CN116377008A - 一种醋酸四烯物的制备方法和甾醇脱氢酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种醋酸四烯物的制备方法和甾醇脱氢酶，属于甾体激素药物制备技术领域。本发明以化合物I为起始原料，经脱水消除反应得到化合物II，之后所述化合物II可以直接经炔化反应得到化合物IV，所述化合物II也可以经3位醚化保护反应后得到化合物III，再进行炔化反应得到化合物IV，之后再依次经酯化反应、溴代加成反应、置换消除反应和酶法脱氢反应制备得到醋酸四烯物。本发明提供的方法中所用起始原料价格低廉，易得稳定，工艺流程简单可控性好，成本低，对环境友好，产物收率高，适合工业化生产。

Description

一种醋酸四烯物的制备方法和甾醇脱氢酶
技术领域
本发明涉及甾体激素药物制备技术领域，尤其涉及一种醋酸四烯物的制备方法和甾醇脱氢酶。
背景技术
醋酸四烯物(21-乙酰氧基孕甾-1,4,9(11),17-四烯-3,20-二酮)是一种非常重要的甾体药物中间体，可用于合成地塞米松、曲安奈德以及布地奈德等多种甾体激素药物。
关于醋酸四烯物的制备，传统的合成路线中，一般以具有17位乙酰基的甾体中间体为原料，经过碘代、酯化得到21位乙酰氧基，该方法的环境污染大，原料较昂贵，生产成本高。
中国专利CN105622699A报道了一种醋酸四烯物的制备方法，具体是以4,9(11)-二烯-雄甾-3,17-二酮为原料，经醚化、加成、取代重排、脱氢得到醋酸四烯物，反应式如式A所示。该方法在加成反应时使用了危险性较高的金属锂试剂，有较大的生产安全隐患；在脱氢反应时使用了毒性较大的DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌)脱氢法，对环境污染较大；且该方法的收率偏低，生产成本较高。
Figure BDA0004144578240000011
中国专利CN102603843A报道了一种醋酸四烯物的制备方法，具体是以1,4,9(11)-三烯-雄甾-3,17-二酮为原料，经炔化、酯化、氧化、重排得到醋酸四烯物，反应式如式B所示。该方法的收率偏低，且氧化过程使用贵金属催化，生产成本高，不适合工业化生产。
Figure BDA0004144578240000021
此外，在醋酸四烯物的制备过程中，关于最后一步C1,2位的脱氢反应，目前研究及工业化生产会用到微生物发酵的方法，该方法反应周期较长(72～120h)，收率较低(70％左右)；而且通过发酵脱氢C21位的醋酸酯会发生大量水解，为了得到目标产物，必须再添加一步酯化反应，操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种醋酸四烯物的制备方法和甾醇脱氢酶，本发明提供的方法中所用起始原料价格低廉，易得稳定，工艺流程简单可控性好，成本低，对环境友好，产物收率高，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种醋酸四烯物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物I、脱水剂与第一溶剂混合，进行脱水消除反应，得到化合物II；
(2-1)将所述化合物II、醚化试剂、催化剂与第二溶剂混合，进行醚化反应，将所得醚化产物体系与第一酸试剂混合，进行水解反应，得到化合物III；
将所述化合物III、第一碱试剂与第三溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第一炔化反应，将所得第一炔化产物体系与第二酸试剂混合，进行脱保护反应，得到化合物IV；
或者(2-2)将所述化合物II、第二碱试剂与第四溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第二炔化反应，得到化合物IV；
(3)将所述化合物IV、酰化试剂、第三碱试剂与第五溶剂混合，进行酯化反应，得到化合物V；
(4)将所述化合物V、溴代试剂、水与第六溶剂混合，进行二溴代转化反应，将所得二溴代转化产物体系与还原剂混合，进行脱溴反应，得到化合物VI；
(5)将所述化合物VI、取代-碱试剂、第三酸试剂与第七溶剂混合，进行置换消除反应，得到化合物VII；所述取代-碱试剂为碳酸盐与乙酸复配物或乙酸盐；
(6)将所述化合物VII、磷酸盐、甾醇脱氢酶与第八溶剂混合，进行酶法脱氢反应，得到醋酸四烯物；所述甾醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述化合物I～化合物VII的结构式如式I～式VII所示：
Figure BDA0004144578240000031
所述式III中R为甲基或乙基。
优选地，所述脱水剂包括硫酸、氯磺酸、氯化亚砜或五氯化磷；所述脱水消除反应的温度为-20～50℃，时间为2～15h。
优选地，所述醚化试剂包括原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯；所述催化剂包括吡啶对甲苯磺酸盐、吡啶盐酸盐或吡啶氢溴酸盐；醚化反应的温度为20～60℃，时间为5～7h；
所述第一酸试剂包括对甲苯磺酸水溶液、三氯乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；所述水解反应的温度为-10～20℃，时间为0.5～2h。
优选地，所述第一碱试剂包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第一炔化反应的温度为-30～30℃，时间为2～4h；
第二酸试剂包括盐酸、硫酸、乙酸水溶液或磷酸水溶液；所述脱保护反应的温度为20～60℃，时间为2～15h。
优选地，所述第二碱试剂包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第二炔化反应的温度为-30～30℃，时间为2～4h。
优选地，所述酰化试剂包括乙酸酐或乙酰氯；所述第三碱试剂包括吡啶、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和咪唑中的一种或多种；所述酯化反应的温度为0～60℃，时间为4～6h。
