CN1164186A - 用作治疗载体的经喷雾干燥的微颗粒 - Google Patents

Abstract

一种水溶性物质的微颗粒，呈光滑球形，并且其中至少90％质量中等颗粒大小为1-10μm，它还能携带一种治疗剂或诊断剂，或者使用它作为水溶性物质，可以成功地在运送上述药剂的干粉吸气器中使用。

Description

用作治疗载体的经喷雾干燥的微颗粒

发明领域

本发明涉及喷雾干燥的微颗粒及其用作治疗性载体的用途。具体来说，本发明涉及诊断和治疗剂的运送方式以及生物技术产品，包括以rDNA技术为主的治疗剂。

背景技术

治疗剂最常用的给药方式，经口或经胃肠道，在很大程度上不适合来源于rDNA工业的肽和蛋白质。通常来源于血的肽和蛋白质对肠内酸性/蛋白酶解环境的敏感性大大地妨碍了这种给药方式。合理的给药方式应该是静脉内给药，但是它存在着下列问题：长期给药时病人的顺应性较差以及肝脏极频繁的快速首过清除率，造成较短的静脉内给药有效寿命。

最近，已经研究了通过粘膜传递的运送可能性。在研究鼻腔运送方式的同时，却没有广泛地研究通过肺气道的运送肽的可能性。

肺泡细胞，它们自身固有的作用就是提供了一个有效的屏障。然而，对这种给药方法而言，物质均匀地进入肺泡区域具有明显的障碍。能够进入肺气道的最下区域的颗粒有一个最佳粒径即气动直径＜5μm。大于这种尺寸的颗粒将被较上的气道嵌塞而被阻挡。从而在市场上普通的悬浮液制剂中，仅有10-30％的颗粒进入最下气道，这些颗粒通常是来自多分散悬浮液。

对吸入剂来说，目前雾化药物的方法包括雾化，计量剂量的吸气器和干燥粉末系统。水溶液的雾化要求药物的容积大，而且包括使用笨重携带不便的装置。

肺部给药的最常用的方法是使用以挥发性推进剂为主的装置，此装置通常被称作计量剂量的吸气管。基本配置为：在一个加压金属容器中含有溶解了药物或药物悬浮液的一种推进剂溶液，推进剂通常为CFC11，12或114。通过按压一个调节器，释放含有药物悬浮液或溶液的推进剂气体，将药物带入气道来完成给药。在进入肺的过程中，推进剂蒸发使溶液产生微小沉淀，或从悬浮液中产生游离颗粒。虽这种给药方法是完全可重复的并且价格便宜，但存在日益增长的来自环境方面的压力，要求减少CFC的使用。而且，由于CFC溶剂易于变性而且稳定性差，所以它们与许多现代生物技术药品在很大程度上不宜同时使用。

与此同时，人们趋于使用干燥粉末装置，此装置由药物干燥粉末构成，此粉末通常混有一种能促进药物颗粒烟雾化和分散的赋形剂如乳糖或葡萄糖。解聚作用的能量通常由呼吸或通过装置吸入空气来提供的。

药物通常被微粉化以减少颗粒的体积。此方法对生物技术产品不适用。一般来讲，得到的生物技术产品数量少，而且在与赋形剂混合之前易受目前所用的干燥和微粉化方法的影响。再者，提供在现代多次给药吸气器如Turbohaler(Astra)和Diskhaler(Glaxo)上能够自由流动和重复给药的药物掺合物和赋形剂是特别困难的。意想不到的是，研究表明：经喷雾干燥的(球形)柳丁氨醇微颗粒与大小相仿的微粉化药物颗粒相比，具有较大的内聚力和粘合力。喷雾干燥原料的电子显微像表明：其表面粗糙有纹孔。

Haghpanah等在1994英国药学会议上报道：用喷雾干燥法已生产出加有柳丁氨醇的白蛋白微颗粒，而且其大小适于呼吸性药物的运送，即1-5μm。其目的是包裹柳丁氨醇，使之释放缓慢。但这并不说明：此产物是基本均匀的球形或光滑的微颗粒，而且此微颗粒对于多次给药的干燥粉末吸气器来讲，其流动性能今人满意。

含有空气微胶囊的诊断剂早被用于增强超声显影。例如，EP-A-458745(Sintetica)公开了一种通过合成聚合物如聚交酯和聚乙醇酸交酯的界面聚合制备填充有空气或气体微球的方法。WO-A-9112823(Delta)公开了一种使用白蛋白的类似方法。Wheatley等(1990)Biomaterials 11：713-717公开了藻酸盐发生离子移变凝胶化作用，形成直径＞30μm的微泡。WO-A-9109629公开了用作超声对比剂的微脂粒。

Przyborowski等在Eur.J.Nucl.Med 7：71-72(1982)中公开了用喷雾干燥制备用于放射性标记的人血清白蛋白(HSA)微球体，以及其在肺闪烁照相显影中的第二用途。但没说明此微球体是空心的，在我们的重复实验中，生产出略微以有形固体为主的微球体。除非是空心颗粒，否则不适用于超声波心动描记。而且，微球体是用一步法制备，而我们发现此方法不适于制备超声波心动描记的微胶囊；在前一种方法中需要交未变性的白蛋白从微球体中去掉，因此需要进行另外一步筛分步骤，所以很明显，获得的微球体的大小范围较宽。

