CN116429928A - 一种多糖铁鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖铁鉴别方法，包括如下步骤：1)解络合，将多糖铁供试品溶于水中，加入磷酸盐解络合，沉淀，取上清液；2)水解，取步骤1)中的上清液，用酸调节pH至酸性，加热进行水解，水解完成后，冷却，用碱调节pH至4‑6，过滤，得到多糖酸溶液；3)多糖铁中多糖末端基团检测，采用安捷伦高效液相色谱仪进行检测，以葡萄糖、对应多糖铁的多糖酸钠的混合溶液作为对照品，检测步骤2)水解溶液中的多糖酸与对照品中的多糖酸钠的相对保留时间是否一致，以确定多糖铁的多糖酸类别；4)多糖铁中多糖的分子量测定。采用高效液相色谱法测定多糖铁中多糖的分子量和R基团，最终达到对多糖具体种类结构进行鉴别的目的。
Description
技术领域
本发明涉及化合物分析技术领域，特别是一种多糖铁鉴别方法。
背景技术
合成多糖铁采用的多糖不同，可合成不同的多糖铁。多糖的差异分为分子量的差异和R基团的差异。关于多糖铁的鉴别，目前大多只对供试品进行铁鉴别和糖鉴别，其中糖鉴别仅仅是采用糖的化学反应鉴别供试品中是否含有糖，而未对糖的种类进行鉴别，所以无法达到区分不同多糖铁的目的。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种多糖铁鉴别方法，采用高效液相色谱法测定多糖铁中多糖的分子量和R基团，最终达到对多糖具体种类结构进行鉴别的目的。
实现上述目的本发明的技术方案为：一种多糖铁鉴别方法，包括如下步骤：
1)解络合，将多糖铁供试品溶于水中，加入磷酸盐解络合，沉淀，取上清液；
2)水解，取步骤1)中的上清液，用酸调节pH至酸性，加热进行水解，水解完成后，冷却，用碱调节pH至4-6，过滤，得到多糖酸溶液；
3)多糖铁中多糖末端基团检测，采用安捷伦高效液相色谱仪进行检测，以葡萄糖、对应多糖铁的多糖酸钠的混合溶液作为对照品，检测步骤2)水解溶液中的多糖酸与对照品中的多糖酸钠的相对保留时间是否一致，以确定多糖铁的多糖酸类别；
4)多糖铁中多糖的分子量测定，采用分子排阻法测定多糖分子量；取多糖铁，加入磷酸盐解络合至灰白色，取出放冷，纯化水稀释至刻度，过滤，取滤液进样检测。
上述方案中：步骤1)解络合时水的加入量与供试品称量的比值为8-15ml/g。
上述方案中：步骤1)解络合时所述磷酸盐为磷酸二氢钾及其结晶水合物。
为区分不同的多糖铁，本发明采用高效液相色谱法检测多糖铁中多糖(多糖通式：Gn-R，其中G表示葡萄糖，n表示葡萄糖的数量，R表示多糖的末端连接基团)的分子量及多糖的R结构(R为-OCH2(CHOH)4CH2OH(对应水解产物为葡萄糖)或-OCH2(CHOH)nCOOH(对应水解产物为多碳糖酸及其含盐化合物))，从而达到区别不同多糖铁目的。
多糖铁解络合溶液用于继续水解时，解络合采用的盐应采用磷酸二氢钾。在实验中，惊奇的发现在多糖铁用量一致的情况下，采用磷酸二氢钾解络合的溶液继续水解得到的多碳糖酸或多碳糖酸盐较使用磷酸二氢钠时的检测响应值高出许多。
上述方案中：所述磷酸盐的加入量与供试品的质量比为0.005-0.08mol/g。优选为0.014-0.018mol/g。
上述方案中：解络合的温度为80℃以上。
上述方案中：步骤4)中解络合的磷酸盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，磷酸盐的加入量与供试品的质量比为0.005-0.08mol/g。
上述方案中：水解步骤中，用酸调节pH1-2，水解温度控制在140-180℃，水解时间60-100min。
上述方案中：高效液相色谱的条件为：采用XAmide色谱柱；10mmol/L的磷酸氢二钠—乙腈(20:80)为流动相，10mmol/L的磷酸氢二钠用磷酸调pH至2.8，流速1.0ml/min,柱温35℃；采用紫外检测器，检测波长为200nm。
上述方案中：多糖铁中多糖的分子量测定包括如下步骤：
1)色谱条件
以亲水性球型高聚物为填充剂，选用ShodexOHpak色谱柱，以质量浓度为0.71％硫酸钠溶液为流动相，磷酸调节pH至4.5±0.3；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；示差折光检测器温度为40℃；进样体积20μl；