优选地，所述溴代试剂包括二溴二甲基己内酰脲、N-溴代乙酰胺或N-溴代琥珀酰亚胺；所述二溴代转化反应的温度为0～40℃，时间为3～10h；
所述还原剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫氢化钠、硫化钠、亚磷酸三甲酯或亚磷酸二乙酯；所述脱溴反应的温度为0～60℃，时间为0.5～10h。
优选地，所述第三酸试剂包括乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸；所述置换消除反应的温度为60～120℃，时间为5～10h。
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种；所述酶法脱氢反应的条件包括：pH值为6.0～8.0，温度为20～45℃，时间为12～24h。
本发明提供了一种甾醇脱氢酶，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种醋酸四烯物的制备方法。本发明以化合物I(即9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮)为起始原料，经脱水消除反应得到化合物II，之后所述化合物II可以直接经炔化反应得到化合物IV，所述化合物II也可以经3位醚化保护反应后得到化合物III，再进行炔化反应得到化合物IV，之后再依次经酯化反应、溴代加成反应、置换消除反应和酶法脱氢反应制备得到醋酸四烯物。本发明提供的方法中所用起始原料价格低廉，易得稳定，工艺流程简单可控性好，成本低，对环境友好，产物收率高且质量稳定，适合工业化生产。具体的，本发明提供的方法在构建C17位侧链(基于炔化反应以及后续反应)时，无易燃易爆的高风险反应，工艺流程安全可控，操作简便，具有收率高以及成本低的优势，适合大规模工业化生产。本发明在C1,2位脱氢时采用酶法脱氢，相比化学脱氢法具有环境污染小的优点，且具有微生物发酵脱氢法不具备的投料浓度大、产物收率高以及生产周期短(酶法脱氢反应时间短且在限定条件下C21位的醋酸酯不会发生水解，不需要再额外进行酯化反应)的优点；同时，将本发明的甾醇脱氢酶用于脱氢反应，具有脱氢效率高、产物纯度高的优点。
附图说明
图1为本实施例制备得到的醋酸四烯物的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种醋酸四烯物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物I、脱水剂与第一溶剂混合，进行脱水消除反应，得到化合物II；
(2-1)将所述化合物II、醚化试剂、催化剂与第二溶剂混合，进行醚化反应，将所得醚化产物体系与第一酸试剂混合，进行水解反应，得到化合物III；
将所述化合物III、第一碱试剂与第三溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第一炔化反应，将所得第一炔化产物体系与第二酸试剂混合，进行脱保护反应，得到化合物IV；
或者(2-2)将所述化合物II、第二碱试剂与第四溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第二炔化反应，得到化合物IV；
(3)将所述化合物IV、酰化试剂、第三碱试剂与第五溶剂混合，进行酯化反应，得到化合物V；
(4)将所述化合物V、溴代试剂、水与第六溶剂混合，进行二溴代转化反应，将所得二溴代转化产物体系与还原剂混合，进行脱溴反应，得到化合物VI；
(5)将所述化合物VI、取代-碱试剂、第三酸试剂与第七溶剂混合，进行置换消除反应，得到化合物VII；所述取代-碱试剂为碳酸盐与乙酸复配物或乙酸盐；
(6)将所述化合物VII、磷酸盐、甾醇脱氢酶与第八溶剂混合，进行酶法脱氢反应，得到醋酸四烯物；所述甾醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述化合物I～化合物VII的结构式如式I～式VII所示：
Figure BDA0004144578240000061
所述式III中R为甲基或乙基。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。本发明以下涉及的各反应优选在搅拌条件下进行。
本发明将化合物I、脱水剂与第一溶剂混合，进行脱水消除反应，得到化合物II。在本发明中，所述化合物I即为9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，以其作为起始原料，价格低廉，有利于降低生产成本。在本发明中，所述脱水剂优选包括硫酸、氯磺酸、氯化亚砜或五氯化磷，所述硫酸的浓度优选为98wt％；所述脱水剂与化合物I的质量比优选为(0.4～2)：1，更优选为(0.4～1.5)：1，进一步优选为(0.6～1.2)：1。在本发明中，所述第一溶剂优选包括水、乙酸和四氢呋喃中的一种或多种，所述第一溶剂的体积与化合物I的质量比优选为(1～10)mL：1g，更优选为(2～8)mL：1g，进一步优选为(5～7)mL：1g。
本发明优选将化合物I与第一溶剂混合，然后加入脱水剂进行脱水消除反应。在本发明中，所述脱水消除反应的温度优选为-20～50℃，更优选为-15～20℃，进一步优选为-10～10℃；时间优选为2～15h，更优选为3～12h，进一步优选为4～10h。所述脱水消除反应后，本发明优选加水淬灭反应，将所得产物体系进行水析或浓缩后进行水析，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物II。本发明优选根据所述第一溶剂的具体种类选择直接进行水析，还是浓缩后进行水析；如当所述第一溶剂为水时，所述脱水消除反应后可直接加水淬灭反应并进行水析，当所述第一溶剂为四氢呋喃时，所述脱水消除反应后加水淬灭反应，将所得产物体系浓缩去除溶剂，然后再向所得剩余物中加水进行水析。本发明对所述水析以及浓缩的具体操作方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
