CN116410271A - H5n1亚型aiv mhc b1限制性t细胞表位肽及其应用 - Google Patents

H5n1亚型aiv mhc b1限制性t细胞表位肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽及其应用，所述表位肽如SEQ ID NO.1～12任一项所示。本发明以B1单倍型SPF鸭为研究对象，以H5N1AIV为模式病毒，建立H5N1AIV感染诱导B1单倍型鸭细胞免疫应答的动物模型。利用H5N1AIV特异性鸭记忆性PBMC筛选B1单倍型鸭MHCⅠ类分子限制性T细胞表位，为H5N1AIV表位疫苗的研发提供条件。

Description

H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽及其应用。
背景技术
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的家禽和野生禽类感染的高度接触性传染病。禽流感病毒属正粘病毒科，甲型流感病毒属。根据表面结构蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的不同，可以对其进行分类。截止目前，禽流感病毒已经发现16个HA亚型和9个NA亚型。根据致病力的不同，可将禽流感分为高致病性禽流感(highly pathogenic avianinfluenza,HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)。H5N1HPAIV是主要流行的亚型之一，分布广泛，水禽感染后，通常不发病，但会持续性排毒，给养禽业及公共卫生安全带来威胁。因此，防控H5N1高致病性禽流感病毒感染水禽对控制H5N1亚型AIV流行与传播至关重要。
灭活疫苗诱导体液免疫应答产生的中和抗体一直以来被认为是宿主抵抗禽流感病毒入侵的关键。然而，在免疫压力下，AIV的HA蛋白持续发生突变，使得灭活疫苗的保护作用明显减弱，急需开发具有广泛保护力的新型疫苗。鸡T细胞免疫已被证明在抗禽流感病毒感染、提供持久和交叉毒株保护和开发通用疫苗方面发挥着重要作用。如Dai等人通过比较H9N2 AIV感染和疫苗免疫诱导SPF鸡的关键保护因子，发现鸡CD8+T细胞在对抗禽流感病毒感染中发挥重要作用；Thontiravong等人发现番鸭感染坦布苏病毒后，鸭CD4+T、CD8+T细胞在病毒复制、清除过程中发挥关键作用。但是，目前对于H5N1 AIV感染后诱导鸭的T细胞免疫应答研究较少，限制了广谱长效的T细胞表位疫苗的开发。
T细胞表位具有MHC限制性，抗原表位可在内质网与MHC I类分子结合后被转运至细胞膜供TCR识别。然而，在自然界中，机体内MHC I类分子多为杂合子，具有多态性。即使是针对同一抗原，不同的MHC I类分子结合的抗原表位也各不相同。因此，在筛选表位的同时需要先明确MHC限制性。目前，根据鸭MHCⅠ类分子中TAP1基因的串联重复序列，可将鸭分为B1、B2、B3、B4共4种品系单倍型。有报道称鸭的MHC单倍型与病原微生物的抗性和易感性相关。武永淑等人发现B1品系单倍型鸭相比于其他三种品系单倍型鸭对鸭疫里默氏杆菌具有更高的死亡率，B4单倍型鸭对Ⅰ型鸭肝炎病毒更敏感。而AIV对单倍型鸭的致病性和诱导的免疫应答反应还没有报道研究。此外免疫表位数据库(IEDB)内目前也还没有收录靶向AIV的鸭T细胞表位数据。因此，本发明重点研究H5N1 AIV对B1单倍型SPF鸭的致病性及诱导的细胞免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于提供一种H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽，所述表位肽选自下述(a1)至(c1)的至少一种：
(a1)氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽中的一条或多条；
(b1)对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽进行一个或多个保守氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽相同或基本相同的功能；
(c1)由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
本发明的表位肽可利用以往的各种肽合成方法制备。例如可以使用固相肽合成法等有机化学的合成法、或制备编码肽的核酸、使用重组DNA技术进行制备。另外，也可利用市售的化学合成装置(例如Applied Biosystems公司的肽合成装置)合成。
