CN116421658A - 用于治疗黑色素瘤的中药组合物、制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了用于治疗黑色素瘤的中药组合物、制剂及制备方法；制备方法包括：(1)取设定量的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘；(2)将红豆杉酶解，用乙酸乙酯提取红豆杉酶解产物，将乙酸乙酯提取产物进行提纯、结晶，得到红豆杉提取物；(3)将雨生红球藻粉碎，用去离子水提取，得到雨生红球藻提取物；(4)用乙醇提取分别得到牡蛎干提取物、诺丽果提取物和沙棘提取物；(5)将牡蛎干提取物、诺丽果诺丽果提取物、沙棘提取物与雨生红球藻提取物混合，得到提取混合物；进一步进行CO2超临界萃取，得到混合萃取物；(6)将红豆杉提取物、混合萃取物按照设定质量比混合，得到中药组合物，其对黑色素瘤具有很高的抑瘤率。
Description
技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体涉及用于治疗黑色素瘤的中药组合物、制剂及制备方法。
背景技术
黑色素瘤是临床上较为常见的肿瘤之一，我国的黑色素瘤发病率较低，但是近年来成上升态势。
中医药在治疗肿瘤方面具有独特的优势，以中药为代表的天然药物具有毒副作用小、作用靶点多，耐受性好等特点，在肿瘤治疗方面愈加受到重视。
研究黑色素瘤的发病机理和致病因素，研制出能够有效治疗黑色素瘤的药物或治疗方法，一直是本领域技术人员的研究方向之一。
发明内容
有鉴于此，一些实施例公开了用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，该方法包括：
(1)取设定量的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘；
(2)将红豆杉酶解，然后用乙酸乙酯提取红豆杉酶解产物，将乙酸乙酯提取产物进行提纯、结晶，得到红豆杉提取物；
(3)将雨生红球藻粉碎，用去离子水提取粉碎的雨生红球藻，得到雨生红球藻提取物；
(4)用乙醇分别提取牡蛎干、诺丽果和沙棘，得到牡蛎干提取物、诺丽果提取物和沙棘提取物；
(5)将牡蛎干提取物、诺丽果提取物、沙棘提取物与雨生红球藻提取物混合，得到提取混合物；将得到的提取混合物进行CO2超临界萃取，得到牡蛎干、诺丽果、沙棘与雨生红球藻提取物的混合萃取物；
(6)将红豆杉提取物、混合萃取物按照设定的质量比混合，得到中药组合物。
进一步，一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，红豆杉在纤维素酶的作用下酶解。例如，将红豆杉粉碎、研磨，与冰醋酸溶液混合，然后加入纤维束酶进行超声酶解；然后利用乙酸乙酯对酶解产物进行萃取，得到红豆杉提取物。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，包括对红豆杉提取物进一步进行纯化，具体包括步骤：
(2-1)红豆杉提取物与中性氧化铝混合；
(2-2)利用硅胶或氧化铝层析柱对得到的混合物进行层析，先利用石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再利用乙醇与乙酸乙酯混合液洗脱，收集乙醇与乙酸乙酯混合液馏分，减压除去乙醇与乙酸乙酯，得到初级纯化品；
(2-3)利用聚丙烯酸甲酯型树脂柱和聚苯乙烯树脂柱层作为层析柱，利用二氯甲烷与丙酮混合液为洗脱液，依次对初级纯化品进行层析，得到红豆杉提取物纯品。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，包括对红豆杉提取物纯品进一步进行结晶精制，得到精制红豆杉提取物。例如，利用甲醇溶液对红豆杉提取物进行溶解结晶，得到红豆杉结晶物。通常溶解结晶进行多次，有利于提高结晶度更高的红豆杉结晶物，例如，红豆杉提取物纯品经过两次或三次溶解结晶精制过程，得到红豆杉结晶物。
另一方面，一些实施例公开了用于治疗黑色素瘤的中药组合物，由用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法得到。
进一步，一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，以质量份计，红豆杉为20～30份，雨生红球藻为15～30份，牡蛎干为15～25份，诺丽果为15～25份，沙棘为10～20份。
再一方面，一些实施例公开了用于治疗黑色素瘤的中药制剂，该中药制剂中包含有用于治疗黑色素瘤的中药组合物。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，还包括药学上可接受的辅料。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，中药制剂的剂型包括汤剂、丸剂、膏剂、散剂、露剂、丹剂、酒剂、锭剂。
本发明实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物、制剂及制备方法，得到的中药组合物和制剂，无毒副作用，对黑色素瘤具有很高的抑瘤率。
