一种红花木棉组织培养快繁方法
技术领域
本发明涉及红花木棉种植技术领域,具体为一种红花木棉组织培养快繁方法。
背景技术
海南木棉(Bomb ax celibate)又名红花木棉、英雄树,原产于印度,为木棉科木棉属植物。木棉树体高大,先花后叶,花大如杯,花色红如血,远观如一团团激情燃烧的火苗,历来有英雄象征之称。木棉观赏价值极高,而且在适宜的环境条件下生长速度快,是一种难得的生态林、景观林和经济林,是园林绿化行道树的良好树种,在我国已有2000多年的栽培历史。木棉花和种子都具有较高的经济价值,木棉花和树皮均可入药,木棉花入药清热除湿,树皮可作为滋补类药物入药,木质较轻,木材常加工为蒸笼、船上用品、火柴梗或纸张等使用。木棉种子中含有20%-25%油份,榨取其中含有的油分可以制成肥皂,榨油剩余的材料可作为肥料或家畜饲料使用。木棉果实内部充满棉絮,其棉絮可做枕头、棉被的填充物,同时木棉棉絮也是救生圈的优良填充材料。
木棉传统的繁殖方式是播种和扦插,但由于种子含油量高,易变坏丧失萌发力,萌发率低,一般要求采后当年及时播种播,扦插成活率低,且播种繁殖不能保持母本的优良性状,而采用木棉组织培养育苗,相对于传统的种子繁殖或扦插繁殖,组织培养育苗更利于实现木棉的工程化育苗,为木棉新品种和优良单株提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红花木棉组织培养快繁方法,用于实现对木棉的工程化育苗。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种红花木棉组织培养快繁方法,其方法包括如下步骤:
步骤S1、选取饱满且无破损的木棉种子,将木棉种子放于烧杯中,用洗衣粉水浸泡10min后,取出再用流水冲洗种子30min,备用,冲洗后的种子置于无菌操作台用无菌水洗3次,再用75%乙醇消毒1min,将浸泡过的种子取出用无菌水冲洗5次后,再将种子用H2O2和NaClO不同消毒处理方法进行消毒,最后用无菌水冲洗5次,放在无菌滤纸上吸干种子表面水分,待接种;
步骤S2、以MS作为基本培养基,附加蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+活性炭0.2g/L,将步骤S1得到木棉种子接种至培养基中,初始为暗培养,露白后进行光照处理,在培养室中进行培养;
步骤S3、将木棉无菌种子苗顶芽为诱导材料,接种到以MS培养基为基础培养基,添加不同激素的培养基中,以MS为对照培养基,每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,置于25-28℃的温度条件下暗培养一周后,转置LED照明灯下进行光照10-12小时/天,进行光培养,光照强度为1000-1200lex,在温度25-28℃条件下培养;
步骤S4、切取木棉顶芽诱导的不定芽带芽茎段,接入到不同增殖培养基中,每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,并置于LED照明灯光照10-12小时/天,光照强度1000-1200lex,温度为25-28℃;
步骤S5、切取木棉顶芽诱导的不定芽带芽茎段,接入到基础培养基MS+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L和B5+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L中,每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,并置于LED照明灯光照10-12小时/天,光照强度1000-1200lex,温度25-28℃;
步骤S6、选择生长一致、健壮的丛生芽苗,切取芽苗单株接种到不同生根培养基中,每个处理接种10瓶,每瓶接种2株,置于26-28℃条件下暗培养7d,再置于LED照明灯光照16小时/天,光照强度1000-1200lex,温度26-28℃条件下培养;
步骤S7、挑选叶色较绿、根系发达的木棉组培苗,木棉组培苗要高于3-5cm,从组织培养室移至实验室或温室大棚,瓶内炼苗7d,然后将瓶盖揭开1/3,放置3d,最后将瓶口完全揭开放置3d后,用镊子将苗轻轻取出,洗净培养基,将洗好的苗移栽至不同炼苗基质中,移至光照培养箱培养,光照时间12小时/天。
优选的,所述步骤S1中,消毒剂为H2O2与水的混合溶液,且H2O2与水的比例为1∶1。
优选的,所述步骤S2中,培养基的pH值为5.9。
优选的,所述步骤S2中,培养室的环境温度为25-26℃,光照强度为3000lx。
优选的,所述步骤S3中,添加不同激素的培养基分别为:
MS+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L。