本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述表位肽。
编码表位肽的核酸对于使用基因重组技术使宿主内产生表位肽是重要。因为氨基酸密码子在宿主间的密码子使用频率不同，因此优选变更氨基酸的密码子以使其适合产生宿主的密码子使用频率。编码表位肽的核酸就疫苗而言亦为重要，可以以裸露的核酸的形式移送，也可使用适当的病毒或细菌载体移送。
本发明的第三方面，提供含有本发明第二方面所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞系。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的表位肽或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的表达盒、重组载体或重组细胞系在(a2)～(f2)至少一种中的应用；
(a2)制备H5N1亚型AIV疫苗；
(b2)制备H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞；
(c2)制备监测H5N1亚型AIV的产品；
(d2)制备诱导和/或扩增T细胞的试剂盒；
(e2)制备针对H5N1亚型AIV的抗体中的应用；
(f2)制备检测H5N1亚型AIV感染的试剂盒。
本发明的第五方面，提供一种疫苗，所述疫苗包含本发明第一方面所述的表位肽或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的表达盒、重组载体或重组细胞系。
本发明的表位肽在主动免疫疗法中可以作为肽疫苗使用。也就是说，将含有本发明的表位肽制备而成的疫苗对患者投予，使T细胞在体内增殖，对于感染的预防和治疗发挥效用。
在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的疫苗可通过非经口投予及经口投予进行投予，一般而言以非经口投予较佳。作为非经口投予，有经鼻投予、皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射等注射剂、栓剂等。另外，作为经口投予，可以制备成和淀粉、甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、纤维素等赋形剂的混合物。
本发明的疫苗是以治疗上有效的量进行投予。投予量取决于治疗对象、免疫系统，必要的投予量依临床医师的判断决定。另外，投予间隔可依对象、目的来设定。
本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的表位肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述的表达盒、重组载体或重组细胞系。
本发明的第七方面，提供一种抗体，所述抗体以本发明第一方面所述的表位肽作为免疫原制备所得。
术语“抗体”意指由4条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。链通常通过二硫键彼此连接。每条重链由所述重链的可变区(在此简称为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个区CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻链的可变区(在此简称为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL区组成。VH和VL区可进一步分成称为互补决定区(CDRs)的高变区和称为构架区(FR)的交替分布的保守区。因此，每一VH和VL区由以如下顺序从N末端到C末端的排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。该结构对于本领域技术人员是众所周知的。
本发明的抗体可以使用本领域的常规技术制备而成。
本发明的第八方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第七方面所述的抗体。
本发明的第九方面，提供一种非治疗目的的诱导和/或扩增H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞的方法，包括使用本发明第一方面所述的表位肽。
本发明的有益效果是：