附图说明
图1实施例2黑色素瘤体积对照示意图；
图2实施例2阿可拉定组、中药冲剂组抑瘤率示意图。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本发明实施例中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明实施例公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明实施例所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明实施例中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
在不冲突的前提下，本发明实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本发明实施例公开的内容。
红豆杉也称为紫杉，是世界上公认的抗癌植物。从其树皮中分离提取的天然次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对于癌症发病率高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。
雨生红球藻中由于含有1.5％～10.0％的天然虾青素，成为目前为止延缓衰老的最强元素。由于虾青素能够显著抑制化学物诱导的初期癌变，对暴露于致癌物中的上皮细胞具有抗增殖作用和强化免疫作用，如抑制膀胱癌、口腔癌、结肠癌、胃癌和乳腺癌的生长。虾青素还能降低黄曲霉毒素诱导的肝肿瘤细胞的数量。
诺丽果是茜草科巴戟天属，热带常绿多年生阔叶灌木或小乔木的果实，含有环烯醚萜、蒽醌、木质素、香豆素、三萜、甾醇、黄酮及其苷类等成分。具有解渴消暑、补充身体营养物质的作用。
沙棘，又名醋柳果、酸刺、达尔、沙枣等，味甘、酸，性温；归脾、胃、肺、心经；据现代科学分析，沙棘果实中含有维生素、黄酮类及多酚类、不饱和脂肪酸、植物甾醇类及植物固醇、微量元素等400多种生物活性成分，被称为“生物活性物质宝库”，其中维生素C含量很高，素有“维生素C之王”的美称。
发明人发现，将一定质量比的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘进行组方，利用不同的方法提取红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘原药中的有效成分，将有效成分按照一定的比例组成中组合物，对黑色素瘤具有良好的治疗效果。
在一些实施方式中，用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法包括：
(1)取设定量的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘；
(2)将红豆杉酶解，然后用乙酸乙酯提取红豆杉酶解产物，将乙酸乙酯提取产物进行提纯、结晶，得到红豆杉提取物；
(3)将雨生红球藻粉碎，用去离子水提取粉碎的雨生红球藻，得到雨生红球藻提取物；
(4)分别将牡蛎干、诺丽果和沙棘粉碎，用乙醇分别提取得到牡蛎干提取物、诺丽果提取物和沙棘提取物；
(5)将牡蛎干提取物、诺丽果提取物、沙棘提取物与雨生红球藻提取物混合，得到提取混合物；将得到的提取混合物进行CO2超临界萃取，得到牡蛎干、诺丽果、沙棘与雨生红球藻提取物的混合萃取物；
(6)将红豆杉提取物、混合萃取物按照质量比1:3混合，得到中药组合物。
一些实施例中，用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法采用的原药组成为，以质量份计，红豆杉20～30份，雨生红球藻15～30份，牡蛎干15～25份，诺丽果15～25份，沙棘10～20份。
一些较为优选的实施例中，用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法采用的原药组成为，以质量份计，红豆杉22～28份，雨生红球藻18～25份，牡蛎干15～25份，诺丽果23～30份，沙棘8～10份。
更为优选的实施例中，用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法采用的原药组成为，以质量份计，红豆杉25份，雨生红球藻20份，牡蛎干20份，诺丽果18份，沙棘17份。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，红豆杉在纤维素酶的作用下酶解。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，对红豆杉提取物进一步进行纯化，具体包括步骤：
(2-1)红豆杉提取物与中性氧化铝混合；
(2-2)利用硅胶或氧化铝层析柱对得到的混合物进行层析，先利用石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再利用醇与乙酸乙酯混合液洗脱，收集醇与乙酸乙酯混合液馏分，减压除去醇与乙酸乙酯，得到初级纯化品；
