CN116368214A - 高通量微孔阵列板及其制造方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于研究细胞的高通量微流体装置的微孔阵列板(MWAP)组件及其制造方法。MWAP组件包括顶板，所述顶板具有在框架内布置成阵列的多个大孔。MWAP组件还包括底板，所述底板能够操作成固定到框架的底部表面，所述底板具有多个微孔的阵列。MWAP组件包括在底板经由多个大孔和多个微孔阵列被固定到顶板时所形成的孔格栅。具有多个大孔和多个微孔阵列的孔格栅能够经由高通量实现细胞的可视化。

Description

高通量微孔阵列板及其制造方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年10月22日提交的序列号为63/104,105的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过援引并入本申请。

技术领域

本发明构思涉及细胞培养板及其制造方法，所述细胞培养板具有用于单细胞应用和多细胞应用的微孔的高密度的阵列。所述细胞培养板可以用于肿瘤和癌症药物的筛选。

背景技术

药物开发是耗时且极其昂贵的过程。肿瘤药物的高失效率可部分地归因于，在体外筛选的过程中，药物分子的选择性差。用于筛选肿瘤药物的常规装置具有较差的体外药物筛选灵敏度。

用于测试药物的传统的微孔装置被局限于单细胞应用和多细胞应用。除了其他的缺陷，这些传统的设备还存在低通量的问题。

因此，需要开发用于高通量药物和癌症筛选应用的装置和相关的技术，所述装置和相关的技术不存在上面所提及的缺陷，具有改善的体外药物筛选灵敏度，可适应于各种不同的应用要求，并且高效、经济、以及易于制造和利用。

发明内容

本发明构思提供了可操作为用于研究细胞的高通量微流体装置的多微孔阵列板(MWAP)组件、制造所述微流体装置的方法、以及使用MWAP组件的图像分析程序。

在本发明构思的一个方面，上面所提及的内容可以通过形成由顶板和底板所限定的MWAP组件来实现。顶板具有在由顶板所限定的框架内布置成阵列的多个大孔。所述阵列包括多个列和多个行。底板具有布置成阵列的多个微孔。底板可操作成被固定到顶板的框架的底部表面。MWAP组件包括当底板被固定到顶板时所形成的孔格栅。孔格栅经由多个大孔和多个微孔所限定，其中所述多个大孔中的每一个都将所述多个微孔中的一组微孔与所述多个微孔中的另一组微孔隔离开。底板和/或顶板可以是可操作成用作细胞培养板的微细加工的板。所述多个微孔形成各种形状和尺寸的微流体孔的高密度的阵列，所述形状和尺寸可操作成限制单细胞或多细胞。顶板和底板被连接或结合在一起，使得所述顶板和底板被永久地固定在一起(例如，通过将所述顶板和底板激光焊接在一起)、或者使彼此可选择性地分离(例如，通过利用摩擦配合接合和/或利用可重复使用的粘合剂来连接顶板和底板)。多个微孔相对于彼此形成，以提供不同程度的空间限制的不对称。在一些变型中，顶板可以是具有分隔部的无底的框架，所述无底的框架可以具有与标准九十六(96)孔板中的单个孔相同的尺寸。在一些变型中，底板可以由微细加工的光学透明片材所形成，并且所述底板包含对应于多个大孔中的一个或多个大孔的尺寸和形状的微孔的阵列。

本发明提供了不同的MWAP组件(例如，大阵列规格和小阵列规格)。在一些实例中，大阵列规格的MWAP组件(具有以8×12样式布置的九十六(96)组微孔的阵列)具有在尺寸上与用于细胞培养的工业标准九十六(96)孔板相同的尺寸。大阵列规格的MWAP组件的应用之一是用于高通量。在一些实施例中，小阵列规格的MWAP组件(具有以2×2样式布置的四(4)组大孔的阵列)具有与标准显微镜载玻片相同的尺寸。小阵列规格的MWAP组件被设计成用于低通量基础研究应用，以研究细胞。所述MWAP组件为各种体外诊断和筛选应用提供了测定方案，所述方案包括使用MWAP组件诱导肿瘤细胞休眠和产生固定尺寸的克隆球状体。

本发明构思的其它方面、优点、和实用性将部分地在下面的说明书中阐述，并且部分地将从说明书中显而易见，或者可以通过实践本发明构思而了解。

上述内容旨在是说明性的，而不意味着是一种限制。通过研究下面的说明书和包括说明书的部分的附图，可以做出本发明构思的许多特征和子组合，并且这些特征和子组合将是显而易见的。这些特征和子组合可以在不参考其他的特征和子组合的情况下使用。