本发明以B1单倍型SPF鸭为研究对象，以H5N1 AIV为模式病毒，建立H5N1 AIV感染诱导B1单倍型鸭细胞免疫应答的动物模型。利用H5N1 AIV特异性鸭记忆性PBMC筛选B1单倍型鸭MHCⅠ类分子限制性T细胞表位，为H5N1 AIV表位疫苗的研发提供条件。
本发明还证明了T细胞免疫应答在B1单倍型鸭抵抗H5N1 AIV感染中的重要作用；并通过培养H5N1 AIV记忆性CD8+T细胞，鉴定其效应应答因子，阐明鸭CD8+T细胞效应应答的分子机制。
附图说明
图1为H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后拭子病毒滴度。图1A为咽拭子；图1B为泄殖腔拭子。
注：运用one-way ANOVA进行统计学分析。
图2为血清中HI抗体水平。
注：运用paired-t test进行统计学分析。
图3为攻毒后B1单倍型鸭PBMC中CD4+T、CD8+T细胞比例变化。图3A为CD4+T细胞圈门策略，图3B为CD8+T细胞圈门策略；图3C为CD4+T比例变化；图3D为CD8+T细胞比例变化。
注：运用two-way ANOVA(or mixed model)进行统计学分析。
图4为攻毒后B1单倍型鸭PBMC中免疫相关基因表达情况。图4A为天然免疫基因表达情况；图4B为CTLs基因表达情况；图4C为Th2基因表达情况；图4D为IL-6表达情况。
注：分别从3只感染组(#92、#94、#95)和3只对照组(#92、#94、#9)的B1单倍型鸭PBMC中提取细胞总RNA。数据来自于每组的三个生物样本，每个样本一式三份进行qPCR试验。运用paired-t test进行统计学分析。
图5为鸭PBMC体外培养形态学变化。
图6为H5N1 AIV刺激后CD8+T细胞比例与细胞数量变化。图6A为的流式染色圈门策略；图6B为H5N1 AIV刺激后CD8+T细胞比例与细胞数量变化情况。
注：运用unpaired-t test进行统计学分析。
图7为流式检测H5N1 AIV刺激CFSE标记的PBMC增殖实验圈门策略。
图8为流式检测H5N1 AIV刺激CFSE标记的PBMC增殖。
注：红色表示CFSE标记PBMC细胞后0天的样本，蓝色表示H5N1刺激CFSE标记PBMC细胞后6天的样本，橙色表示H5N1刺激CFSE标记PBMC细胞后9天的样本，绿色表示H5N1刺激CFSE标记PBMC细胞后12天的样本。从左到右样本编号依次为#92、#94、#95。
图9为流式检测conA刺激CFSE标记PBMC增殖实验。
注：红色表示CFSE标记PBMC细胞后0天的样本，蓝色表示ConA刺激CFSE标记PBMC细胞后6天的样本，绿色表示ConA刺激CFSE标记PBMC细胞后12天的样本。
图10为流式分选和qRT-PCR分析H5N1 AIV记忆性CD8+T细胞转录水平变化。图10A为流式分选CD8+T细胞圈门策略。图10B为qRT-PCR分析H5N1亚型AIV记忆性CD8+T细胞转录水平变化，实验结果运用paired-t test进行统计学分析。
注：数据来自于体外培养H5N1刺激组(#92、#94、#95)和对照组(#92、#94、#95)的三个生物样本，每个样本一式三份进行qPCR试验。
图11为qRT-PCR分析多肽库刺激鸭记忆性T细胞后IFN-γ基因mRNA表达情况。
注：数据来自于三个生物样本(#92、#94、#95)，每个样本一式三份进行qPCR试验。运用paired-ttest进行统计学分析。
图12为qRT-PCR分析免疫优势9肽刺激鸭记忆性T后IFN-γ基因mRNA表达情况。
注：数据来自于三个生物样本(#92、#94、#95)，每个样本一式三份进行qPCR试验。运用paired-ttest进行统计学分析，n＝3，每条肽3个技术重复。
P>0.05，ns(not significant)，差异不显著；*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著；***P<0.01，差异极显著。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
AIV：禽流感病毒；
MHC I：I型主要组织相容性复合体；
B1 haplotype：B1单倍型；
PBMC：外周血单个核细胞；
APC：抗原递呈细胞；
SPF鸭：无特定病原体鸭；
CTL：细胞毒性T细胞；
IFN-γ：γ干扰素；
DPI：攻毒后天数；
EID50：鸡胚半数感染量；
FBS：胎牛血清。