Przyborowski等提到了两篇先前的公开说明书，其公开了获得用于肺闪烁照像的白蛋白颗粒的方法。Aldrich & Johnston(1974)Int.J.Appl.Rad.Isot.25：15-18，公开了用旋转式圆盘产生直径为3-70μm的颗粒，然后此颗粒在热油中发生变性。去油，并用放射性同位素标记颗粒。Raju等(1978)Isotopenpraxis 14(2)：57-61中使用了同样的旋转式圆盘技术，不同的是通过颗粒简单的加热而使白蛋白发生变性。在这些例子中没有一例是所说的空心微胶囊，而且所制备的颗粒也不适用于超声波心动描记。

EP-A-0606486(Teijin)公开了将一种活性剂加入小颗粒的粉末制备，其载体由纤维素或纤维素衍生物组成。其目的是防止药物颗粒与一个单位剂量干燥粉末吸气器中所用的凝胶胶囊粘连。此说明书第12页提到了“药物和基质”的喷雾干燥，为的是使所获得的颗粒80％或80％以上均为0.5-10μm。至于为获得如此产品所应具备的条件，却没有直接给出。

EP-A-0611567(Teijin)更特异地谈到通过喷雾干燥制备供吸入用的粉末。载体为一种纤维素，因其能防潮所以选用。实施例1中给出的条件(乙醇作溶剂，2-5％w/v溶质)表明：对表面形态没有控制，实施例4报道了一个极差的下部气道呼吸分数(12％)，它表明其分散性差。当药物含量高时显然能获得球形颗粒，这表明：颗粒的表面形态受相关药物和载体的含量控制。

Conte等(1994)Eur.J.Pharm.Biopharm.40(4)：203-208，公开了水溶液的喷雾干燥，最大溶质浓度为1.5％。为获得最近似球形的颗粒，需要的药物含量较高。这需要收缩和皱褶的颗粒形态。另外，悬浮于丁醇后，为便于库耳特分析显然必须经过声处理，这表明颗粒并未完全干燥。

本发明的目的是提供一种治疗性运送载体，特别是提供一种比现有技术中的产品更适合于运送到肺泡的组合物。发明简述

按照本发明，我们惊奇地发现：在如下的微颗粒(及微胶囊和微球体)中，形成壁的物质基本上不受喷雾干燥的影响，其中所述微颗粒适用于作为中间产物，即在生产用于诊断性显影的含空气微胶囊中定影前的中间产物，如WO-A-9218164中所公开的“中间微胶囊”。这样，可以将热敏感性物质例如酶、肽和蛋白质(如HSA)以及其它聚合物制成高度均匀的微颗粒，微球体或微胶囊，并可将其制成干燥粉末制剂，作治疗或诊断用。

与现有技术相比，我们还发现：可以通过喷雾干燥制备供治疗和诊断剂用的有效可溶性载体，而且此载体为水溶性物质，如人血清白蛋白(HSA)的自由流动、光滑的球形微颗粒。其质量中等颗粒大小(massmedian particle size)为1-10μm。通常，制备本发明的微胶囊的方法包括雾化一种形成壁物质的溶液(或分散体)。以此雾化治疗或诊断剂，或将治疗或诊断剂与如此制备的微胶囊偶合。还有一种情况，即此物质本身就是一种活性剂。尤其是我们发现：在此处所述的条件下，更通常由Sutton等(1992)所述条件下，例如使用一种适宜的具有比Haghpanah等更高的溶解浓度和气体/液体流动比混合物和壳形成增强剂，均可制备各种物质的光滑球形微颗粒。可以用不同于简单的最大尺寸分析的方法，即Haghpanah等所述的激光衍射技术，确定微颗粒的球形特性。而且，可以将颗粒大小和大小分布控制在一个较小范围内，并具有较大的可重复性。例如，通过库耳特分析，以个数为基准，98％的颗粒小于6μm，四分位数间距(interquartile)为2μm，每批间的平均大小变化小于0.5μm。再者，当在一台研制的干燥粉末吸气器上实验时，可以完成可重复的给药，而且在一般的流动条件(30L/min)下，随后进行的雾化使微颗粒从赋形剂中很好地分离。

本发明由未变性的HSA或其它可喷雾干燥物质组成的未固定的胶囊，具有非常光滑的表面，并且可以用用量相对较低的赋形剂处理，生产出干燥粉末吸气器的理想自由流动粉末。使用这种方法，可以生产由一种悬浮的赋形剂和有效成分组成的多相微胶囊。这有利于生产由有效成分组成的自由流动的粉末，此些有效成分可以被进一步加工以获得具有优良可重复性及准确度给药和雾化的粉末。

另外，在自由流动粉末的生产过程中，使用常用形式的喷雾干燥方法能引起的相对少的变性和向聚合物的转化。在各种情况下，微胶囊悬浮体中有90％大小在所需(例如1-5μm的可呼吸区域)范围内。

因此，我们已阐明如何生产如下的微颗粒：大小主要为1-5μm；光滑球形；含气体；由未被破坏的蛋白分子组成并且在进行其它加工步骤之前可以贮存和运输。在制备用于超声显影的中间微胶囊中，我们已经对其方法和所得粉末的特性作为定义，这些都是生产用于干燥粉末吸气器(DPI’S)的超级粉末所必需的。我们发现有许多测定方法(曾被用于回声对照剂的测定)适于确定对DPI粉有用的颗粒参数，即能够确定完整有形微颗粒的交联颗粒的回声率和耐压性；能够确定可溶性中间胶囊的球形度和含气性的DPX或溶剂中的显微评定；大小和大小分布分析；以及确定产品定香的最终水平的单体蛋白测定。