得到化合物II后，本发明采用两种合成路线制备得到化合物IV，一种是将所述化合物II经3位醚化保护反应制备得到化合物III，所述化合物III经炔化反应以及脱保护反应制备得到化合物IV；另一种是所述化合物II直接经炔化反应制备得到化合物IV，产物收率略低于第一种合成路线。下面进行具体说明。
本发明将所述化合物II、醚化试剂、催化剂与第二溶剂混合，进行醚化反应，将所得醚化产物体系与第一酸试剂混合，进行水解反应，得到化合物III。在本发明中，所述醚化试剂优选包括原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯；所述醚化试剂的体积与所述化合物II的质量比优选为(0.5～2)mL：1g，更优选为(0.8～1.6)mL：1g，进一步优选为(1～1.4)mL：1g。在本发明中，所述催化剂优选包括吡啶对甲苯磺酸盐、吡啶盐酸盐或吡啶氢溴酸盐；所述催化剂与所述化合物II的质量比优选为(0.01～0.2)：1，更优选为(0.05～0.1)：1。在本发明中，所述第二溶剂优选醇类溶剂，更优选为甲醇或乙醇；所述第二溶剂的体积与所述化合物II的质量比优选为(0.5～5)mL：1g，更优选为(1～4.8)mL：1g，进一步优选为(2～4)mL：1g。
本发明优选将化合物II与第二溶剂混合，然后依次加入醚化试剂以及催化剂进行醚化反应。在本发明中，所述醚化反应的温度优选为20～60℃，更优选为35～50℃，进一步优选为40～45℃；时间优选为5～7h，更优选为5.5～6.5h，进一步优选为6～6.5h。在本发明中，所述醚化反应的过程中，部分反应物在3位和17位均发生了醚化反应，后续通过第一酸试剂将17位醚化水解掉。
所述醚化反应后，本发明无需进行任何后处理，直接将所得醚化产物体系与第一酸试剂混合，进行水解反应，得到化合物III。在本发明中，所述第一酸试剂优选包括对甲苯磺酸水溶液、三氯乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；所述第一酸试剂的浓度优选为0.2～2wt％，更优选为1～2wt％；所述第一酸试剂的体积与所述化合物II的质量比优选为(1～5)mL：1g，更优选为(1～2.5)mL：1g，进一步优选为(1～1.5)mL：1g。
本发明优选向所述醚化产物体系中加入第一酸试剂进行水解反应。在本发明中，所述水解反应的温度优选为-10～20℃，更优选为0～15℃，进一步优选为5～10℃；时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。所述水解反应后，本发明优选将所得水解产物体系的pH值调节至7～8，之后浓缩除去溶剂，将剩余物降温至10～15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物III。在本发明中，调节所述pH值采用的pH值调节剂优选包括碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钾水溶液或碳酸氢钾水溶液；所述pH值调节剂的浓度优选为5～20wt％，更优选为5～10wt％。
得到化合物III后，本发明将所述化合物III、第一碱试剂与第三溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第一炔化反应，将所得第一炔化产物体系与第二酸试剂混合，进行脱保护反应，得到化合物IV。在本发明中，所述第一碱试剂优选包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第一碱试剂与所述化合物III的质量比优选为(0.2～1)：1，更优选为(0.3～0.8)：1，进一步优选为(0.4～0.6)：1。在本发明中，所述第三溶剂优选包括四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃和甲苯中的一种或多种；所述第三溶剂的体积与物化合物III的质量比优选为(2～10)mL：1g，更优选为(4～8)mL：1g。
本发明优选将第一碱试剂与第三溶剂混合，通入乙炔气体并加入所述化合物III进行第一炔化反应。在本发明中，所述第一炔化反应的温度优选为-30～30℃，更优选为-15～25℃，进一步优选为0～20℃；时间优选为2～4h，更优选为3～4h。
所述第一炔化反应后，本发明无需进行任何后处理，直接将所得第一炔化产物体系与第二酸试剂混合，进行脱保护反应，得到化合物IV。本发明采用第二酸试剂淬灭第一炔化反应并实现脱保护反应。在本发明中，所述第二酸试剂优选包括盐酸、硫酸、乙酸水溶液或磷酸水溶液，所述第二酸试剂的浓度优选为30～50wt％，更优选为30～40wt％；所述第二酸试剂的体积与物化合物III的质量比优选为(0.5～1.5)mL：1g，更优选为(0.7～1.4)mL：1g，进一步优选为(1～1.2)mL：1g。本发明优选采用上述用量的第二酸试剂，有利于在保证充分淬灭第一炔化反应的同时使脱保护反应具有较高反应速率。
本发明优选向所述第一炔化产物体系中加入第二酸试剂进行脱保护反应。在本发明中，所述脱保护反应的温度优选为20～60℃，更优选为20～40℃；时间优选为2～15h，更优选为5～10h。所述脱保护反应后，本发明优选将所得脱保护产物体系的pH值调节至6～7，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入水进行水析，然后降温至10～15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物IV。在本发明中，调节所述pH值采用的pH值调节剂优选包括氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；所述pH值调节剂的浓度优选为20～40wt％，更优选为25～30wt％。