本发明首先用H5N1 AIV(A/Duck/Guangdong/383/2008)株感染B1单倍型SPF鸭，通过检测鸭子的泄殖腔排毒情况、喉头排毒情况、血清中抗体水平变化、PBMC中T细胞亚型的变化情况以及PBMC中免疫相关基因的变化，确定感染模型的成功建立以充当后续的试验材料。然后，通过流式分选出体外培养的H5N1亚型AIV记忆性CD8+T细胞，分析其效应应答分子转录水平变化规律。最后应用MHCⅠ类分子限制性结合多肽预测数据库(NetMHCpan)进行T细胞表位预测，再与鸭记忆性PBMC共培养，筛选H5N1 AIV中具有免疫原性的多肽表位。
试验材料
1、毒株背景
A/Duck/Guangdong/383/2008(H5N1亚型AIV)由华南农业大学兽医学院传染病研究室分离保存。
2、鸡胚与实验动物
2周龄B1单倍型SPF鸭购自国家禽类实验动物资源库，9～11日龄SPF鸡胚由广东省新兴大华农禽蛋有限公司提供。
3、主要试剂
RPMI-1640培养基、FBS澳洲胎牛血清、PBS PH7.4 basic 1×、10000UI双抗、L-谷氨酰胺(200mM)、HEPES(100×)、丙酮酸钠(100mM)、非必需氨基酸(100×)、0.25％Trypsin-EDTA胰酶购自美国GIBCO公司；
鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒和红细胞裂解液购自天津灏洋生物公司；2-巯基乙醇(55μM)、刀豆素蛋白(ConA)、TPCK-treated trypsin购自美国Sigma；ChamQ SYRBR qPCRMaster Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Dead CeLL RemovaL Kit购自MiLtenyiBiotec公司。
4、流式抗体
流式抗体Anti-Duck CD8 antibody和CFSE-LabeLing kit购自abcam公司；Anti-Duck CD4 antibody购自SouthemBiotech公司；Goat Anti-Mouse IgG-FITC抗体购自abbkine公司。
5、主要试剂制备
(1)10％完全培养基(RP-10)：10％ FBS+90％1640，配制完成后置于4℃保存。
(2)T细胞培养基：10％ FBS+1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％双抗、β-巯基乙醇+90％ RMPI 1640充分混匀后，配制完成后分装置于4℃保存使用。
(3)流式Buffer：2％ FBS+98％ PBS，配制完成后放于4℃备用。
(4)细胞冻存液：10％ DMSO+90％ FBS，配制完成后放于4℃备用。
实验方法
1、病毒鸡胚半数致死量EID50的测定
EID50的测定：用含双抗的PBS按照10-1依次倍比稀释至10-10，取10-5～10-10稀释度的病毒液进行接种。9～11日龄SPF鸡胚进行酒精消毒处理，每个鸡胚接种100μL稀释后的病毒液，石蜡封孔后置于37℃孵化箱中培养。24～48h后将死亡鸡胚放入4℃冰箱冷却6h使血管冷缩。收毒时将鸡胚进行酒精消毒，打开气室后用移液枪吸取25μL尿囊液测定血凝效价，利用Reed-Muench法计算EID50。
血凝效价(HA)的测定：取96孔V型反应板，用排枪向1～12孔分别加入25μL灭菌PBS，向第一孔中加入25μL尿囊液，用排枪吹打20下后吸取25μL加入第二孔，依次倍比稀释至第十一孔，弃掉第十一孔的25μL液体，第十二孔设为阴对照。分别每孔加入25μL 1％鸡红细胞，震荡混匀后室温静置30min。
2、单倍型鸭背景参数检测
攻毒前3天，采集所有单倍型鸭0.5mL非抗凝血，置于室温静置6h后，分离血清，进行血凝抑制实验检测AIV抗体水平。
3、H5N1 AIV感染诱导B1单倍型鸭细胞免疫应答动物模型的建立
用含双抗的无菌PBS将病毒液稀释至103.5EID50/200μL。将实验动物分成2组，实验组7只、对照组3只。采用点眼滴鼻方式进行病毒接种，实验组每只鸭接种200μL病毒液，对照组接种200μL无菌PBS。攻毒后3、5、7、9、14天采集动物的咽喉和泄殖腔拭子，外周抗凝血及非抗凝血进行检测。
3.1、单倍型鸭排毒情况检测
采集每只鸭的喉头与泄殖腔拭子，置于含双抗和30％甘油的灭菌PBS中，-80℃保存备用。按步骤1测定EID50，以此评估B1单倍型鸭排毒情况。
3.2、血清抗体水平检测
采集0.5mL非抗凝血，置于室温静置6h后，收集析出的血清至1.5mL灭菌EP管中，2000rpm4℃离心10min后吸取上清，-20℃保存备用。
3.3、检测单倍型鸭PBMC中T细胞亚型变化情况
