透射电镜图，负载希夫碱的铜团簇酶的大小为2-5 nm。上述步骤中，以水代替希夫碱溶液，在相同的条件下制备铜团簇，图3是制备的铜团簇的荧光光谱图，铜团簇的最大发射在615 nm。
实施例2 负载希夫碱的铜团簇酶的制备
希夫碱的制备：将2 mL的组氨酸（1 mM）水溶液与2 mL对苯二甲醛（2 mM）的二甲基亚砜（DMSO）溶液混合，构成对苯二甲醛：组氨酸的摩尔比为2：1的混合溶液，在激烈搅拌下向上述混合溶液中加入1 mL (0.1 M)的氢氧化钠溶液，搅拌约6小时后，溶液由无色变为黄色直至不变，得到希夫碱溶液。
负载希夫碱的铜团簇酶的制备：取1 mL的上述制备的希夫碱溶液，滴加醋酸使溶液的pH值为7，加入2 mL的半胱氨酸（1 mM）水溶液与0.1 mL硝酸铜水溶液（2 mM），构成半胱氨酸：组氨酸：铜离子摩尔比为10：2：1的溶液，混合搅拌1小时，以10000 转/分钟的速率离心10分钟，获得的上清液作为负载希夫碱的铜团簇酶溶液。
实施例3 负载希夫碱的铜团簇酶的制备
希夫碱的制备：将2 mL的组氨酸（1 mM）水溶液与2 mL对苯二甲醛（2 mM）的二甲基亚砜溶液混合，构成对苯二甲醛：组氨酸的摩尔比为2：1的溶液，在激烈搅拌下向上述混合溶液中加入1 mL (0.1 M)的氢氧化钠溶液，搅拌约6 小时后，溶液由无色变为黄色直至不变，得到希夫碱溶液。
负载希夫碱的铜团簇酶的制备：取0.5 mL的上述制备的希夫碱溶液，滴加醋酸使溶液的pH值为8，加入2 mL的半胱氨酸（1 mM）水溶液与0.1 mL硝酸铜水溶液（2 mM），构成半胱氨酸：组氨酸：铜离子摩尔比为10：1：1的溶液，混合搅拌1小时，以10000 转/分钟的速率离心10分钟，获得的上清液作为负载希夫碱的铜团簇酶溶液。
实施例4 负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸
取10 μL 3-硝基酪氨酸水溶液（0.1 mM）加入到1970 mL HEPES (N-2-羟乙基哌嗪-N '-2-乙磺酸) (10 mM，pH 7.0) 缓冲溶液中，加入20 mL实施例1制备的负载希夫碱的铜团簇酶溶液，混合均匀，每间隔5分钟测试溶液的紫外吸收光谱。图4是3-硝基酪氨酸被负载希夫碱的铜团簇酶催化0，5，10，15，20，25 分钟反应的紫外吸收光谱图，负载希夫碱的铜团簇酶加入后，3-硝基酪氨酸的硝基被还原成氨基，在277 nm的吸收峰不断升高，说明负载希夫碱的铜团簇具有还原酶的活性。
实施例5 负载希夫碱的铜团簇酶荧光测定3-硝基酪氨酸
取0.5 mL实施例1制备的负载希夫碱的铜团簇酶溶液加入到1.5 mL HEPES (10mM，pH 7.0) 缓冲溶液中，将10 μL不同浓度的3-硝基酪氨酸溶液依次加入到上述缓冲液中配制成含有3-硝基酪氨酸的浓度为0，10，50，100，200 nM的标准溶液，混合均匀反应20分钟后，在360 nm激发下测定615和485 nm的荧光强度。图5负载希夫碱的铜团簇酶在不同浓度的3-硝基酪氨酸存在下的荧光光谱图，485 nm的荧光强度不断降低，615 nm的荧光强度不断上升，615 nm/485 nm荧光比值与3-硝基酪氨酸的浓度成线性正比，图6是负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸的工作曲线，3-硝基酪氨酸的检测限为10 nM。

Claims (9)

1.一种负载希夫碱的铜团簇酶，其特征在于，所述负载希夫碱的铜团簇酶是希夫碱与铜离子、半胱氨酸在还原剂作用下形成的铜团簇反应形成的希夫碱负载的铜团簇材料。
2.根据权利要求1所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶，其特征在于，所述希夫碱是将对苯二甲醛和组氨酸在碱性条件下合成得到。
3.根据权利要求1所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶，其特征在于，所述负载希夫碱的铜团簇酶的粒径为2-5 nm。
4.权利要求1~3任一项所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备希夫碱溶液：将组氨酸的水溶液与对苯二甲醛的二甲基亚砜溶液混合，搅拌并加入氢氧化钠溶液反应，获得希夫碱溶液；
（2）制备负载希夫碱的铜团簇酶：在制备的希夫碱溶液中滴加酸使溶液pH值为7~8，加入半胱氨酸的水溶液与硝酸铜溶液构成混合液，剧烈搅拌，得到负载希夫碱的铜团簇酶溶液。
5.根据权利要求4所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述对苯二甲醛与组氨酸的摩尔比为1~2：1；步骤（2）中所述希夫碱溶液的pH值为7~8，其中，半胱氨酸：组氨酸：铜离子摩尔比为10：2~5：1。
6.权利要求1~3任一项所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶在催化3-硝基酪氨酸反应中的应用。
7.权利要求1~3任一项所述的一种负载希夫碱的铜团簇酶在定量测定3-硝基酪氨酸中的应用。
8.一种负载希夫碱的铜团簇酶催化3-硝基酪氨酸方法，其特征在于，具体步骤如下：将一定量的权利要求1~3任一项所述的负载希夫碱的铜团簇酶溶液加入到含有3-硝基酪氨酸的溶液中，混合均匀，根据负载希夫碱的铜团簇酶中铜纳米簇的荧光强度测定催化3-硝基酪氨酸的效率。
9.一种负载希夫碱的铜团簇酶定量测定3-硝基酪氨酸的方法，其特征在于，具体步骤如下：首先将一定量的权利要求1~3任一项所述的负载希夫碱的铜团簇酶溶液加入到一系列已知浓度的3-硝基酪氨酸标准溶液中，混合均匀反应，测定溶液在615 nm和485 nm的荧光强度，并绘制615 nm/485 nm的荧光比率与3-硝基酪氨酸标准溶液浓度的工作曲线，然后在相同条件下测定3-硝基酪氨酸样品溶液的615 nm/485 nm的荧光比率，根据工作曲线和样品溶液的荧光比率得到样品中3-硝基酪氨酸的量。
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