特别是用于治疗时，控制颗粒大小和大小分布是必须重视的。我们已经选择了一种生物相容的聚合物，这种聚合物发生交联时仍然是无害的，而且我们也已经知道如何重复交联这种分子。为了完成可控制交联，我们已经使微颗粒的形成和交联步骤分开进行，其它乳剂和溶剂的蒸发步骤不需分开进行。这意味着此方法的起始步骤不破坏壁形成物质。我们已经对特殊参数作了定义，这些参数对于形成颗粒是很重要的。并且对生产更完整颗粒所需的有益条件也作了说明。在选择HSA作为一种适宜聚合物时，我们还选择一种有效载体分子，它可以：保护易变分子；增强肺对肽的摄取；通过自然结合的亲合力与低分子量的药物结合；经共价键修饰，使药物通过细胞屏障进入系统循环以及循环之外。

当研究者将喷雾干燥用于生产体积小的微颗粒时，他们倾向于使用挥发性溶剂，挥发性溶剂促进液滴快速收缩。还有一种情况，研究者为了使溶液粘度低以便于生产更小的液滴使用低溶质容量的原料。在这两种情况下生产微颗粒，方法对颗粒的最终形态不产生什么影响，产生影响的是用于形成颗粒的组分。我们已经对如何从HSA中制备大小可控制的颗粒作了广泛研究，并将此方法用于包括活性药物在内的多种其它物质。我们可以使用较高的溶质含量如10-30％w/v对应于0.5-2％来生产微颗粒，此微颗粒中含有带乳糖的低分子量活性成分；单独的活性成分；带有HSA的肽以及带有活性成分的经改性的聚合物载体。现在我们已经发现：影响最终颗粒形态的是方法而不是溶质的组分。而且，我们可以将水、与水混溶的溶剂联合使用，以改善颗粒的形态。因此，我们有了一种“方法”，它对于生产适于肺运送的光滑球形大小可控的颗粒，很有益处。

人们已经发现：可以通过控制本发明的方法获得具有所需特性的微球体。将蛋白溶液供应于喷雾喷嘴的压力可以变化，例如1.0-10.0×10⁵Pa，优选2-8×10⁵Pa，首选7.5×10⁵Pa。其它参数可以作如下变化。用此方法可以获得新的微球体。

另一方面，本发明提供了空心微球体，其中30％以上优选超过40％，50％或60％的微球体直径在2μm范围内，至少90％优选至少95％或99％的微球体直径在1.0-8.0μm范围内。

四分位数间距可以为2μm，平均直径为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0或6.5μm。

至少有30％，40％，50％或60％的微球体直径在1.5-3.5μm，2.0-4.0μm，3.0-5.0μm，4.0-6.0μm，5.0-7.0μm或6.0-8.0μm。有上述百分比的微球体直径在1.0μm范围内，例如1.5-2.5μm，2.0-3.0μm，3.0-4.0μm，4.0-5.0μm，5.0-6.0μm，6.0-7.0μm或7.0-8.0μm为优选。

另一方面，本发明提供了具有蛋白壁的空心微球体，其中至少90％(至少95％或99％为优选)的微球体直径在1.0-8.0μm范围内；至少90％(至少95％或99％为优选)的微球体的壁厚为40-500nm，优选100-500nm。发明详述

壁形成物质和加工条件应当这样来选择，即在使用条件下，产品充分无毒并且没有免疫原，而产品有无毒性和免疫原很明显是取决于给药剂量和治疗时间。壁形成物质可以是一种淀粉衍生物，一种合成聚合物如聚谷氨酸叔丁氧羰基甲基酯(US-A-4888398)，或一种多糖如聚右旋糖。

通常，壁形成物质从更具亲水性及生物降解能力的生理上可接受的聚合物中选择，这一点在WO-A-9218164中有详细说明。

壁形成物质优选蛋白质。例如，它可以是胶原蛋白，明胶或(血清)白蛋白，在每种情况下均优选来源于人体的(即来源于人体的或结构与人体蛋白结构相似的)。首选来源于血的人血清白蛋白(HSA)，或者，最好是，来源于微生物(包括细胞系)发酵的人血清白蛋白(HSA)，此微生物(包括细胞系)经转变或转染表达HSA。这在WO-A-9218164中有更详细的描述。

蛋白溶液或分散体优选为0.1-50％w/v，蛋白质均为5.0-25.0％的更好，尤其是当蛋白为白蛋白时。大约20％的为最佳。可以使用壁形成物质的混合物，在此情况下，后两种物质的百分比与壁形成物质的总量有关。

将要喷雾的制剂可以包含除壁形成物质以外的其它物质，以及溶剂或液体载体。可再次参考WO-A-9218164。

采用任何能使分散微球体或微胶囊直径为1-10μm的适宜技术都能对蛋白溶液或分散体(优选溶液)(此后称作“蛋白制剂”)进行雾化和喷雾干燥。上述1-10μm对应于至少有90％的微胶囊，直径采用Coulter Master Sizer II测量。“微胶囊”一词的含义是包裹了一个空间的空心颗粒，此空间不是用任何固体原料而是用一种气体或蒸气填充的。但不能形成与UK所售名为Maltesers^的糖果类似的蜂窝结构颗粒。