通过颈静脉采集2.5mL外周血置于含有肝素钠的采集管中。按照鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒说明书分离PBMC，取适量细胞作流式染色。具体操作方法如下：每只鸭各取2×106个细胞，均按说明书推荐浓度加入小鼠抗鸭CD4+单克隆抗体或小鼠抗鸭CD8+单克隆抗体，4℃避光孵育30min。用PBS清洗后加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体，4℃避光孵育30min。染色完成后用PBS清洗两次，每管加入200μL流式Buffer重悬。通过流式细胞仪进行上机检测，检测结果用FLowJo软件进行分析。
3.4、荧光定量PCR检测单倍型鸭PBMC免疫相关基因变化
RNA抽提：制备3DPI和7DPI(days post infection，DPI，攻毒后天数)鸭PBMC，按照Magen公司微量细胞RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。通过超微量分光光度计检测RNA浓度后，-80℃保存。
RNA反转录：按照以下表格用量在冰上配置反转录体系；
表1反转录体系
Figure BDA0004123592470000051
将以上体系配好混匀后离心，在PCR仪上进行反转录，程序设定为：37℃15min，85℃灭活5s，4℃保存备用。
荧光定量PCR：将反转录后的cDNA调整浓度为2ng/μL，按照以下表格用量配置荧光定量PCR体系；
表2荧光定量反应体系
Figure BDA0004123592470000052
将以上体系配好混匀后离心，在7500ReaL Time PCR system上进行反应，按照Vazyme qPCR酶的说明书设置程序。具体反应条件为：95℃，30s；95℃，10s；60℃，30s；共计循环40次；溶解曲线分析：95℃，15s；温度再升至95℃，间隔15s；收集荧光信号。上述实验结果运用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。
4、H5N1 AIV记忆性T细胞体外扩增培养方法的建立
4.1、H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC体外扩增培养
(a)H5N1 AIV感染抗原递呈细胞
将病毒以MOI＝5接种2×106个PBMC，病毒孵育1h后更换为600μL的T细胞培养基，39℃孵育5h。将感染了H5N1 AIV的PBMC作为实验中的抗原递呈细胞(Antigen presentingceLL，APC)。
(b)APC刺激B1单倍型鸭PBMC
分离PBMC后，每个样品取3×107个细胞均分为三组，分别是H5N1组、阳对照组与阴对照组。每组以3×106个细胞/mL的密度铺于48孔板中，培养6h后实验组加入200μL感染了H5N1亚型AIV的APC，阳对照组加入2μg/mL的ConA，阴对照组不做任何处理。置于39℃培养箱进行培养，每天观察细胞形态学变化，并取细胞进行台盼蓝染色计数，记录细胞数量变化规律。
(c)流式细胞术检测H5N1 AIV刺激后T细胞比例变化
H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC培养7天后，收集细胞进行计数，实验组与对照组各取2×106个细胞均匀分装至2个流式管中备用。清洗离心后分别用anti-Duck的CD4、CD8抗体进行流式染色，分析H5N1 AIV刺激鸭PBMC后T细胞比例变化规律。
4.2、CFSE标记检测B1单倍型鸭PBMC增殖
(a)CFSE标记B1单倍型鸭PBMC
实验前先将灭菌PBS与RP-10培养基置于37℃水浴锅进行预热。用PBS清洗细胞，400g离心5min，将细胞沉淀以1×107/mL的浓度重悬于含有0.5μM CFSE的PBS中，于37℃水浴锅避光孵育10min。孵育完成后，400g离心5min，弃掉上清，加入预热的RP-10培养基清洗细胞。离心弃上清后用T细胞培养基重悬。
(b)H5N1 AIV感染CFSE标记后的APC
取2×106个CFSE标记后的鸭PBMC于15mL生物反应管中，以MOI＝5接种H5N1病毒液，病毒孵育1h后更换为600μL的T细胞培养基，39℃继续孵育5h。
(c)CFSE-APC刺激CFSE-PBMC
将CFSE标记后的鸭PBMC分为三组，分别是H5N1组、阳对照组和阴对照组。每组以3×106个细胞/mL的密度铺于48孔板中，6h后实验组加入200μL感染了H5N1 AIV的CFSE-APC，阳对照组加入2μg/mL的ConA，阴对照组不做任何处理。置于39℃培养箱进行培养，每天观察细胞形态学变化，并取细胞进行流式检测，记录细胞增殖变化情况。