附图说明

参考以下附图和数据图，将更全面地理解本说明书，这些附图和数据图作为本发明构思的各种实施例所呈现，并且不应被视为本发明构思的范围的完整的叙述，其中：

图1A是在组装大规格微孔测定板(MWAP)组件之前，根据本发明构思的实施例的大规格MWAP组件的顶板的底部透视图，其示出了延伸穿过顶板的九十六(96)个大孔；

图1B是在组装MWAP组件之前，根据本发明构思的实施例的大规格MWAP组件的底板的顶部透视图，其示出了在底板中的九十六(96)组微孔；

图1C是根据本发明构思的实施例的图1A的顶板的顶部透视图；

图1D是在组装大规格MWAP组件之前，根据本发明构思的实施例的图1A至图1C的顶板和底板的顶部透视图；

图1E是根据本发明构思的实施例的底板的单个微孔组的部分的顶部平面图；

图1F是在组装大规格MWAP组件以形成一部分孔格栅后，根据本发明构思的实施例的顶板的单个大孔、和底板的微孔的单个阵列的立式侧向横截面图；

图2A是在组装大规格MWAP组件以形成一部分孔格栅后，根据本发明构思的实施例的顶板的单个大孔、和底板的具有不同尺寸的微孔的单个阵列的顶部平面图；

图2B是根据本发明构思的实施例的顶部平面图，其示出了图2A的底板的微孔的单个阵列的放大的部分；

图2C是根据本发明构思的实施例的顶部平面图，其示出了图2B的底板的微孔的单个阵列的放大的部分；

图3A为根据本发明构思的实施例的底板的单个微孔的顶部透视图，所述底板的单个微孔形成为具有底部表面的正四棱台；

图3B是根据本发明构思的实施例的图3A的底板的单个微孔的顶部平面图；

图3C是根据本发明构思的实施例的图3A的底板的单个微孔的立式侧向横截面图；

图4A是根据本发明构思的实施例的底板的单个微孔的顶部透视图，所述底板的单个微孔形成为具有底部公共点的三棱锥；

图4B是根据本发明构思的实施例的图4A的底板的单个微孔的顶部平面图；

图4C是根据本发明构思的实施例的图4A的底板的单个微孔的立式侧向横截面图；

图5A是根据本发明构思的实施例的底板的单个微孔的顶部透视图，所述底板的单个微孔形成为具有竖直的侧壁表面的方形；

图5B是根据本发明构思的实施例的图5A的底板的单个微孔的顶部平面图；

图5C为根据本发明构思的实施例的图5A的底板的单个微孔的立式侧向横截面图；

图6A是在组装小规格MWAP组件之前，根据本发明构思的实施例的小规格MWAP组件的顶板的底部透视图，其示出了延伸穿过顶板的四(4)个大孔；

图6B是在组装小规格MWAP组件之前，根据本发明构思的实施例的底板和图6A的顶板的顶部透视图，其示出了四(4)组微孔；

图7是根据本发明构思的实施例的形成大规格MWAP组件或小规格MWAP组件的步骤的流程图；

图8A是根据本发明构思的实施例的大规格MWAP组件的顶部透视图，其中图1A至图1D的顶板和底板经由焊接工艺连接在一起；

图8B是根据本发明构思的实施例的小规格MWAP组件的顶部透视图，其中图6A至图6B的顶板和底板经由焊接工艺连接在一起；

图9A是根据本发明构思的实施例的底板的顶部视图，所述底板包括用于肿瘤单细胞的休眠测定(Dormancy Assay)的棱锥形的微孔；

图9B是根据本发明构思的实施例的荧光图像，其示出了用于图9A的肿瘤单细胞的休眠测定的底板中的单细胞；

图9C是结合图9A和图9B的情况下，根据本发明构思的实施例的底板的顶部视图，所述底板包括被困在棱锥形的微孔中的肿瘤单细胞；

图10A是根据本发明构思的实施例的包括正四棱台形的微孔的底板的顶部视图，所述微孔捕获有用于单细胞的克隆生成测定(Clonogenic Assay)的克隆单细胞；

图10B是根据本发明构思的实施例的包括正四棱台形的微孔的底板的顶部视图，所述微孔捕获有图10A的单细胞的克隆生成测定中的克隆细胞群；

图11A是根据本发明构思的实施例的包括棱锥形的微孔的底板的顶部透视图，所述微孔捕获有用于单细胞克隆生成测定的克隆单细胞；