优选的,所述步骤S4中,不同增殖培养基的成分如下所示:
MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L。
优选的,所述步骤S5中,木棉组培苗诱导基础培养基配方如下所示:
MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L;
B5+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L。
优选的,所述步骤S6中,不同生根培养基的成分如下所示:
1/2MS+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭;
1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8.5g/L+1g/L活性炭;
1/2MS+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8.5g/L+1g/L活性炭;
1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8.5g/L+1g/L活性炭;
1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8.5g/L+1g/L活性炭。
优选的,所述步骤S7中,炼苗基质分别为沙子、泥炭土、蛭石,沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1。
优选的,所述步骤S7中,炼苗过程时每天用喷壶喷水2-3次。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
本发明方法以木棉种子苗为试验材料,通过试验确定最佳种子消毒方法,探索最佳基础培养基、诱导培养基、生根培养基及炼苗方法,结果表明木棉组织培养最佳基础培养基为MS培养基,最佳消毒方法为75%无水乙醇消毒1min、无菌水清洗5次、H2O2:水=1:1消毒4h、无菌水清洗5次,最佳诱导及增殖为培养基的成分为MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L,最佳生根培养基的成分为1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶8.5g/L+1g/L活性炭,最佳炼苗基质为沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1,本发明方法为建立和完善木棉组织培养体系,为木棉种子资源保存及健康种苗繁育提供技术支持,为木棉遗传转化奠定一定的基础。
附图说明
图1为木棉顶芽在不同培养基诱导图;
图2为不同基础培养基幼芽分化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种红花木棉组织培养快繁方法,其方法包括如下步骤:
步骤S1、选取饱满且无破损的木棉种子,将木棉种子放于烧杯中,用洗衣粉水浸泡10min后,取出再用流水冲洗种子30min,备用,冲洗后的种子置于无菌操作台用无菌水洗3次,再用75%乙醇消毒1min,将浸泡过的种子取出用无菌水冲洗5次后,消毒剂选择H2O2∶水=1∶1溶液浸泡3h、4h、5h,之后用4%NaClO溶液浸泡20、40、60min,最后用无菌水冲洗5次,放在无菌滤纸上吸干种子表面水分,待接种;
步骤S2、以MS作为基本培养基,附加蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+活性炭0.2g/L,培养基的pH值为5.9,每个处理接种20瓶,每瓶3粒种子,重复3次,将步骤S1得到木棉种子接种至培养基中,初始为暗培养,露白后进行光照处理,在温度25℃、光照强度3000lx的条件下培养室中进行培养,接种第三天和第七天观察并记录污染率,第七天记录种子萌发率,筛选最佳消毒方法;
表1木棉种子不同消毒方法
步骤S3、将木棉无菌种子苗顶芽为诱导材料,接种到以MS培养基为基础培养基,添加不同激素的培养基中(见表2),以MS为对照培养基,每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,置于25-28℃的温度条件下暗培养一周后,转置LED照明灯下进行光照10-12小时/天,进行光培养,光照强度为1000-1200lex,在温度25-28℃条件下培养,25d时统计诱导率;
表2添加不同植物生长调节剂的木棉顶芽诱导培养基
步骤S4、切取木棉顶芽诱导的不定芽带芽茎段,接入到不同增殖培养基中(见表3),每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,并置于LED照明灯光照10-12小时/天,光照强度1000-1200lex,温度为25-28℃,25d统计结果;