4.3、荧光定量PCR检测增殖的CD8+T细胞效应应答情况
(a)B1单倍型鸭PBMC体外扩增培养和死细胞去除
收集培养7天后的H5N1亚型AIV刺激组PBMC细胞和未刺激的PBMC细胞，按照死细胞去除试剂盒说明书进行死细胞去除，保证细胞活率高于90％。
(b)流式分选CD8+T细胞
收集3个AIV刺激组PBMC和3个对照组PBMC样本，其中每个样本各取107个细胞，参照3.3用anti-Duck的CD8抗体进行流式染色。通过流式分选仪分选出CD8+T细胞，将分选出的细胞收集于2mL含500μL 5％ FBS 1640中。
(c)荧光定量PCR检测CD8+T细胞转录水平变化
将上述分选所得的CD8+T细胞以2000rpm离心10min后，弃掉上清培养液，提取CD8+T细胞的总RNA，进行反转录和荧光定量PCR。
5、H5N1 AIV特异性CD8+T细胞表位的筛选
5.1、9mer氨基酸多肽序列合成
(a)9mer氨基酸多肽序列的预测与合成
以霍夫曼流感病毒通用引物扩增出H5N1亚型AIV的基因组序列，经测序验证后确定其蛋白序列。应用MHCⅠ限制性结合多肽预测网站数据库(NetMHCpan-4.0-Services-DTUHeaLth Tech)，对H5N1亚型AIV蛋白序列进行MHCⅠ限制性T细胞表位预测。总共预测出109条评分较高的氨基酸多肽，委托金斯瑞生物科技有限公司进行合成，合成多肽的纯度>95％。
(b)9mer氨基酸多肽的溶解与保存
合成的氨基酸多肽粉末置于-20℃冰箱保存。溶解前将多肽从冰箱拿出以3000rpm离心5min，向装有1mg氨基酸多肽的管中加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，将多肽稀释为10μg/μL的贮存浓度，室温静止15min后以20μL一管分装冻存于-80℃冰箱长期保存。
5.2、免疫原性9mer肽筛选
复苏B1单倍型鸭记忆性PBMC后，根据细胞计数结果用T细胞培养基调整细胞密度为2.5～3×106个细胞/mL，并以1mL/孔均分于48孔板中，分孔后先将细胞置于39℃，5％ CO2培养箱培养6小时。待多肽融化后，以3～5条在同一蛋白上的多肽为一组，混匀制备成肽库。向48孔板中培养的细胞中加入10μL混合后的肽库，每孔中多肽终浓度为100μg/mL。同时设置不同对照组，阴性对照组加入10μL二甲基亚砜溶液，空白对照组不做任何处理，阳性对照组加入2μg/mL的ConA。混匀后置于39℃培养箱进行培养，每天观察细胞形态学变化进行换液处理。在第7～9天收取T细胞分别用荧光定量PCR检测IFN-γ的表达情况。
将能显著刺激T细胞产生IFN-γ的肽库挑选出来，重新命名肽的名字，采用同样的方法对肽库里的每一条肽进行细筛。
实验结果
1、H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后喉头泄殖腔排毒情况检测
在攻毒后3、5、7、9、14天，采集每只鸭的喉头与泄殖腔拭子，检测排毒情况。如图1所示。B1单倍型鸭在攻毒后3DPI到9DPI，泄殖腔和咽喉拭子均能检测到H5N1 AIV，其中排毒高峰在5DPI，从5DPI开始排毒量下降，直至14DPI彻底检测不到流感病毒。对照组排毒检测均为阴性。
2、血清抗体水平检测
结果如图2所示，攻毒后第3天抗体为阴性，攻毒后第5天抗体水平显著性升高(P<0.01)，至第14天抗体水平到达峰值。对照组抗体检测均为阴性。
3、H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后PBMC中T细胞比例变化
图3为检测攻毒后B1单倍型鸭T细胞免疫应答情况，采集鸭外周血，分离PBMC，用流式抗体进行染色。图3A为CD4+T细胞圈门策略，图3B为CD8+T细胞圈门策略，用FLowJo软件对流式结果进行分析。如图3C所示，H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后，在7DPI和9DPI会导致CD4+T细胞比例显著上升。CD8+T细胞亚型的变化如图3D，在5DPI、7DPI、9DPI，感染组CD8+T细胞比例相比对照组显著上升。结果表明H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后，从第5天开始，在鸭PBMC中能检测到明显的T细胞比例增加，并持续到9DPI，提示从第5DPI开始病毒的清除不仅与抗体水平升高有关，CD4+T、CD8+T细胞免疫应答也发挥了重要作用。