雾化包括形成一种蛋白制剂的气溶胶，例如通过使用压力将制剂压入至少一个小孔中，或者通过在一个热空气或其它惰性气体室中使用离心雾化器形成蛋白制剂的气溶胶。此室应该足够大的，以致于喷射出的最大液滴不会在干燥前沉积于壁上。当室中的气体或蒸气以一定的量与所用的微胶囊一同给药入血时，它是洁净(即无菌、无热原为宜)和无毒的。液体从蛋白制剂中的蒸发速度应该高到足以形成空心微胶囊但又不致于使微胶囊发生破裂的程度。蒸发速度可以通过改变气体流速、蛋白制剂中的蛋白浓度、液体载体的特性、溶液的进速，以及与气溶胶相遇的气体的温度来控制。其中与气溶胶相遇的气体的温度尤为重要。在水中白蛋白浓度为15-25％的情况下，通常入口温度至少为100℃左右足以保证能形成空心胶囊，优选至少110℃以上的入口温度，在入口温度高达250℃时胶囊不发生破裂。入口温度为180-240℃左右为宜，优选210-230℃左右，首选220℃左右，至少对白蛋白来说如此。因为与气溶胶相遇的气体温度还随运送气溶胶的速度以及蛋白制剂中的液体含量变化而变化所以可以通过控制出口温度来保证室中的温度适宜。我们发现适宜的出口温度为40-150℃。还发现通过控制流速可以控制其它参数如完整的空心颗粒的数目。

通常微胶囊含有96-98％的单体HSA。

更为具体地讲，本发明的微颗粒，对于质量中等的颗粒大小来讲，最大四分位数间距为3μm的为宜，为2μm的更好，为1.5μm的最好。通过带有一个体积-大小分布换算的库耳特计数器确定质量中等颗粒的直径。微颗粒通过喷雾干燥产生，喷雾干燥中采用低原料流速，高含量的干燥空气和雾化作用。此喷雾干燥所制备的微胶囊大小非常确定且大小分布紧密。

几名研究人员设计了确定气体喷嘴平均液滴大小的方程式；各种影响平均液滴大小的参数简要介绍如下：

D＝A/(V².d)^a+B.(M_air/M_liq)^-b其中D＝平均液滴大小

A＝与喷嘴设计有关的常数

B＝与液体粘度有关的常数

V＝在液体和喷嘴间的相对空气速度

d＝空气密度M_air和M_liq＝空气质量和液体流的质量

a和b＝与喷嘴设计有关的常数

很显然，对于任何给定的喷嘴设计来说，液滴大小最容易受喷嘴处相对速度和同时并存的空气/液体质量比率的影响。对于最普通的干燥用途，空气/液体比率在0.1-10范围内，在这些比率下，平均液滴大小似乎为15-20μm。用于生产大小在上述范围内的微颗粒时，我们所用的空气/液体比率在20-1000∶1范围内。结果是在高比率下生产颗粒，生产出的颗粒与一般颗粒相比非常小而且大小分布非常窄。对于在较低的空气/液体比率下生产的微颗粒来说，所生产出的颗粒略微大些，但不管怎样大小分布仍然紧密，这些都优于通过乳化技术生产的微颗粒。

对所加有效成分的量要求并不严格；按重量百分比计，微颗粒可以含有至少50％的HSA或其它载体物质，含有70％或80％的为优选，含有90％的为最佳。供吸气器装置使用时，此微颗粒可以用一种常规的赋形剂如乳糖或葡萄糖配制。

此微颗粒可以含有治疗剂和载体，或一种仅具有治疗活性的化合物。有效成分的量可以根据其特性和活性，给药方式，以及本领域普通技术人员已知的其它因素选择。仅作为举例，颗粒的给药量可以是每日输布α-1抗胰蛋白酶100mg，或者每日输布一种如二丙酸氯地米松的活性物质0.1mg。

例如，活性成分可以是一种诊断性物质或一种经典的药物本体，此本体可以以共价键的方式或其它方式与载体物质结合，也可以不与载体物质结合。治疗剂可以是一种蛋白物质如胰岛素、甲状旁腺素、降钙素或类似的具有生物活性的肽、沙丁胺醇、水杨酸盐、甲氧基甲基萘乙酸、沃格孟汀或一种细胞毒剂。为了实验的目的，可以包括一种标记物如赖氨酸荧光素。

本发明的微颗粒除治疗或诊断剂外可以含有一种拮抗剂或结合受体成分。例如，为了将载体结合的药物送至肺泡或肺泡以外的一个指定受体，在分子载体中可以包括一种糖或其它分子。

此处，HSA为本发明所用水溶性载体物质的一个说明性实例。其它可使用的物质包括简单和复杂碳水化合物，简单或复杂氨基-或多氨基酸，脂肪酸或脂肪酸酯，或者天然或重组人蛋白或其片段或短排列。为了使流量或载体特性达到最佳，本发明还通过在微胶囊的制备过程中改变和减少内聚力和粘合力，使干燥的微胶囊的性质符合要求。例如，如果需要，可以通过在无HSA的系统或包括HSA和活性成分的多相系统中使用高电荷单体或聚合物质如赖氨酸或聚合赖氨酸，以及谷氨酸或聚合谷氨酸。

本发明的另一个实施方式是将活性成分与HSA一同进行喷雾干燥，以增加此活性成分在制剂、包装以及在肺泡内停留时的稳定性，其中最重要的是增加在肺泡内膜停留时的稳定性。在此情况下，增强了蛋白酶解的活性。同时，可以使用蛋白酶抑制剂以保护肽药物，这很可能是此方法的相反说明。由于HSA既用作赋形剂又用作载体，所以可以提供一种大量过剩的可供选择的底物，局部活性的蛋白酶可以对此底物产生作用。另一个优点是，因为HSA已经表现出能够通过受体或非受体介导的转胞机制穿过肺泡屏障，所以HSA可以被用作一种载体，促进一种活性成分进入上皮内膜。