或者，本发明将所述化合物II、第二碱试剂与第四溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第二炔化反应，得到化合物IV。在本发明中，所述第二碱试剂优选包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第二碱试剂与所述化合物II的质量比优选为(0.2～1)：1，更优选为(0.3～0.6)：1，进一步优选为(0.4～0.5)：1。在本发明中，所述第四溶剂优选包括四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃和甲苯中的一种或多种；所述第四溶剂的体积与所述化合物II的质量比优选为(2～10)mL：1g，更优选为(4～8)mL：1g。
本发明优选将第二碱试剂与第四溶剂混合，通入乙炔气体并加入所述化合物II进行第二炔化反应。在本发明中，所述第二炔化反应的温度优选为-30～30℃，更优选为0～20℃，时间优选为2～4h，更优选为3～4h。所述第二炔化反应后，本发明优选将所得第二炔化产物体系的pH值调节至6～7，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入水进行水析，然后降温至10～15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物IV。在本发明中，调节所述pH值采用的pH值调节剂优选包括盐酸、硫酸、乙酸水溶液和磷酸水溶液中的一种或多种；所述pH值调节剂的浓度优选为30～50wt％，更优选为30～40wt％。
得到化合物IV后，本发明将所述化合物IV、酰化试剂、第三碱试剂与第五溶剂混合，进行酯化反应，得到化合物V。在本发明中，所述酰化试剂优选包括乙酸酐或乙酰氯；所述酰化试剂的体积与所述化合物IV的质量比优选为(0.5～2)mL：1g，更优选为(0.5～1)mL：1g。在本发明中，所述第三碱试剂优选包括吡啶、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和咪唑中的一种或多种；所述第三碱试剂与所述化合物IV的质量比优选为(0.3～1.3)：1，更优选为(0.5～0.8)：1。在本发明中，所述第五溶剂优选包括二氯甲烷、三氯甲烷和甲苯中一种或多种；所述第五溶剂的体积与所述化合物IV的质量比优选为(2～10)mL：1g，更优选为(4～8)mL：1g。
本发明优选将所述化合物IV与第五溶剂混合，然后加入第三碱试剂和酰化试剂，进行酯化反应。在本发明中，所述酯化反应的温度优选为0～60℃，更优选为20～40℃，进一步优选为25～30℃；时间优选为4～6h，更优选为4～5h。所述酯化反应后，本发明优选向所得乙酰化产物体系中加水淬灭反应，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入水进行水析，然后降温至10～15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物V。
得到化合物V后，本发明将所述化合物V、溴代试剂、水与第六溶剂混合，进行二溴代转化反应，将所得二溴代转化产物体系与还原剂混合，进行脱溴反应，得到化合物VI。在本发明中，所述溴代试剂优选包括二溴二甲基己内酰脲、N-溴代乙酰胺或N-溴代琥珀酰亚胺；所述溴代试剂与所述化合物V的质量比优选为(0.5～1.5)：1，更优选为(0.7～1.2)：1。在本发明中，所述第六溶剂优选为有机溶剂，所述有机溶剂优选包括叔丁醇、异丁醇、丙酮、醋酸乙酯、甲苯和二氯甲烷中的一种或多种；所述水的体积、有机溶剂的体积与所述化合物V的质量比优选为(0.5～1.5)mL：(1～30)mL：1g，更优选为(0.5～1)mL：(5～15)mL：1g。
本发明优选将所述化合物V与第六溶剂混合，然后加入溴代试剂进行二溴代转化反应，在本发明中，所述二溴代转化反应的温度优选为0～40℃，更优选为10～25℃；时间优选为3～10h，更优选为5～8h，进一步优选为6～7h。在本发明中，所述化合物V中炔基发生二溴代转化反应，后续在还原剂作用下经脱溴反应脱去一个溴。
所述二溴代转化反应完成后，本发明无需进行任何后处理，直接将所得二溴代转化产物体系与还原剂混合，进行脱溴反应，得到化合物VI。在本发明中，所述还原剂优选包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫氢化钠、硫化钠、亚磷酸三甲酯或亚磷酸二乙酯；当所述还原剂为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫氢化钠或硫化钠时，所述还原剂优选以还原剂水溶液形式使用，所述还原剂水溶液的浓度优选为5～20wt％，更优选为10～15wt％；所述还原剂与所述化合物V的质量比优选为(0.1～1.5)：1，更优选为(0.1～0.8)：1，进一步优选为(0.2～0.4)：1。
本发明优选向所述二溴代转化产物体系中加入还原剂进行脱溴反应。在本发明中，所述脱溴反应的温度优选为0～60℃，更优选为20～40℃；时间优选为0.5～10h，更优选为1～5h，进一步优选为1.5～3h。所述脱溴反应后，本发明优选将所得产物体系进行水析或浓缩后进行水析，然后降温至5～10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VI。
得到化合物VI后，本发明将所述化合物VI、取代-碱试剂、第三酸试剂与第七溶剂混合，进行置换消除反应，得到化合物VII。在本发明中，所述第三酸试剂优选包括乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸；所述第三酸试剂与所述化合物VI的质量比优选为(0.04～1)：1，更优选为(0.04～0.4)：1。在本发明中，所述取代-碱试剂为碳酸盐与乙酸复配物或乙酸盐；所述乙酸盐优选包括乙酸钾或乙酸钠，所述乙酸盐与所述化合物VI的质量比优选为(0.2～1.5)：1，更优选为(0.2～0.8)：1；所述碳酸盐与乙酸复配物中碳酸盐优选包括碳酸钾或碳酸钠，所述碳酸盐与所述化合物VI的质量比优选为(0.2～1)：1，更优选为(0.2～0.6)：1；所述碳酸盐与乙酸复配物中乙酸的体积与所述化合物VI的质量比优选为(0.1～1.2)mL：1g，更优选为(0.1～0.7)mL：1g。在本发明中，所述第七溶剂优选为二甲基甲酰胺和/或二甲基乙酰胺；所述第七溶剂的体积与所述化合物VI的质量比优选为(2～10)mL：1g，更优选为(4～8)mL：1g。