(2-3)利用聚丙烯酸甲酯型树脂柱和聚苯乙烯树脂柱层作为层析柱，利用二氯甲烷与丙酮混合液为洗脱液，依次对初级纯化品进行层析，得到红豆杉提取物纯品。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，包括对红豆杉提取物纯品进一步进行结晶精制，得到精制红豆杉提取物。
一些实施例中，用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法包括：
(1)取设定量的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘；
(2)将红豆衫根、茎、叶，研磨、过100～200目筛，向其中加入其重量5～10倍的去离子水及0.1％体积浓度的冰醋酸，并加入纤维素酶，超声酶解2～5小时，得到酶解产物；向酶解产物中加入等体积的乙酸乙酯溶剂，超声萃取0.5～2小时；静置、过滤分层，水相用有机溶剂萃取两到三次，合并有机相，减压除去有机溶剂，得到红豆杉提取物浸膏；
所得浸膏与等质量的中性氧化铝混合拌样，过200～300目硅胶或氧化铝层析柱，石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再用体积比为1:1的乙醇与乙酸乙酯混合液洗脱，收集乙醇与乙酸乙酯馏分，减压除去乙醇与乙酸乙酯，得到红豆杉初级纯化品；
得到的红豆杉初级纯化品依次经聚丙烯酸甲酯型树脂柱和聚苯乙烯树脂柱洗脱，以质量比1:1～1:10的二氯甲烷与丙酮混合液为洗脱液，得到红豆杉提取物纯品；
利用浓度为15μg/ml的甲醇溶液将红豆杉提取物纯品在0～5℃多次溶解并结晶精制，得到红豆杉结晶物。
(3)将雨生红球藻洗净烘干，破碎成碎块，在碾压机中碾成粉末，粉末中加入浓度为17.5mol/l的冰醋酸，添加比例为100g粉末中加入1000ml冰醋酸。混合得到混合液，混合液中加入1800ml去离子水混合成均匀的浆液，将浆液浓缩干燥，制成雨生红球藻提取物。
(4)将牡蛎干粉碎，并进行超声提取，用质量含量80～95％的乙醇水溶液超声提取二次，提取温度为30～40℃，提取时间均为30min；对提取液进行过滤，得到牡蛎干提取物；
诺丽果和沙棘按照与牡蛎干相同的方法进行提取；
(5)将牡蛎干提取物、诺丽果提取物、沙棘提取物和雨生红球藻提取物按照混合1:1:2:3的质量比进行混合，得提取混合物；将提取混合物在10MPa压力、50℃下进行CO2超临界萃取，萃取出混合物中的物质，随后通过降压到2MPa，或升温到100℃的方法，降低超临界流体的密度，使萃取物与CO2得到分离，得到粉末状态的萃取物。
(6)得到的粉末状态萃取物与红豆杉结晶物按照质量比1:3比例混合，制成中药组合物。得到的中药组合物呈粉末状固体。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，由用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法得到。通常，依照用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，以设定质量比的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘为中药原料，制备得到中药组合物。得到的中药组合物为粉末状固体。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，以质量份计，中药原料组成为：红豆杉为20～30份，雨生红球藻为15～30份，牡蛎干为15～25份，诺丽果为15～25份，沙棘为10～20份。
一些较为优选的实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，以质量份计，中药原料组成为：红豆杉22～28份，雨生红球藻18～25份，牡蛎干17～23份，诺丽果15～20份，沙棘15～20份。
一些更为优选的实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，以质量份计，中药原料组成为：红豆杉25份，雨生红球藻20份，牡蛎干20份，诺丽果18份，沙棘17份。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，包括用于治疗黑色素瘤的中药组合物。通常，用于治疗黑色素瘤的中药组合物为粉末状固体，该中药组合物作为有效成分，通常是中药制剂的主要组分。用于治疗黑色素瘤的中药制剂，通常包含有以用于治疗黑色素瘤的中药组合物为有效成分。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，还包括药学上可接受的辅料。用于治疗黑色素瘤的中药制剂，通常包含有以用于治疗黑色素瘤的中药组合物为有效成分，同时为了制备适宜的剂型，作为中药制剂，还需要在中药制剂中添加药学上可接受的辅料，如成形剂、稳定剂、稀释剂、吸收剂、粘合剂、着色剂、包衣材料等。
一些实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，中药制剂的剂型包括汤剂、丸剂、膏剂、散剂、露剂、丹剂、酒剂、锭剂。