在另一实施方式中，在进行喷雾干燥之前，活性成分可以通过可裂解的键与HSA发生共价键合。此实施例代表了一种将活性物质从装置一直送至血流以及体内的可能靶器官的方法。形成具有最佳气动大小的颗粒的含义是此“物理”载体将活性成分输布至吸收部位。一旦沉积在肺泡上，此“分子”载体将保护和通畅入血通道，而且其一旦入血，可以进一步延长其循环半衰期，并在受体介导活动的基础上将活性物质引入体内某一部位。

在WO-A-9317713(Rijksuniversiteit Groningen)中公开了一种适宜的键合技术。公开了酯酶敏感性多羟基酸键合剂。这种在喷雾干燥前的HSA衍生中所用的技术，能够生产一种用于将药物输布至全身血管系统的共价载体系统。在潜在性地保护不稳定本体的同时，利用HSA穿过肺泡的潜在力在一段较长的时间内运送药物。

虽然本发明所用的活性成分可以在微颗粒形成后被吸入微颗粒中或以其它方式与微颗粒联合，但优选用HSA制备。为延缓其溶解速度，防止吸湿，至少部分微颗粒用一种疏水性或不溶于水的物质如一种脂肪酸包裹。

下列实施例用于说明本发明。实施例中所用的喷雾干燥器，可以从A/S Niro Atomizer，Soeborg，Denmark得到，商品名“MobileMinor”，这一点在WO-A-9218164中有详细描述。实施例1

将一种在无热原水(适于注射的)中的无菌、无热原HSA的20％的溶液抽至双相喷嘴雾化器的喷嘴，此雾化器安装在上述商业用喷雾干燥装置中。将蠕动泵速度保持在10ml/分左右，以便在入口空气温度为220℃情况下，出口空气温度保持于95℃。

将压缩空气在2.0-6.0巴(2.0～6.0×10⁵帕)下供给此双相雾化喷嘴。在此范围内，可获得平均大小为4.25～6.2μm的微胶囊。

典型地，平均颗粒大小的增大(通过减小雾化压力)导致大小大于10μm的微胶囊数量的增加(见表1)。

                        表1

        雾化压力对直径大于10μm的微胶囊出现频率的影响

雾化压力(×105帕)	直径大于10μm的出现频率％
		6.0	0.8
5.0	3.3
		3.5	6.6
2.5	8.6
		2.0	13.1

在上述条件下，即WO-A-9218164实施例的第一步，喷嘴压力为7.5巴时，产生颗粒大小为4.7μm的微颗粒。这些微颗粒呈光滑球形，大小超过6μm的颗粒少于1％。将此微颗粒溶解于水介质中，通过凝胶过滤层析测定HSA的分子量。在喷雾干燥HSA前后所得HSA的色谱实质上是一样的。通过HPLC胰蛋白酶肽图，进一步分析喷雾干燥前后的HSA，未发现所释放出的肽存在差别。两种分析均显示，在所述生产4.7μm的微颗粒的喷雾干燥条件下，对此蛋白几乎没有或没有结构破坏。实施例2

将来自人血清α-1抗胰蛋白酶在与实施例1相似的条件下喷雾干燥，其入口温度为150℃，出口温度为80℃。干燥条件的其它所有方面均与实施例1相同。所生产的可溶性微颗粒的平均大小为4.5μm。将微颗粒溶于水介质中，并进行蛋白结构和正常胰蛋白酶抑制活性的保留分析，然后与原始冻干起始物质比较。通过凝胶渗透和反相层析以及毛细电泳分析，显示在喷雾干燥后没有明显结构改变。抑制活性的分析(表2)表明：在实验误差范围内，其抑制活性完全保留。

                           表2

实验数	保留活性的百分比
		1	84
2	222
		3	148

实施例3

应用实施例1的一般方法，制备由乙醇脱氢酶(ADH)和乳糖组成的微胶囊(ADH0.1％w/w；乳糖99.9％w/w)。我们发现最优化的喷雾干燥步骤需要最大地保留酶的活性。使用实施例1的一般条件，只改变其出入口温度，以获得可以生产所需大小(4～5μm)微颗粒的条件，且其微颗粒在干燥后保留了所有活性，并且在水介质中重组。在每个所示喷雾干燥条件下，与原始物质相比保留活性的百分比显示于表3中。此微胶囊呈光滑球形，并包含空气，这可在光学显微镜下通过其在二苯基甲苯中的外观证明。

                   表3

实验数	入口温度℃	出口温度℃	保留活性(％)
				1	220	73	57
2	175	71	98

实施例4

在实施例1所述的条件下进行一系列实验以检测液体加料速度对完整球形颗粒产量的影响。我们发现，利用含气微颗粒具有可以反射超声波的能力，可以确定使完整光滑球形微胶囊的产量最大化的最佳条件。将喷雾干燥后形成的微颗粒热固定以使它们难以溶解，然后将其悬浮于水中进行回声测定。我们发现加大液体进料速度使最初喷雾干燥过程中形成的完整微颗粒的数量减少(表4)。随着液体流速从4增加至16ml/分，其平均颗粒大小和总压力稳定性，即壳的厚度，没有改变，只是总回声产生率发生变化。我们发现蒸发速度越慢(液体流速越高)所形成的完整球形颗粒越少。