本发明优选将所述化合物VI与第七溶剂混合，然后加入第三酸试剂以及取代-碱试剂，进行置换消除反应。在本发明中，所述置换消除反应的温度优选为60～120℃，更优选为80～120℃，进一步优选为100～110℃；时间优选为5～10h，更优选为5～8h，进一步优选为6～7h。在本发明中，所述置换消除反应过程中，所述取代-碱试剂作为取代试剂将21位溴取代成乙酰氧基，同时作为碱试剂将17位乙酰氧基脱去成双键。所述置换消除反应后，本发明优选向所得置换消除产物体系中加水进行水析，然后降温至5～10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VII(即醋酸三烯物)。
得到化合物VII后，本发明将所述化合物VII、磷酸盐、甾醇脱氢酶与第八溶剂混合，进行酶法脱氢反应，得到醋酸四烯物。在本发明中，所述甾醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
TTGGCTTCTGCTGCTGCTGGTGCTGACGGTCTGCCGCTGCTGGACGGTGGTGTTCCGCTGCTGGGTCACCTGGCTCAGTTCTTCCGTGACCCGGATTCTGTTCTGAAACGTGGTTACCGTTCTAAAGGTCGTCTGTTCGCTATGAACTTGATGGGTCAGCGTATGAACGTTATGCTCGGACCGGAACACAACCGTTACTTCTTCGAAGAAACCGACAAACTGCTGTCTATCCGTGAATCTATGCCGTTCTTCCTGTTAATGTTCTGTCCGGAATTAATCTCTTTCGCTGAAATGGACGAATACCTGCGTCAGCGTGCTATCATCATGCCGCGTTTCAAAGCTGCATCTATGTTTCAGTACGTTCCGGTTATGGTTGAAGAATCTCTGAACCTGGTTGAACGTCTGGGTGAAGAACCTGAATTTGACCTGATCCCGACCGTGGGTCCGGTTGTTATGGACATCGCTGCTCACTCTTTCATGGGTCGTGAATTACACGTTAAACTGGGTCACGAATTTTTCGAACTGTTCCGTGACTTCTCTGGTGGTATGGAATTTGTTCTGCCGCTGTGGCTGCCGACCCCGAAAATGGTTAAATCTCAGCGTGCTTTTAA。
在本发明中，所述甾醇脱氢酶具体为在非致病性微生物(例如大肠杆菌)中的表达产物；所述甾醇脱氢酶与所述化合物VII的质量比优选为(0.5～1)：1，更优选为(0.65～0.85)：1。本发明所述甾醇脱氢酶的作用是与化合物VII的1,2位上的氢结合，使其脱去从而反应生成醋酸四烯物。在本发明中，所述磷酸盐优选包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种；所述磷酸盐与所述化合物VII的质量比优选为(0.02～0.03)：1，更优选为(0.025～0.03)：1。在本发明中，所述第八溶剂优选包括水和有机溶剂，所述有机溶剂优选包括异丙醇、乙醇、甲醇和乙腈中的一种或多种，更优选为异丙醇；所述水的体积、有机溶剂的体积与所述化合物VII的质量比优选为(4～10)mL：(1～4)mL：1g，更优选为(6～8)mL：(2～3)mL：1g。
本发明优选将所述化合物VII、第八溶剂与磷酸盐混合，然后加入甾醇脱氢酶，将所得体系调节至酶法脱氢反应所需pH值，进行酶法脱氢反应。本发明优选采用磷酸盐水溶液调节所述pH值，所述磷酸盐水溶液优选包括磷酸二氢钾水溶液、磷酸氢二钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液和磷酸氢二钠水溶液中的一种或多种；所述磷酸盐水溶液的浓度优选为1～10wt％，更优选为3～7wt％，进一步优选为4～5wt％。在本发明中，所述酶法脱氢反应的条件优选包括：pH值优选为6.0～8.0，更优选为6.5～8.0，进一步优选为6.8～7.3；温度优选为20～45℃，更优选为25～40℃，进一步优选为30～35℃；时间优选为12～24h，更优选为14～18h，进一步优选为15～16h。所述酶法脱氢反应后，本发明优选将所得产物体系过滤，将所得固体物料与甲醇或乙酸乙酯混合，在加热条件下充分溶解可溶性物料，过滤除去甾醇脱氢酶，将所得滤液浓缩，然后降温至5～10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到醋酸四烯物。
本发明提供的方法涉及两种合成路线，一种是以化合物I(即9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮)为起始原料，经脱水消除反应、炔化反应、酯化反应、溴代加成反应、置换消除反应以及酶法脱氢反应制得化合物VIII(即醋酸四烯物)；另一种是以化合物I为起始原料，经脱水消除反应以及3位醚化保护反应后，再进行炔化反应、酯化反应、溴代加成反应、置换消除反应以及酶法脱氢反应制得化合物VIII，具体反应式如下所示。
Figure BDA0004144578240000131
其中，所述R为甲基或乙基。
本发明提供了一种甾醇脱氢酶，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将本发明的甾醇脱氢酶用于脱氢反应，具有脱氢效率高、产物纯度高的优点。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)基于脱水消除反应制备化合物II
向反应瓶中加入50g化合物I(即9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮)和100mL水，然后加入浓度为98wt％的浓硫酸40mL，10℃条件下搅拌反应12h至反应完全；将所得产物体系倒入1000mL水中进行水析，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物II 42.5g，摩尔收率为90.4％。