表3不同浓度6-BA的木棉组培苗增殖培养基
步骤S5、切取木棉顶芽诱导的不定芽带芽茎段,接入到不同基础培养基中(见表4),每种培养基接种10瓶,每瓶接种5个外植体,并置于LED照明灯光照10-12小时/天,光照强度1000-1200lex,温度25-28℃,25d统计结果;
表4木棉组培苗诱导基础培养基配方
步骤S6、选择生长一致、健壮的丛生芽苗,切取芽苗单株接种到不同生根培养基中(见表5),每个处理接种10瓶,每瓶接种2株,置于26-28℃条件下暗培养7d,再置于LED照明灯光照16小时/天,光照强度1000-1200lex,温度26-28℃条件下培养,30d统计生根率;
表5木棉组培苗不同生根培养基配方
步骤S7、挑选叶色较绿、根系发达的木棉组培苗,木棉组培苗要高于3-5cm,从组织培养室移至实验室或温室大棚,瓶内炼苗7d,然后将瓶盖揭开1/3,放置3d,最后将瓶口完全揭开放置3d后,用镊子将苗轻轻取出,洗净培养基,将洗好的苗移栽至不同炼苗基质中(见表6),移至光照培养箱培养,光照时间12小时/天,炼苗过程中,要保证基质足够的水分,每天用喷壶喷水2-3次。
表6不同炼苗基质
结果与分析
1、不同消毒剂及消毒时间对木棉种子消毒及萌发的影响
由表7可知,接种第三天对照CK污染率达到80%,第七天污染率100%,未污染萌发率0%;处理A1第三天污染率10%,第七天污染率30%,未污染萌发率87%;处理A2第三天污染率8%,第七天污染率20%,未污染萌发率85%;处理A3第三天污染率0%,第七天污染率19%,未污染萌发率70%;处理A4第三天污染率75%,第七天污染率95%,未污染萌发率60%;处理A5第三天污染率60%,第七天污染率75%,未污染萌发率50%;处理A6第三天污染率60%,第七天污染率70%,未污染萌发率20%;综合污染率和种子萌发率最适合作为木棉种子的消毒剂是H2O2,NaClO作为消毒剂不但污染率高,同时也影响种子的萌发,CK的污染率高达100%,因此,经过多种试验结果表明,木棉种子消毒最佳方法为A2:75%无水乙醇消毒1min→无菌水清洗5次→H2O2:水=1:1消毒4h→无菌水清洗5次,第七天污染率19%,未污染萌发率85%。
表7不同消毒剂及消毒时间对木棉种子消毒及萌发结果的影响
2、不同植物生长调节剂对木棉顶芽诱导的影响
由表8可知,培养基B3:MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L植物生长调节剂6-BA+IBA较适合作为木棉种子苗顶芽诱导的激素,分化幼芽3个以上,幼芽生长健壮、长势好,植株和叶片颜色显绿;对照MS不分化幼芽;培养基B1:MS+6-BA1.0 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L中只添加6-BA一种植物生长调节剂分化芽少,发黄,芽短;培养基B2:MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L中能分化1-3个芽,芽长势弱;培养基B4:MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L有愈伤,分化幼芽少,难形成苗;培养基B5:MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L形成大量愈伤,不分化芽,适合作为诱导愈伤培养基。因此,较适合作为木棉种子苗顶芽诱导分化幼芽的植物生长调节剂为6-BA+NAA的组合。
表8不同植物生长调节剂对木棉种子苗顶芽诱导的影响
图1为木棉顶芽在不同培养基诱导图,注:A:CK培养基幼芽;B:B1培养基幼芽;C:B2培养基幼芽;D:B3培养基幼芽;E:B4培养基幼芽;F:B5培养基愈伤。
3、不同浓度植物生长调节剂6-BA对木棉组培苗增殖的影响
由表9可知,木棉幼芽诱导率随激素6-BA浓度的增加而提高,增殖系数也提高,但当浓度过高愈伤增加影响了幼芽的生长,诱导率和增殖系数反而下降,最适合木棉幼芽增殖的培养基为C2:MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.5 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L,诱导率97,增殖系数5.5。
表9不同浓度植物生长调节剂6-BA对木棉组培苗增殖的影响
4、不同基础培养基对木棉幼芽分化的影响
由表10可知,MS为培养基更适合木棉幼芽的分化,分化幼芽数量多,丛芽健壮、偏绿、叶片展开;木棉幼芽在B5培养基单芽多、2个芽较少,植株高叶片展开,但叶片枯黄容易脱落,不适合作为木棉分化基础培养基。
表10不同基础培养基对木棉幼芽分化的影响