                         表4

流速(ml/分)	4	8	12	16
					平均大小(μm)	3.08	3.04	3.13	3.07
回声产生率(影像密度单位)	22	21	14	10
					加压后回声产生率(影像密度单位)	20	18	10	8

通过将浓度为1×10⁶ml的热固定的微颗粒再悬浮于350ml水中，进行测定。在500ml烧杯中慢慢搅拌此溶液，此烧杯上安装有3.5MHz超声探针，它连接于Sonus 1000医用显像仪上。通过一影像分析仪捕获所获得的灰度影像，并与水空白比较以产生回声反射的显影密度单位。通过测定样本在曝光前后的回声反射，还可以使此测定方法适于检测加压阻力，其回声反射是作用于颗粒的原料溶液的压力环状破裂而产生的。此颗粒可将不完整颗粒与完整颗粒鉴别开，不完整颗粒带走用于重组的空气，而完整颗粒则将空气封闭于壳内。不完整颗粒不显示加压阻力，并立即失去反射超声波的能力。在微胶囊浓度分别为0.25，0.5，1，2，3和4×10/ml时，实施例1固定白蛋白颗粒的剂量为c.5，9，13，20，22和24VDU’S(反散射强度)。实施例5

已经进行了减小颗粒大小和缩窄大小分布的有意义的实验。进行此实验是为了有效地增加回声对照剂的含气量，以及减少超大颗粒的数量。由于此实验扩大了在1～5μm范围内可供呼吸的颗粒的可能数量并且可固有地产生更光滑的颗粒，此颗粒比相似大小的非球形颗粒具有更小的粘合性，所以此实验对用于呼吸的制剂有益。

我们发现可通过减少原料的溶质含量以减小颗粒大小。此结果部分是由于滴形成时粘度的作用导致的。但我们还发现在所用条件下通过减少溶质含量可导致完整颗粒数目的减少。经过进一步实验我们已发现在原料中混入水混溶性挥发性溶剂，在干燥过程中可明显地提高壳的形成率，同时伴随完整颗粒或空心颗粒数目的增多(表5)。通过对浮至血细胞计条状盖板表面的颗粒进行微观评价，进行空心度的评价。此血细胞计用库特耳计数对颗粒进行计数。

                           表5

实验数	原料中HSA含量(％)	原料中乙醇含量(％)	平均颗粒大小(μm)	空心颗粒的百分比(％)
					1	10	0	3.7	12.5
2	10	25	3.52	64.3

实施例6

一组物质被用于生产光滑球形可溶性微颗粒。所生产出的微颗粒包括惰性物质如HSA，乳糖，甘露糖醇，藻酸钠；单独的活性物质如α1-抗胰蛋白酶；以及活性物质和惰性载体的混合物如乳糖/乙醇脱氢酶，乳糖/布地缩松，HSA/柳丁氨醇。在所有情况下，均生产出光滑球形并且含气的颗粒。

我们已经证实了此方法在控制颗粒形态方面的可靠性。将颗粒悬浮于丙醇中，然后用显微镜观察。那些含气的颗粒似乎是一个被一个完整黑边包绕的白色芯，而颗粒破裂或未形成时表现为空胞。下列微颗粒的显微评价说明了可以被干燥以生产光滑球形颗粒的物质和活性物质的范围：

HSA

酪蛋白

血红蛋白

乳糖

ADH/乳糖

HSA/过氧化物酶

乳糖/柳丁氨醇

乳糖/布地缩松实施例7

在下表(表6)所示的条件下，对乳糖和布地缩松进行喷雾干燥。

               表6

参数                    设定

入口温度                220℃

出口温度                85℃

雾化压力                7.5bar

气阀设定                0.5

进料速度                3.88g/min

原料溶液                9.3％w/v布地缩松，85％v/v

                        乙醇19％w/v乳糖

所得干燥粉末以表7中所列比例，在一个V型混合器中与赋形级乳糖混合。然后将此混合物装入明胶胶囊，并从一Rotahaler^TM中排出，进入一台运行速度为60L/min的双段碰撞取样器。按沉积入低室的百分数计算可呼吸分数。

                表7

制剂数	布地缩松在喷雾干燥颗粒中的百分数	喷雾干燥产物在混合物中的百分数	快速流动乳糖在混合物中的百分数	可呼吸分数
					1	9.3	10	90	42
2	9.3	15	85	29
					3	9.3	20	80	34
4	5.7	30	70	36

所得的可呼吸分数明显优于目前在此装置上通用的粉化产品的可呼吸分数，其最大可呼吸分数通常在10-20％。

在一台实验用重力自流进料多次给药DPI中测定详细示于表7的布地缩松/乳糖制剂。所测参数是喷射30次以上的喷雾剂量和在四段碰撞取样器中的可呼吸百分的变量。结果显示于下(表8)。

                    表8

制剂数	剂量(mg)	微小颗粒分数(可呼吸分数(％)	喷射剂量下的CofV(％)
				1	4	52	2.0
2	4.2	42	2.8
				3	3.7	58	8.1

对于通用的DPI装置，初版的US药典要求喷射剂量变化小于25％。很明显，在到目前为止所有被测的制剂中，均在通行的技术要求范围内。在制剂1和制剂2的情况下，明显低于通行界限。实施例8

为了降低先前实施例中所述的可溶性微胶囊的溶解速度，可以用脂肪酸如棕榈酸或山萮酸包裹微胶囊。通过将一种可溶性HSA微胶囊和葡萄糖(50％w/w)的混合物悬浮于一种含10％棕榈酸或山萮酸的乙醇溶液中，将实施例1中的可溶性微胶囊包裹。蒸发掉溶液并通过一台Fritsch粉碎机将所得饼块粉碎。