2)供试溶液配制
将解络合完成后的反应液取出，放冷，纯化水稀释至刻度，过滤取滤液进样检测；
3)分子量对照品溶液：取5-6个葡萄糖分子量对照品，配成约5mg/ml，作为分子量对照品溶液。
4)标准曲线的建立
取分子量对照品溶液进样，记录色谱图，采用GPC软件绘制标准曲线，要求相关系数R不得小于0.998。
5)供试品分子量的测定
取供试品溶液进样检测，记录色谱图，以分子量标准曲线计算供试品重均分子量。
有益效果：本发明采用高效液相色谱法检测多糖铁中多糖(多糖通式：Gn-R，其中G表示葡萄糖，n表示葡萄糖的数量，R表示多糖的末端连接基团)的分子量及多糖的R结构(R为-OCH2(CHOH)4CH2OH(对应水解产物为葡萄糖)或-OCH2(CHOH)nCOOH(对应水解产物为多碳糖酸及其含盐化合物))，从而达到区别不同多糖铁目的，操作简单，适用。
附图说明
图1为实施例1多糖末端基团检测图。
图2为实施例1的分子量检测标准曲线。
图3为实施例2的多糖末端基团检测图。
图4为实施例2的分子量检测标准曲线。
图5为按照实施例1的方法，采用磷酸二氢钠解络合后，多糖末端基团检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行具体描述。
实施例1
多糖铁，CAS号为：57680-55-4
1)多糖铁中多糖末端基检：
用安捷伦高效液相色谱仪进行检测，以葡萄糖、对应葡庚糖酸钠的混合溶液作为对照品，检测多糖酸溶液中的多糖酸与对照品中的多糖酸钠的保留时间是否一致，以确定多糖铁的多糖酸类别；
多糖铁解络合及多糖水解
取CAS号为：57680-55-4的多糖铁10g，加80ml水80℃加热溶解，加入约24g磷酸二氢钾(0.176mol)，80℃加热解络合至灰绿色，离心沉淀，取上清液，用浓盐酸调节pH值至1.5左右，密封，置160℃水解反应80min，取出放冷，用5mol/L的氢氧化钠调节pH至4.5左右，过滤即得葡庚糖酸溶液。
取CAS号为：57680-55-4的多糖铁10g，加80ml水80℃加热溶解，加入约24g磷酸二氢钠，80℃加热解络合至灰绿色，离心沉淀，取上清液，用浓盐酸调节pH值至1.5左右，密封，置160℃水解反应80min，取出放冷，用5mol/L的氢氧化钠调节pH至4.5左右，过滤即得葡庚糖酸溶液。
采用磷酸二氢钠解络合所得检测结果如图5所示，对比图1磷酸二氢钾解络合的溶液继续水解得到的多碳糖酸或多碳糖酸盐较使用磷酸二氢钠时的检测响应值高出许多。
溶液配制
系统适用性溶液：取葡萄糖5mg、葡萄糖酸钠1mg、葡庚糖酸钠1mg置同一进样小瓶中，加1ml空白溶剂溶解即得/(葡萄糖定位溶液：取葡萄糖对照品适量，空白溶剂(流动相，10mmol/L的磷酸氢二钠(磷酸调pH至2.8)—乙腈(80:20))配成每1ml含葡萄糖5mg的溶液；葡萄糖酸钠定位溶液：取葡萄糖酸钠对照品适量，空白溶剂配成每1ml含葡萄糖酸钠1mg的溶液；葡庚糖酸钠定位溶液：取葡庚糖酸钠对照品适量，空白溶剂配成每1ml含葡庚糖酸钠1mg的溶液。)
色谱条件
采用XAmide色谱柱(5m 100A 4.6*250nm)；10mmol/L的磷酸氢二钠(磷酸调pH至2.8)—乙腈(20:80)为流动相，流速1.0ml/min,柱温35℃；采用紫外检测器，检测波长为200nm。
分别精密吸取空白溶剂、系统适用性溶液、水解溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂、葡萄糖、葡萄糖酸钠、葡庚糖酸钠、样品色谱图见图1。结果表明空白溶剂、葡萄糖、葡萄糖酸不干扰葡庚糖酸测定。
系统精密度试验
精密吸取系统适用性溶液10μl，连续进样6次，计算系统适用性溶液主峰保留时间的RSD％值，结果见表1。结果表明，系统适用性溶液6次进样结果中主峰保留时间RSD％分别为0.3％、0.2％、0.2％，说明本验证方法系统精密度良好。
表1系统精密度试验结果
重复性试验
平行制备6份供试品溶液，进样10μl进行测定。计算葡庚糖酸峰保留时间的RSD％值，结果见表2。结果表明，6份供试品进样检测后均有葡庚糖酸峰，出峰时间RSD％值为0.1％，说明本验证方法的重复性良好。