(2)基于醚化保护反应制备化合物III
向反应瓶中加入化合物II 42.5g、甲醇200mL和原甲酸三甲酯45mL，然后加入吡啶氢溴酸盐2g，40℃条件下搅拌反应6h至反应完全，再加入浓度为2wt％的对甲苯磺酸水溶液50mL，10℃条件下搅拌反应1h至中间态反应完全，向所得产物体系中加入浓度为5wt％的碳酸钠水溶液，调节体系pH值至7～8，之后浓缩除去溶剂，将剩余物降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物III42.5g，摩尔收率为95.3％。
(3)基于炔化反应制备化合物IV
向反应瓶中加入甲苯400mL和异丁醇钾16g，通入乙炔气体，然后加入化合物III42.5g，20℃条件下搅拌反应3h至反应完全，向所得产物体系中加入浓度为37wt％的盐酸42mL，40℃条件下搅拌反应10h至脱保护反应完成，向所得产物体系中加入浓度为30wt％的氢氧化钠水溶液，调节体系pH值至6～7，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物IV41g，摩尔收率为92.8％。
(4)基于酰化反应制备化合物V
向反应瓶中加入化合物IV41g和二氯甲烷400mL，然后加入吡啶20mL和乙酰氯20mL，25℃条件下搅拌反应4h至反应完全，向所得产物体系中加入水40mL淬灭，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物V46.2g，摩尔收率为99.2％。
(5)基于溴代加成反应制备化合物VI
向反应瓶中加入化合物V 46.2g、叔丁醇250mL和水50mL，然后加入N-溴代乙酰胺50g，10℃条件下搅拌反应6h至反应完全，向所得产物体系中加入浓度为10wt％的硫氢化钠水溶液100mL，20℃条件下搅拌反应1.5h至反应完全，向所得产物体系中加入水1000mL进行水析，然后降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VI 54.1g，摩尔收率为91.9％。
(6)基于置换消除反应制备化合物VII
向反应瓶中加入化合物VI 54.1g和二甲基甲酰胺400mL，然后加入乙酸2.5mL和乙酸钠15g，100℃条件下搅拌反应7h至反应完全，向所得产物体系中加水1000mL进行水析，然后降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VII(即醋酸三烯物)36.2g，摩尔收率为81.7％。
(7)基于酶法脱氢反应制备醋酸四烯物
向反应瓶中加入化合物VII 36.2g、异丙醇110mL、磷酸二氢钾1.0g、磷酸氢二钾0.1g和水250mL，然后加入甾醇脱氢酶27.5g，采用浓度为5wt％的磷酸二氢钾水溶液和浓度为5wt％的磷酸氢二钾水溶液调节体系的pH值为6.5，30℃条件下搅拌反应12h至反应完全，将所得产物体系过滤，向所得固体物料中加入甲醇370mL，在60℃条件下充分溶解可溶性物料，过滤除去甾醇脱氢酶，将所得滤液减压浓缩至体积约为75mL，降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到醋酸四烯物34.4g，摩尔收率为95.6％，总摩尔收率为56.8％，HPLC纯度＞99％；m.p.:171～172℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝10.0Hz,1H),6.74(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.24(dd,J＝10.0,1.8Hz,1H),6.03(m,1H),5.53(m,1H),5.00(d,J＝16.1Hz,1H),4.87(d,J＝16.0Hz,1H),2.70–2.49(m,2H),2.47–2.37(m,2H),2.19–2.03(m,7H),1.48(m,1H),1.39(s,3H),1.26–1.12(m,1H),0.88(s,3H)；ESI-MS(m/z)：367.19[M+H]+。
图1为本实施例制备得到的醋酸四烯物的HPLC图谱，具体数据如表1所示。
表1实施例1制备的醋酸四烯物的HPLC图谱中对应数据
Figure BDA0004144578240000151
Figure BDA0004144578240000161
实施例2
(1)基于脱水消除反应制备化合物II
向反应瓶中加入50g化合物I(即9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮)和250mL四氢呋喃，然后加入五氯化磷20g，-10℃条件下搅拌反应2h至反应完全，加入水20mL淬灭反应，浓缩除去溶剂，向所得剩余物中加水500mL进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得化合物II 43g，摩尔收率为91.5％。
(2)基于醚化保护反应制备化合物III
向反应瓶中加入化合物II 43g、乙醇200mL和原甲酸三乙酯45mL，然后加入吡啶盐酸盐2g，40℃条件下搅拌反应7h至反应完全，再加入浓度为2wt％的三氯乙酸水溶液50mL，5℃条件下搅拌反应1.5h至中间态反应完全，向所得产物体系中加入浓度为5wt％的碳酸钾水溶液，调节体系pH值至7～8，之后浓缩除去溶剂，将剩余物降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物III 42.8g，摩尔收率为90.7％。
(3)基于炔化反应制备化合物IV
向反应瓶中加入四氢呋喃400mL和叔丁醇钾16g，通入乙炔气体，然后加入化合物III 42.8g，10℃条件下搅拌反应4h至反应完全，再加入浓度为40wt％的硫酸45mL，20℃条件下搅拌反应2h至脱保护完成，向所得产物体系中加入浓度为30wt％的氢氧化钾水溶液，调节体系pH值至6～7，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得化合物IV41.2g，摩尔收率为96.9％。