4、H5N1 AIV感染后B1单倍型鸭PBMC免疫相关基因变化
为进一步检测H5N1 AIV感染B1单倍型鸭后诱导的免疫应答反应，进一步通过qRT-PCR检测B1单倍型鸭感染3天和7天后PBMC中重要免疫基因mRNA表达量的变化，其中检测主要包括三部分：天然免疫相关基因、CTLs相关基因和Th2相关基因。
天然免疫基因部分(图4A)，与对照组相比，感染组中抗病毒基因MX1(Myxovirusresistance 1)和IFN-β在3DPI和7DPI表达量均显著上调，OASL(2’,5’-Oligoadenylatesynthetase-Like)和IFN-α在3DPI表达量显著上调，模式识别受体TLR3(Toll-Likereceptor 3)，RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(Melanomadifferentiation-associated gene 5)表达量在3DPI显著上调。CTLs基因部分(图4B)，与对照组相比，感染组中Granzyme A、Granzyme k、IFN-γ(Interferon gamma)、IL-2在3DPI和7DPI表达量显著上调，perforin、MHC-I和IL-1β在7DPI表达量显著上调。Th2基因部分(图4C)，IL-4和IL-10在3DPI表达量显著上调。与对照组相比，感染组中IL-6表达量在3DPI和7DPI均无明显区别(图4D)。结合图3中CD4+T、CD8+T细胞比例增加，进一步说明H5N1 AIV感染成功激活了B1单倍型鸭的细胞免疫应答。综合上述结果，H5N1亚型AIV感染诱导B1单倍型SPF鸭细胞免疫应答的模型建立成功。
5、H5N1 AIV记忆性T细胞体外培养
5.1、H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC体外扩增培养
(1)H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC增殖后细胞形态学变化
H5N1 AIV刺激鸭PBMC增殖培养后不同时间，显微镜观察细胞形态。与对照组细胞相比，H5N1AIV刺激组在培养后第3天细胞变大变圆，出现聚集生长现象(图5)，培养后第5至7天，细胞生长状态达到顶峰，后随着时间的增加，细胞死亡数量增多。对照组细胞从始至终未被活化。
(2)流式检测H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC增殖后CD8+T细胞比例变化
H5N1 AIV刺激组PBMC和未刺激组的PBMC各取3个样本进行流式染色。根据图6A所示的流式染色圈门策略，用FLowJo软件对流式结果进行分析。并对分析出的结果进行统计学检验，结果如图6B所示，H5N1 AIV可刺激B1单倍型鸭PBMC中的记忆性CD8+T细胞增殖，且H5N1 AIV刺激组CD8+T细胞比例与细胞数量均显著性高于阴性对照组。
5.2、CFSE标记检测PBMC增殖
按照4.2中的实验方法对鸭PBMC进行CFSE标记与流式检测，根据图7所示的流式圈门策略，用FowJo软件对流式结果进行分析。流式结果如图8、图9所示，ConA与H5N1 AIV刺激组细胞均在培养后第6天出现增殖小峰，表明H5N1 AIV刺激鸭PBMC后可促进T细胞增殖。
5.3、流式分选和荧光定量PCR技术检测增殖的CD8+T细胞效应应答情况
为进一步检测H5N1 AIV刺激B1单倍型鸭PBMC增殖后CD8+T细胞的效应应答，收集AIV刺激组和未刺激组的细胞各3个样本进行流式染色及流式分选。通过qRT-PCR检测CD8+T细胞中重要免疫基因mRNA表达量的变化，主要包括CTLs相关基因、T细胞受体相关基因和活化增殖相关基因等。
如图10所示，与对照组相比，CTLs相关基因Granzyme A、Granzyme k、IFN-γ、Perforin、MHCⅠ、TNF-α表达量显著上升；T细胞受体相关基因CD3E表达量显著上升；细胞增殖相关基因BCL2表达量显著上升；同时IL-18受体辅助蛋白IL18RAP及IL-18受体IL18R1基因表达量显著上升。综合上述结果，H5N1 AIV体外刺激B1单倍型鸭PBMC后，可促进病毒记忆性CD8+T增殖并产生效应应答。
6、H5N1 AIV特异性CD8+T细胞表位的筛选
6.1、9mer氨基酸多肽的制备
利用MHCⅠ限制性结合多肽预测网站数据库(NetMHCpan-4.0-Services-DTUHeaLth Tech)，对H5N1 AIV蛋白序列进行MHCⅠ限制性T细胞表位预测，预测出来的肽如表3所示。