表2重复性试验
耐用性试验
为了考察测试条件发生微小变动时，对测定结果的影响，对流速、ph值、柱温、检测波长、流动相比例等因素进行微小变动并考察其对结果的影响。各因素变化范围见表3。制备供试品溶液，制备葡萄糖、葡萄糖酸钠、葡庚糖酸钠定位溶液，进样10μl进行测定。各溶液保留时间结果见表3。结果表明，各测试条件进行微小变动时，葡萄糖、葡萄糖酸不干扰葡庚糖酸测定。
表3耐用性试验
通过使用效液相色谱法，建立了一种对CAS号为：57680-55-4的多糖铁水解产物的专属鉴别方法，并以葡萄糖、葡萄糖酸钠、葡庚糖酸钠为对照，精密度高，重复性好，耐用性好，为CAS号为：57680-55-4的多糖铁后续质量研究奠下基础。
2)多糖铁中多糖的分子量测定方法。本方法采用分子排阻法测定多糖分子量，包括如下步骤：
色谱条件
以亲水性球型高聚物为填充剂，选用Shodex OHpak或其他适宜色谱柱，以0.71％硫酸钠溶液为流动相，磷酸调节pH至4.5(±0.3)；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；示差折光检测器温度为40℃；进样体积20μl。
溶液配制
供试品溶液：取多糖铁约100mg，加入约2mol/L的磷酸二氢钠或磷酸二氢钾4ml，水浴50℃解络合至灰白色，取出放冷，纯化水稀释至刻度，过滤，取滤液进样检测。
分子量对照品溶液：取分子量1030、2700、5250、9750、13050的葡萄糖分子量对照品，配成约5mg/ml，作为分子量对照品溶液。
标准曲线的建立
取分子量对照品溶液进样，记录色谱图，采用GPC软件绘制标准曲线，要求相关系数R不得小于0.998。标准曲线如图2，其中R为0.999。
供试品分子量的测定
取供试品溶液进样检测，记录色谱图，以分子量标准曲线计算供试品重均分子量。
实施例2
多糖铁，CAS号为：9004-66-4的多糖铁
1)多糖铁中多糖末端基检：
用安捷伦高效液相色谱仪进行检测，以葡萄糖、对应葡萄糖酸钠的混合溶液作为对照品，检测多糖酸溶液中的多糖酸与对照品中的多糖酸钠的保留时间是否一致，以确定多糖铁的多糖酸类别；
多糖铁解络合及多糖水解
取CAS号为：9004-66-4的多糖铁10g，加150ml水80℃加热溶解，加入约20g磷酸二氢钾(0.146mol)，80℃加热解络合，离心沉淀，取上清液，用浓盐酸调节pH值至1.5左右，密封，置180℃水解反应60min，取出放冷，用5mol/L的氢氧化钠调节pH至4.5左右，过滤即得葡萄糖酸溶液。
溶液配制
系统适用性溶液：取葡萄糖5mg、葡萄糖酸钠1mg、置同一进样小瓶中，加1ml空白溶剂溶解即得/(葡萄糖定位溶液：取葡萄糖对照品适量，空白溶剂配成每1ml含葡萄糖5mg的溶液；葡萄糖酸钠定位溶液：取葡萄糖酸钠对照品适量，空白溶剂配成每1ml含葡萄糖酸钠1mg的溶液；)色谱条件
采用XAmide色谱柱(5m 100A 4.6*250nm)；10mmol/L的磷酸氢二钠(磷酸调pH至2.8)—乙腈(20:80)为流动相，流速1.0ml/min,柱温35℃；采用紫外检测器，检测波长为200nm。
分别精密吸取空白溶剂、系统适用性溶液、水解溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂、葡萄糖、葡萄糖酸钠样品色谱图见图3。结果表明空白溶剂、葡萄糖不干扰葡萄糖酸测定。
通过使用效液相色谱法，建立了一种对CAS号为：9004-66-4的多糖铁水解产物的专属鉴别方法，并以葡萄糖、葡萄糖酸钠为对照，精密度高，重复性好，耐用性好，为9004-66-4的多糖铁后续质量研究奠下基础。
2)多糖铁中多糖的分子量测定方法。本方法采用分子排阻法测定多糖分子量，包括如下步骤：
色谱条件
以亲水性球型高聚物为填充剂，选用Shodex OHpak或其他适宜色谱柱，以0.71％硫酸钠溶液为流动相，磷酸调节pH至4.5(±0.3)；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；示差折光检测器温度为40℃；进样体积20μl。
溶液配制