(4)基于酰化反应制备化合物V
向反应瓶中加入化合物IV 41.2g和三氯甲烷400mL，然后加入三乙胺20mL和乙酰氯20mL，25℃条件下搅拌反应5h至反应完全，向所得产物体系中加入水40mL淬灭，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物V46.4g，摩尔收率为99.3％。
(5)基于溴代加成反应制备化合物VI
向反应瓶中加入化合物V 46.4g、异丁醇250mL和水50mL，然后加入N-溴代琥珀酰亚胺50g，10℃条件下搅拌反应6h至反应完全，向所得产物体系中加入亚磷酸三甲酯16mL，20℃条件下反应搅拌1h至反应完全，向所得产物体系中加入水1000mL进行水析，然后降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VI 54.7g，摩尔收率为92.5％。
(6)基于置换消除反应制备化合物VII
向反应瓶中加入化合物VI 55.2g和二甲基甲酰胺400mL，然后加入碳酸钾12g和乙酸9mL，120℃条件下搅拌反应5h至反应完全，向所得产物体系中加水1000mL进行水析，然后降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VII(即醋酸三烯物)36.7g，摩尔收率为81.1％。
(7)基于酶法脱氢反应制备醋酸四烯物
向反应瓶中加入化合物VII 36.7g、乙醇110mL、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.6g和水260mL，然后加入甾醇脱氢酶27.8g，采用浓度为5wt％的磷酸二氢钾水溶液和浓度为5wt％的磷酸氢二钾水溶液调节体系的pH值为6.8，25℃条件下搅拌反应15h至反应完全，将所得产物体系过滤，向所得固体物料中加入甲醇370mL，在60℃条件下充分溶解可溶性物料，过滤除去甾醇脱氢酶，将所得滤液减压浓缩至体积约为75mL，降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到醋酸四烯物34.9g，摩尔收率为95.6％，总摩尔收率为57.6％，HPLC纯度＞99％；m.p.:171～172℃；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝10.0Hz,1H),6.74(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.24(dd,J＝10.0,1.8Hz,1H),6.03(m,1H),5.53(m,1H),5.00(d,J＝16.1Hz,1H),4.87(d,J＝16.0Hz,1H),2.70–2.49(m,2H),2.47–2.37(m,2H),2.19–2.03(m,7H),1.48(m,1H),1.39(s,3H),1.26–1.12(m,1H),0.88(s,3H)；ESI-MS(m/z)：367.19[M+H]+。
实施例3
(1)基于脱水消除反应制备化合物II
向反应瓶中加入50g化合物I(即9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮)和250mL四氢呋喃，然后加入氯化亚砜20mL，-10℃条件下搅拌反应3h至反应完全，加入水20mL淬灭反应，浓缩除去溶剂，向所得剩余物中加水500mL进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物II43g，摩尔收率为91.5％。
(2)基于炔化反应制备化合物IV
向反应瓶中加入四氢呋喃400mL和氢氧化钾16g，通入乙炔气体，然后加入化合物II 43.0g，20℃条件下搅拌反应3h至反应完全，向所得产物体系中加入浓度为37wt％的盐酸，调节体系的pH值至6～7，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物IV40.2g，摩尔收率为85.6％。
(3)基于酰化反应制备化合物V
向反应瓶中加入化合物IV40.2g和甲苯400mL，然后加入二甲氨基吡啶20g和乙酸酐20mL，25℃条件下搅拌反应6h至反应完全，加入水40mL淬灭反应，之后浓缩除去溶剂，向剩余物中加入500mL水进行水析，然后降温至15℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物V45.2g，摩尔收率为99.1％。
(4)基于溴代加成反应制备化合物VI
向反应瓶中加入化合物V45.2g、异丁醇250mL、丙酮250mL和水50mL，然后加入二溴二甲基己内酰脲50g，10℃条件下搅拌反应8h至反应完全，然后加入浓度为10wt％的亚硫酸钠水溶液170mL，20℃条件下搅拌反应1h至反应完全，将所得产物体系进行浓缩除去丙酮，然后向剩余物中加水1000mL进行水析，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VI 52.9g，摩尔收率为91.8％。
(5)基于置换消除反应制备化合物VII
向反应瓶中加入化合物VI 53.4g和二甲基乙酰胺400mL，然后加入三氯乙酸2.5g和乙酸钾15g，110℃条件下搅拌反应6h至反应完全，向所得产物体系中加水1000mL进行水析，之后降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到化合物VII(即醋酸三烯物)35.8g，摩尔收率为81.8％。
(6)基于酶法脱氢反应制备醋酸四烯物