以下结合实施例对技术细节做进一步示例性说明。
除非另外说明，本文中的纤维素酶购自山东隆科特酶制剂有限公司，商品号：3210090515。本文中的全自动加压液体萃取仪，产自上海宙兴实业有限公司，商品号：310116002777077。
实施例1
用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备
(1)取100g红豆衫根、茎、叶，研磨、过100目筛，向其中加入其重量5倍的去离子水及0.1％体积浓度的冰醋酸，并加入纤维素酶，超声酶解5小时，得到酶解产物；向酶解产物中加入等体积的乙酸乙酯溶剂，超声萃取2小时；静置、过滤分层，水相用有机溶剂萃取两到三次，合并有机相，减压除去有机溶剂，得到红豆杉提取物浸膏；
所得浸膏与等质量的中性氧化铝混合拌样，过200目硅胶或氧化铝层析柱，石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再用体积比为1:1的乙醇与乙酸乙酯混合液洗脱，监测，收集乙醇与乙酸乙酯馏分，减压除去乙醇与乙酸乙酯，得到红豆杉初级纯化品；
所得红豆杉初级纯化品依次经聚丙烯酸甲酯型树脂柱和聚苯乙烯树脂柱洗脱，质量比1:1的二氯甲烷与丙酮混合液为洗脱液，得到红豆杉提取物纯品；
利用浓度为15μg/ml的甲醇溶液将红豆杉提取物纯品在0～5℃溶解三次并结晶精制，得到红豆杉结晶物。
(2)取100g的雨生红球藻，洗净烘干，破碎成碎块，在碾压机中碾成粉末，粉末中加入浓度为17.5mol/l的冰醋酸1000ml，混合得到混合液，混合液中加入1800mL去离子水混合成均匀的浆液，将浆液浓缩干燥，制成雨生红球藻提取物。
(3)取100g的牡蛎干进行粉碎，接着进行超声提取：用质量含量80％的乙醇水溶液超声提取二次，提取温度为30℃，提取时间均为30min；对提取液进行过滤，得到牡蛎干提取物；
诺丽果和沙棘按照与牡蛎干相同的方法进行提取；
(4)将牡蛎干提取物、诺丽果提取物、沙棘提取物和雨生红球藻提取物按照混合1:1:2:3的质量比进行混合，进行CO2超临界萃取，在10MPa压力、50℃下萃取出混合物中的物质，随后通过降压到2MPa，或升温到100度的方法，降低超临界流体的密度，使萃取物与CO2得到分离，得到粉末状态的萃取物；
(5)得到的粉末状态萃取物与红豆杉结晶物按照质量比1:3比例混合，制成中药组合物。得到的中药组合物呈粉末状固体。
实施例2
1.细胞培养
B1/F10黑色素瘤细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中，补充青、链霉素各100u/ml，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中，每2天换液一次。待长满后用胰酶消化，1000r/分钟离心5分钟，弃上清液，加入新鲜培养液吹匀传代和收集细胞。
2.黑色素瘤细胞接种与分组
保种小鼠：将对数生长期的B16/F10黑色素瘤细胞用胰酶消化后，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后重悬，将细胞悬液浓度调整为1×107细胞/ml，接种于小鼠右腋皮下，100μl/小鼠，即1×106细胞/小鼠，建立黑色素瘤鼠，给药当天按小鼠黑色素瘤体积随机分组，每组7只。
3.实验分组及给药方案
将小鼠分为三组，如表1所列，三组分别为：
A.空白对照组：对照剂为玉米油，按照140mg/Kg体重灌胃给药，每天1次；
B.阿可拉定组：将阿可拉定350mg分散于玉米油50ml体积中，得到阿可拉定的玉米油溶液，即阿可拉定分散液；按照140mg/Kg体重灌胃给药，每天1次；
C.中药组合物组：将实施例1得到的中药组合物350mg分散于玉米油50ml体积中，得到油溶中药组合物，即中药冲剂，向小鼠给药，按照140mg/Kg体重灌胃给药，每天1次。
表1实施例2实验分组
4.黑色素瘤的测量及实验指标
每周两次称量小鼠体重，计量黑色素瘤体积，并观察小鼠健康状态。记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况，如给药期间动物活动、进食等一般状态。最后一次给药后2小时，小鼠安乐死，剥离黑色素瘤后测量体重，记录黑色素瘤的重量。
实验数据用X±s表示。
黑色素瘤体积＝1/2ab2，黑色素瘤体积T/C(％)值＝给药组体积/对照组体积*100％。
RTV：相对黑色素瘤体积，RTV＝Vt/V0。
Vt:即一个实验周期结束时(一般30天左右)的黑色素瘤体积。
V0:实验开始时的黑色素瘤体积，中间时间点可计算，实验组和对照组各有一个RTV。
TGI：黑色素瘤生长抑制率。TGI＝[1-RTV(实验组)/RTV(对照组)]*100％。
黑色素瘤生长抑制率(TGI)＝(对照组瘤体积-给药组瘤体积)/对照组瘤体积*100％。
黑色素瘤瘤重生长抑制率(TGI)＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重*100％。