表3根据数据库预测的可能具有免疫原性的多肽
Figure BDA0004123592470000071
Figure BDA0004123592470000081
6.2、荧光定量PCR检测IFN-γ的表达情况
将合成的9肽以3～5条在同一蛋白上的多肽为一组，混匀制备成肽库。分别与B1单倍型鸭记忆性PBMC共培养7～9天后，收集细胞进行RNA抽提与反转，通过qRT-PCR检测IFN-γ的表达情况。实验结果如图11，统计学分析发现pooL_1～pooL_9、pooL_12和pooL_13能显著刺激B1单倍型鸭记忆性PBMC产生IFN-γ，说明组成上述肽池的肽段中存在具有免疫原性的表位。
表4H5N1 AIV特异性CD8+T细胞免疫候选9肽
Figure BDA0004123592470000091
将上述能显著刺激细胞产生IFN-γ的肽库挑选出来，重新命名肽的名字，采用同样的方法对肽库里的每一条肽进行细筛(表5)。如图12所示，9肽M91-99、PB1368-376、NS176-84、PB1540-548刺激B1单倍型鸭记忆性PBMC共培养7～9天后，IFN-γ基因的mRNA水平与对照组比差异极显著，9肽NA325-333、NA429-437、NP338-346、M2-10、M208-216、NP473-481、PA224-232、PA80-88刺激B1单倍型鸭记忆性PBMC共培养7～9天后，IFN-γ基因的mRNA水平与对照组比差异显著。这十二条肽段可认为是B1单倍型限制性的H5N1 AIV T细胞表位。
表5十二条针对B1单倍型鸭的H5N1亚型AIV T细胞表位信息
Figure BDA0004123592470000092
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞表位肽，其特征在于，所述表位肽选自下述(a1)至(c1)中的至少一种：
(a1)氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽中的一条或多条；
(b1)对氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽进行一个或多个保守氨基酸的插入、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽具有与氨基酸序列为SEQID NO.1至SEQ ID NO.12任一项所示的多肽相同或基本相同的功能；
(c1)由氨基酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示的多肽中的一条或多条形成的多聚体多肽。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的表位肽。
3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞系。
4.权利要求1所述的表位肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组细胞系在(a2)～(f2)至少一种中的应用；
(a2)制备H5N1亚型AIV疫苗；
(b2)制备H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞；
(c2)制备监测H5N1亚型AIV的产品；
(d2)制备诱导和/或扩增T细胞的试剂盒；
(e2)制备针对H5N1亚型AIV的抗体中的应用；
(f2)制备检测H5N1亚型AIV感染的试剂盒。
5.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述的表位肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组细胞系。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的表位肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组细胞系。
8.一种抗体，其特征在于，所述抗体以权利要求1所述的表位肽作为免疫原制备所得。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求8所述的抗体。
10.一种非治疗目的的诱导和/或扩增H5N1亚型AIV MHC B1限制性T细胞的方法，包括使用权利要求1所述的表位肽。
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