向反应瓶中加入化合物VII 35.8g、甲醇110mL、磷酸氢二钠0.9g、磷酸二氢钠0.1g和水260mL，然后加入甾醇脱氢酶26.9g，采用浓度为5wt％的磷酸二氢钾水溶液和浓度为5wt％的磷酸氢二钾水溶液调节体系的pH值为7.3，25℃条件下搅拌反应16h至反应完全，将所得产物体系过滤，向所得固体物料中加入乙酸乙酯370mL，在60℃条件下充分溶解可溶性物料，过滤除去甾醇脱氢酶，将所得滤液减压浓缩至体积约为75mL，降温至10℃，过滤，将滤饼进行干燥，得到醋酸四烯物34.0g，摩尔收率为95.5％，总摩尔收率为56.1％，HPLC纯度＞99％；m.p.:171～172℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝10.0Hz,1H),6.74(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.24(dd,J＝10.0,1.8Hz,1H),6.03(m,1H),5.53(m,1H),5.00(d,J＝16.1Hz,1H),4.87(d,J＝16.0Hz,1H),2.70–2.49(m,2H),2.47–2.37(m,2H),2.19–2.03(m,7H),1.48(m,1H),1.39(s,3H),1.26–1.12(m,1H),0.88(s,3H)；ESI-MS(m/z)：367.19[M+H]+。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种醋酸四烯物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将化合物I、脱水剂与第一溶剂混合，进行脱水消除反应，得到化合物II；
(2-1)将所述化合物II、醚化试剂、催化剂与第二溶剂混合，进行醚化反应，将所得醚化产物体系与第一酸试剂混合，进行水解反应，得到化合物III；
将所述化合物III、第一碱试剂与第三溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第一炔化反应，将所得第一炔化产物体系与第二酸试剂混合，进行脱保护反应，得到化合物IV；
或者(2-2)将所述化合物II、第二碱试剂与第四溶剂混合，在乙炔存在条件下进行第二炔化反应，得到化合物IV；
(3)将所述化合物IV、酰化试剂、第三碱试剂与第五溶剂混合，进行酯化反应，得到化合物V；
(4)将所述化合物V、溴代试剂、水与第六溶剂混合，进行二溴代转化反应，将所得二溴代转化产物体系与还原剂混合，进行脱溴反应，得到化合物VI；
(5)将所述化合物VI、取代-碱试剂、第三酸试剂与第七溶剂混合，进行置换消除反应，得到化合物VII；所述取代-碱试剂为碳酸盐与乙酸复配物或乙酸盐；
(6)将所述化合物VII、磷酸盐、甾醇脱氢酶与第八溶剂混合，进行酶法脱氢反应，得到醋酸四烯物；所述甾醇脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述化合物I～化合物VII的结构式如式I～式VII所示：
Figure FDA0004144578190000011
Figure FDA0004144578190000021
所述式III中R为甲基或乙基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱水剂包括硫酸、氯磺酸、氯化亚砜或五氯化磷；所述脱水消除反应的温度为-20～50℃，时间为2～15h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醚化试剂包括原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯；所述催化剂包括吡啶对甲苯磺酸盐、吡啶盐酸盐或吡啶氢溴酸盐；醚化反应的温度为20～60℃，时间为5～7h；
所述第一酸试剂包括对甲苯磺酸水溶液、三氯乙酸水溶液或三氟乙酸水溶液；所述水解反应的温度为-10～20℃，时间为0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一碱试剂包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第一炔化反应的温度为-30～30℃，时间为2～4h；
第二酸试剂包括盐酸、硫酸、乙酸水溶液或磷酸水溶液；所述脱保护反应的温度为20～60℃，时间为2～15h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二碱试剂包括异丁醇钾、叔丁醇钾、异丁醇钠、叔丁醇钠、氢氧化钾或氢氧化钠；所述第二炔化反应的温度为-30～30℃，时间为2～4h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酰化试剂包括乙酸酐或乙酰氯；所述第三碱试剂包括吡啶、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和咪唑中的一种或多种；所述酯化反应的温度为0～60℃，时间为4～6h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溴代试剂包括二溴二甲基己内酰脲、N-溴代乙酰胺或N-溴代琥珀酰亚胺；所述二溴代转化反应的温度为0～40℃，时间为3～10h；
所述还原剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫氢化钠、硫化钠、亚磷酸三甲酯或亚磷酸二乙酯；所述脱溴反应的温度为0～60℃，时间为0.5～10h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第三酸试剂包括乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸；所述置换消除反应的温度为60～120℃，时间为5～10h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种；所述酶法脱氢反应的条件包括：pH值为6.0～8.0，温度为20～45℃，时间为12～24h。
10.一种甾醇脱氢酶，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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