图2为不同基础培养基幼芽分化图,注:G:MS培养基幼芽;H:B5培养基幼芽。
5、不同浓度NAA和IBA对木棉组培苗生根的影响
由表11可知,木棉组培苗在对照CK:1/2MS+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭生根培养基中不长根;在E1:1/2MS+NAA0.5 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭培养基中生根率65%,生根条数极少,平均条数0.53条、叶片黄、苗弱不易成活;在E2:1/2MS+NAA1.0 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭中生根率85%,根数少,平均根数0.63条,叶片黄、苗弱不易成活;在E3:1/2MS+IBA0.5 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭培养基中生根率达95%;平均根数3.15,叶片偏绿、苗健壮;在E4:1/2MS+IBA1.0 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭培养基中生根率达85%;平均根数2.05,叶片偏绿、苗健壮。因此,较适合作为木棉组培苗生根的激素为IBA,生根率高,平均根条数也多,叶片偏绿,苗健壮;而NAA对木棉组培苗也有根长出,但是极少,且叶片黄苗弱。较合适作为木棉组培苗的生根培养基为E3:1/2MS+IBA0.5 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭。
表11不同浓度NAA和IBA对木棉组培苗生根的影响
6、不同基质对木棉组培苗炼苗的影响
由表12可知,沙子保水性不好、营养不足,不利于木棉组培苗炼苗;泥炭土湿度较高、易积水、苗易烂根,影响木棉组培苗成活率;蛭石太轻,组培苗飘浮起来、苗不易固定、泡水死亡;基质沙子:泥炭土:蛭石=1:1:1配比炼苗成活率达到87%,保水性好、不易积水、组培苗不烂根、苗健壮。因此,较适合作为木棉组培苗炼苗基质为沙子:泥炭土:蛭石=1:1:1。
表12不同基质对木棉组培苗炼苗影响
讨论与结论
在讨论不同消毒剂及消毒时间对木棉种子消毒及萌发的影响时,对照CK采用75%乙醇75%无水乙醇消毒1min,用无菌水清洗5次接种到MS培养基中,第7天污染率达到100%,污染率高;采用H2O2作为消毒剂,消毒不同时间第7天污染率19-30%,未污染萌发率70-87%;采用NaClO作为消毒剂,消毒不同时间第7天污染率70-95%,未污染萌发率20-60%。可知,消毒剂H2O2较适合作为木棉种子消毒剂,以H2O2为消毒剂,开展3个不同时间处理试验,处理A1和A2的污染率差别不大,但是A2消毒方法未污染种子的萌发率较高,因此,筛选出较适合的消毒方法为A2:75%无水乙醇消毒1min→无菌水清洗5次
→H2O2:水=1:1消毒4h→无菌水清洗5次,第七天污染率19%,未污染萌发率85%。
在筛选适合作为木棉组培基础培养基的过程中,发现B5培养基不合适作为木棉组培基础培养基,B5作为基础培养基芽分化少,芽弱,顶端发黄死亡;MS作为基础培养基木棉分化幼芽多、健壮偏绿,因此,MS是适合作为木棉组培基础培养基。
在筛选适合木棉幼芽诱导和增殖培养基激素的过程中,制定不同的激素及浓度相结合的培养基,筛选出较适合作为木棉幼芽分化和增殖的激素是6-BA和IBA相结合,较合适的培养基为C2:MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L,诱导率97,增殖系数5.5。
组培苗生根是植物组织培养技术的重要环节之一,是决定植物组织培养是否成功的关键因素,也是植物组培快繁体系中的关键环节,特别是木本植物,组培苗的生根难度大,根容易膨化,影响根的形成。本试验以1/2MS为生根基础培养基,开展NAA和IBA两种激素不同浓度的4种生根培养基,结果可知,E3:1/2MS+IBA0.5 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7.5g/L+1g/L活性炭较合适作为木棉组培苗生根培养基,但是木棉组培苗的生根数量并不多,生根率可达到95%,但是平均根数量3.15,在今后的实验过程中可以考虑添加椰子水、香蕉等附加物结合IBA设置更多处理组,更加细化不同组合培养基对木棉组培苗生根的影响。
生根苗炼苗后开展不同基质及配比对组培苗炼苗成活率的影响,由于木棉组培苗生根数量不多,有可能影响了炼苗的成活率,成活率最高只达到87%,较佳的炼苗基质配比为沙子:泥炭土:蛭石=1:1:1,成活率87%。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。