用一种源于我们先前超声研究的间接方法评定涂层的效力。用一台连接有图像分析仪的HP Sonus 1000超声波机，从一个每毫升含有1×10⁶微胶囊的水杯中收集超声波图像。经过一段时间测定超过空白读数的影像强度(VDU)(见表9)。

没有涂层的微胶囊很快失掉所有空气，因而有可能反射超声。但是，带有涂层的微胶囊在一段较长时间内保持其结构，因此在几分钟后显示出一个被延长的信号。

                   表9

        带有涂层的HSA微胶囊的回声产生率

时间(分钟)	回声产生率(VDU)
				仅HSA	HSA/棕榈酸涂层	HSA/山萮酸涂层
	0	1.75	1.91				0.88
5				0.043	0.482	0.542
	10	0	0				0.004

实施例9

按照实施例1中所示(15％含水甘露糖醇喷雾干燥原料)制备可溶性甘露糖醇微胶囊，并用实施例8中所示的棕榈酸和山萮酸包裹。将每一种样品悬浮于水中并测其回声产生率。初次分析10分钟后，重复测定被悬浮样品的回声产生率(表10)。

                     表10

         带有甘露糖醇的微胶囊的回声产生率

时间(分钟)	回声产生率(VDU)
				甘露糖醇	+棕榈酸	+山萮酸
	0	1.6	1.7				0.92
10				0.33	0.5	0.24
	17	0	0.84				0

实施例10

制备带有一种包含于基质中的模型活性物质(赖氨酸-荧光素)的可溶性微胶囊，以生产一种自由流动干粉形式的“活性”化合物。在微胶囊溶解时，此活性化合物以其原本形式释放。

使用赖氨酸作为一种模型化合物，用荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记此分子从而能在可溶性微胶囊的制备过程中以及其后的溶解释放过程中监测该化合物。

将3g赖氨酸加入用碳酸盐缓冲的FITC(0.5g总量)中。30℃下保温1小时后，测定所得溶液中用TLC形成的FITC-赖氨酸加合物。这表明有一种稳定的FITC-赖氨酸加合物存在。

将FITC-赖氨酸加合物与含有100mg/ml HSA的143ml 25％乙醇混合，获得喷雾干燥的原料。用于形成微胶囊的喷雾干燥的条件详细显示于下表11中。在无乙醇的条件下，我们发现只有少量百分比的颗粒是光滑球形的。

此喷雾干燥方法能够生产17.21g微胶囊，在把该胶囊样品悬浮于乙醇时它不会发生溶解。而且观察不到FITC-赖氨酸加合物的释放。但是当向此乙醇悬浮的微胶囊中加入10ml水时，微胶囊发生溶解并且释放FITC-赖氨酸。用TLC对加入微胶囊前的加合物进行分析，对溶解时从微胶囊中释放的加合物进行分析，均表明此模型化合物没有改变。

            表11

         喷雾干燥条件

参数                  设定

入口温度              220℃

出口温度              85℃

雾化压力              7.5bar

气阀设定              0.5

进料速度              3.88g/min

原料溶液              25％v/v乙醇，10％w/vHSA

在硫氰酸铵和2-丙醇的无水系统中，用一台Multisizer II(CoulterElectronics)测定此可溶性微胶囊的大小。此微胶囊的平均大小为3.28±0.6μm，有90％质量百分比的微胶囊的大小在2-5μm以内。

将微胶囊与葡萄糖混合(50％w/w微胶囊：50％w/w葡萄糖)，将此混合物通过一台Fritsch粉碎机粉碎三次。当向水中加入此粉末样品时，释放FITC-赖氨酸，通过TLC分析测定发现与原始形式相比没有损失。此实施例表明：制备一种可用于呼吸制剂的氨基酸或肽的制剂是可行的，而且此制剂中加有HSA。实施例11

在乙醇中溶解500mg二丙酸氯地米松并加入50ml HSA原料(10％w/v)，在实施例10所示条件下进行喷雾干燥。在如实施例10中所示的无水系统中测量由此形成的微胶囊的大小。微胶囊的平均大小为3.13±0.71μm，其中90％在2-5μm之间。

通过在10％TCA中HSA的沉淀作用，从此微胶囊中提取二丙酸氯地米松，并且将上清液提取至乙醇中。应用HPLC在波长242nm下分析此乙醇提取液。在此提取液中所检测的二丙酸氯地米松处于游离状态，但当白蛋白丸被提取时，可观察到与天然HSA结合的二丙酸氯地米松的存在。我们发现虽然大多数活性化合物处于游离状态，但有一些处于白蛋白结合状态。因为白蛋白只是缓慢地分布至血流中，这样可以控制在与游离药物相比较长的时间内释放活性化合物。实施例12

由于至少在实施例10和11中与此活性化合物结合的任何物质可对白蛋白的固有特性造成影响，本实施例提供一种活性化合物初始交联后喷雾干燥前的产物。

将25mg碳化二亚胺(EDCI)加入一种10mg/ml氨甲喋呤溶液中。搅拌此溶液4小时以引发并确保氨甲喋呤完全活化。将50mg HSA加入活化药物中，并在室温下搅拌3小时。通过白蛋白的氨基将氨甲喋呤化学结合于HSA上。然后将此共轭物用作实施例10中所述的喷雾干燥原料。