实验结果显示于综合数据统计表格、各试验组黑色素瘤体积、黑色素瘤重量分布图及相关数据分析图表中。
统计分析：Graph.Prism 6.0。
5.给药第19天，黑色素瘤的体积变化如图1所示，第一行为A.空白对照组六只小鼠的黑色素瘤照片，第二行为B.阿可拉定组六只小鼠的黑色素瘤照片；第三行为C.中药冲剂组的黑色素瘤照片；
阿可拉定是目前临床使用中用于治疗黑色素瘤的药物，图1的黑色素瘤图像显示，服用阿可拉定分散液的小鼠比空白对照组小鼠的黑色素瘤体积小，说明能够有效抑制黑色素瘤的生长，本发明实施例1公开的中药组合物对黑色素瘤的抑制效果更好，黑色素瘤的体积远小于空白对照组，也小于阿可拉定分散液对照组。
6.分别记录阿可拉定分散液组、对照组、中药组合物组中六只小鼠黑色素瘤的质量。黑色素瘤的质量见下表2：
表2六只小鼠第19天黑色素瘤的质量列表
阿可拉定分散液是目前临床使用中用于治疗黑色素瘤的药物，表2的黑色素瘤重量列表显示，服用阿可拉定分散液组的小鼠比空白对照组的小鼠黑色素瘤重量小，说明能够抑制黑色素瘤的生长，黑色素瘤质量较小，本发明实施例1公开的中药组合物实验结果表明，黑色素瘤的重量远小于空白对照组，也小于阿可拉定分散液对照组，说明对黑色素瘤的抑制效果更好。
7.阿可拉定分散液、中药组合物的抑瘤率
根据黑色素瘤的质量，计算阿可拉定分散液、中药组合物相对于对照组的抑瘤率，结果如表3和图2；
表3阿可拉定分散液、中药组合物的抑瘤率
由表3和图2可知，阿可拉定分散液对黑色素瘤的抑瘤率为39.73％，中药组合物的抑瘤率为58.75％，可见实施例1制备得到的中药组合物有很好的黑色素瘤抑瘤率，明显高于阿可拉定。
本发明实施例公开的用于治疗黑色素瘤的中药组合物、制剂及制备方法，得到的中药组合物和制剂，无毒副作用，对黑色素瘤具有很高的抑瘤率。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)取设定量的红豆杉、雨生红球藻、牡蛎干、诺丽果和沙棘；
(2)将红豆杉酶解，然后用乙酸乙酯提取红豆杉酶解产物，将乙酸乙酯提取产物进行提纯、结晶，得到红豆杉提取物；
(3)将雨生红球藻粉碎，用去离子水提取粉碎的雨生红球藻，得到雨生红球藻提取物；
(4)用乙醇分别提取牡蛎干、诺丽果和沙棘，得到牡蛎干提取物、诺丽果提取物和沙棘提取物；
(5)将牡蛎干提取物、诺丽果提取物、沙棘提取物与雨生红球藻提取物混合，得到提取混合物，对得到的提取混合物进行CO2超临界萃取，得到牡蛎干、诺丽果、沙棘与雨生红球藻的混合萃取物；
(6)将红豆杉提取物、混合萃取物按照设定质量比混合，得到中药组合物。
2.根据权利要求1所述的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，其特征在于，红豆杉在纤维素酶的作用下酶解。
3.根据权利要求1所述的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括对红豆杉提取物进一步进行纯化，具体包括步骤：
(2-1)红豆杉提取产物与中性氧化铝混合；
(2-2)利用硅胶或氧化铝层析柱对得到的混合物进行层析，先利用石油醚和乙酸乙酯洗脱除去脂溶性杂质，再利用乙醇与乙酸乙酯混合液洗脱，收集乙醇与乙酸乙酯混合液馏分，减压除去乙醇与乙酸乙酯，得到初级纯化品；
(2-3)利用聚丙烯酸甲酯型树脂柱和聚苯乙烯树脂柱层作为层析柱，利用二氯甲烷与丙酮混合液为洗脱液，依次对初级纯化品进行层析，得到红豆杉提取物纯品。
4.根据权利要求3所述的用于治疗黑色素瘤的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括：对红豆杉提取物纯品进一步进行结晶精制，得到精制红豆杉提取物。
5.用于治疗黑色素瘤的中药组合物，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述的制备方法得到。
6.根据权利要求5所述的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份计，红豆杉为20～30份，雨生红球藻为15～30份，牡蛎干为15～25份，诺丽果为15～25份，沙棘为10～20份。
7.根据权利要求5所述的用于治疗黑色素瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份计，红豆杉22～28份，雨生红球藻18～25份，牡蛎干17～23份，诺丽果15～20份，沙棘15～20份。
8.用于治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，包括权利要求5～7任一项所述的中药组合物。
9.根据权利要求8所述的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求8所述的用于治疗黑色素瘤的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的剂型包括汤剂、丸剂、膏剂、散剂、露剂、丹剂、酒剂、锭剂。
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