供试品溶液：取多糖铁约100mg，加入约2mol/L的磷酸二氢钠或磷酸二氢钾4ml，水浴50℃解络合至灰白色，取出放冷，纯化水稀释至刻度，过滤，取滤液进样检测。
分子量对照品溶液：取分子量1030、2700、5250、9750、13050的葡萄糖分子量对照品，配成约5mg/ml，作为分子量对照品溶液。
a.标准曲线的建立
取分子量对照品溶液进样，记录色谱图，采用GPC软件绘制标准曲线，要求相关系数R不得小于0.998。标准曲线如图4，其中R为0.999。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种多糖铁鉴别方法，包括如下步骤：
1)解络合，将多糖铁供试品溶于水中，加入磷酸盐解络合，沉淀，取上清液；
2)水解，取步骤1)中的上清液，用酸调节pH至酸性，加热进行水解，水解完成后，冷却，用碱调节pH至4-6，过滤，得到多糖酸溶液；
3)多糖铁中多糖末端基团检测，采用安捷伦高效液相色谱仪进行检测，以葡萄糖、对应多糖铁的多糖酸钠的混合溶液作为对照品，检测步骤2)水解溶液中的多糖酸与对照品中的多糖酸钠的相对保留时间是否一致，以确定多糖铁的多糖酸类别；
4)多糖铁中多糖的分子量测定，采用分子排阻法测定多糖分子量；取多糖铁，加入磷酸盐解络合至灰白色，取出放冷，纯化水稀释至刻度，过滤，取滤液进样检测。
2.根据权利要求1所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：步骤1)解络合时水的加入量与供试品称量的比值为8-15ml/g。
3.根据权利要求2所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：步骤1)中解络合时，所述磷酸盐为磷酸二氢钾及其结晶水合物。
4.根据权利要求3所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：所述磷酸盐的加入量与供试品的质量比为0.005-0.08mol/g。
5.根据权利要求4所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：解络合的温度为80℃以上。
6.根据权利要求1-5任一项所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：步骤4)中解络合的磷酸盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，磷酸盐的加入量与供试品的质量比为0.005-0.08mol/g。
7.根据权利要求6所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：水解步骤中，用酸调节pH1-2，水解温度控制在140-180℃，水解时间60-100min。
8.根据权利要求1所述多糖铁鉴别方法，其特征在于：高效液相色谱的条件为：采用XAmide色谱柱；10mmol/L的磷酸氢二钠—乙腈(20:80)为流动相，10mmol/L的磷酸氢二钠用磷酸调pH至2.8，流速1.0ml/min,柱温35℃；采用紫外检测器，检测波长为200nm。
9.根据权利要求8所述多糖铁鉴别方法，其特征在于，多糖铁中多糖的分子量测定包括如下步骤：
1)色谱条件
以亲水性球型高聚物为填充剂，选用Shodex OHpak色谱柱，以质量浓度为0.71％硫酸钠溶液为流动相，磷酸调节pH至4.5±0.3；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；示差折光检测器温度为40℃；进样体积20μl；
2)供试溶液配制
将解络合完成后的反应液取出，放冷，纯化水稀释至刻度，过滤取滤液进样检测；
3)分子量对照品溶液：取5-6个葡萄糖分子量对照品，配成约5mg/ml，作为分子量对照品溶液。
4)标准曲线的建立
取分子量对照品溶液进样，记录色谱图，采用GPC软件绘制标准曲线，要求相关系数R不得小于0.998。
5)供试品分子量的测定
取供试品溶液进样检测，记录色谱图，以分子量标准曲线计算供试品重均分子量。
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