将由此制备的可溶性微胶囊抽样，检定并分析药物含量。微胶囊的平均大小为3.2±0.6μm，90％(以质量计)在2-5μm之间。微胶囊药物含量分析表明微胶囊没有释放药物，甚至在溶解后药物还与HSA结合。白蛋白的蛋白酶K消化作用释放此结合药物，这表明药物仅与有限的一些氨基酸和小肽链结合。此前已表明与聚合载体结合的阿霉素的活性对癌症有意义，显示出多药物抵抗的表型。实施例13

以药物与HSA1比5的比例，按实施例10和12中所述制备甲氧萘丙酸微胶囊。水溶性微胶囊保留非水溶剂的活性化合物。而且，当微胶囊在水溶液中溶解时，活性化合物仍与白蛋白结合。这一点通过如前所述的262nm下的HPLC分析表明。当用蛋白酶K和酯酶消化时，甲氧萘丙酸从白蛋白中释放。实施例14

用在实施例8至13中所生产的微胶囊样本在一干粉吸气器中进行其性能评价。评价每个制剂的给药再生性，同时通过微观评估样本的雾化。

将各个制剂的样本加至实验用干粉吸气器(DPI)的储料漏斗。干粉吸气器应用加压空气推动粉末进入一个给药量器。应用雾化干燥的乳糖校准所用的定量量器。

随着组合物的功能不同，分配至给药量器中的样本的量也不相同，但是各样本的给药再生性非常一致，其三个给药试验中所获得的平均值为5.0±0.25mg。

通过将吸气器与一个真空室连接，测定样品雾化干燥性；通过排除真空经由DPI得到积累好的吸气物，并且在树脂包裹的显微镜片上完成空中浮游剂量的收集。这些片用于评价颗粒的分散性。此片表明DPI已使样品解聚，甚至在显微镜片上形成一个微颗粒的分散体。实施例15

从Rotahaler(Glaxo UK)中排放蒸馏水，第1阶段为7ml，第2阶段为3ml，此后应用双段碰撞取样方法(用于加压吸气的装置A，英国药典1988)分析实验例10至13中的干粉制剂的性能。利用通过橡皮接管连接至双碰撞取样器的Rotahaler，将制剂从3号凝胶胶囊中释放出。真空泵以60L/分运转两个三秒脉冲，分析到达碰撞取样器第1段和第2段的各样本的量。所有样本均显示在碰撞取样器第2段产生的沉积百分数最大，这表明了肺泡运送颗粒的最佳大小。实施例16

在兔肺中进行实施例中所生产的固定不溶性微胶囊和可溶性微胶囊的给药和沉积比较。

对麻醉的新西兰白兔或者给可溶性微胶囊或者给固定微胶囊。应用计算机控制的喷雾器(Mumed Ltd.，UK)完成给药。可溶性微胶囊悬浮于CFC11中，而固定微胶囊悬浮于水中。给药后，摘取兔肺，并进行所制备胶囊的沉积评价。

在兔肺的肺泡组织中可发现固定胶囊是完整的。此表明微胶囊具有通过肺分散的适宜大小。相反，未获得完整可溶性微胶囊的存在，此胶囊已溶解于肺液中。然后，当用荧光显微镜研究时，发现在某些肺泡组织中存在有FITC-赖氨酸加合物存在。另外，在此动物的血和尿中也发现有此加合物的存在。相反，在血和尿中均无固定胶囊存在。

Claims (19)

1.在治疗或诊断中使用的一种水溶性物质的微颗粒，呈光滑球形，并且其中至少90％质量中等颗粒大小为1-10μm。

2.一种水溶性物质的微颗粒，呈光滑球形，并且其中至少90％质量中等颗粒大小为1-10μm，其携带一种治疗剂或诊断剂。

3.按照权利要求2所述的微颗粒，可通过对上述水溶性物质和治疗剂或诊断剂的一种水溶液进行喷雾干燥获得。

4.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其中所述颗粒大小为1-5μm。

5.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其最大四分位数间距为3μm。

6.按照权利要求5所述的微颗粒，其最大四分位数间距为2μm。

7.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其是无菌的。

8.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其被至少部分地用一种不溶于水的物质包裹。

9.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其还携带一种结合受体的组分。

10.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其中水溶性物质是碳水化合物。

11.按照权利要求1至9中任一权项所述的微颗粒，其中水溶性物质是一种氨基酸或多氨基酸。

12.按照权利要求1至9中任一权项所述的微颗粒，其中水溶性物质是一种脂肪酸或脂肪酸的酯。

13.按照权利要求1至9中任一权项所述的微颗粒，其中水溶性物质是一种蛋白质、肽或酶。

14.按照权利要求13所述的微颗粒，其中水溶性物质是一种天然或重组形式的人体蛋白或片段。

15.按照权利要求14所述的微颗粒，其中水溶性物质是人血清白蛋白。

16.按照任一前述权利要求所述的微颗粒，其中水溶性物质在形成微颗粒前经过化学或酶修饰。

17.一种适用于通过肺气道施用一种治疗剂的吸气装置，其含有前述权利要求中任一权项所述微颗粒形式的治疗剂。

18.一种治疗剂在制备用于治疗一种疾病的药物中的应用，此治疗剂经由肺气道给药而对此病发挥作用，其特征在于：此治疗剂以权利要求1至16中任一权项所述的微颗粒形式存在。

 19.通过给患者施用有效量的治疗剂治疗一种疾病的方法，所述治疗剂经由肺气道给药以治疗此病，该方法的特征包括以权利要求1至16中任一权项所述的微颗粒形式给药。