图11B是根据本发明构思的实施例的包括棱锥形的微孔的底板的顶部透视图，所述微孔捕获有图11A的单细胞克隆生成测定中的克隆细胞群；

图12A是根据本发明构思的实施例的包括正四棱台形的微孔的底板的顶部视图，所述微孔捕获有用于球状体测定(Spheroid Assay)的乳癌细胞；

图12B是根据本发明构思的实施例的包括正四棱台形的微孔的底板的顶部视图，所述微孔困有图12A的球状体测定中的生长的乳癌细胞；

附图并不将本发明构思限制于本文所公开和描述的具体实施例中。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在清楚地说明本发明构思的某些实施例的原理上。

具体实施方式

下面的详细的描述参考了阐释本发明构思的各种实施例的附图。图示和描述旨在足够详细地描述本发明构思的各方面和实施例，以使本领域技术人员能够实践本发明构思。在不脱离本发明构思的范围的情况下，可以利用其他的部件，并且可以做出改变。因此，下面的描述不应被视为具有限制意义。本发明构思的范围仅由所附权利要求、以及享有这些权利要求的等同物的全部范围来限定。

I.术语

本文所使用的短语和术语是为了描述的目的，并且不应被视为限制。例如，使用单数术语(例如，“一个”)并不旨在作为物品的数量的限制。此外，在说明书中使用关系术语(例如，但不限于“顶”、“底”、“左”、“右”、“上”、“下”、“向下”、“向上”、和“侧”)，是为了清楚地具体参考附图，而不旨在限制本发明构思或所附权利要求的范围。

此外，由于本发明构思易受许多不同形式的实施例的影响，旨在将本公开视为本发明构思的原理的示例，而不旨在将本发明构思限制于所示和所述的具体实施例。本发明构思的任何一个特征可以单独地使用，或者与任何其他的特征相结合地使用。说明书中对术语“实施例(embodiment)”、“实施例(embodiments)”、和/或类似的术语的引用意味着所提及的一个和/或多个特征被包括在说明书的至少一个方面。除非如此说明和/或本领域技术人员从说明书中容易看出，说明书中对术语“实施例(embodiment)”、“实施例(embodiments)”、和/或类似的术语的单独引用不一定是指同一实施例，而且也不是相互排斥的。例如，在一个实施例中所描述的特征、结构、过程、步骤、动作、或诸如此类也可以包括在其他的实施例中，但不是必须包括。因此，本发明构思可以包括本文所描述的实施例的各种组合、和/或集成。此外，正如本文所述的本公开的所有方面，对其实践来说都不是必不可少的。同样地，本发明构思的其他的系统、方法、特征、和优点对于本领域技术人员来说，在附图和说明书的审查上将是显而易见的，或变得显而易见。所有这些额外的系统、方法、特征、和优点都旨在包括在本说明书中，处于本发明构思的范围内，并且被权利要求所涵盖。

任何程度的术语(例如但不限于在说明书和所附权利要求中使用的“基本上”)应当理解为包括精确的构造、或者类似但不精确的构造。例如，“基本上平面的表面”是指具有精确的平面的表面、或类似，但不精确的平面的表面。类似地，在说明书和所附权利要求中所使用的术语“大约”或“约”应当理解为包括所列举的值、或者是所列举的值的三倍或是所列举的值的三分之一的值。例如，“大约3mm”包括从1mm至9mm的所有值，以及“约50度”包括从16.6度至150度的所有值。例如，它们可以指小于或等于±5％(例如，小于或等于±2％、小于或等于±1％、小于或等于±0.5％、小于或等于±0.2％、小于或等于±0.1％、小于或等于±0.05％)。

术语“包括”、“包含”、和“具有”在本公开中可交换地使用。术语“包括”、“包含”、和“具有”意味着包括但不一定限于如此描述的事物。

最后，本文所使用的术语“或”、和“和/或”应当被解释为包含性的，或被解释为意指任意一个、或任意组合。因此，“A、B、或C”、或“A、B、和/或C”是指以下任意一项:“A”、“B”、或“C”；“A和B”；“A和C”；“B和C”；“A、B、和C”。只有当元件、功能、步骤、或动作的组合以某种方式固有地相互排斥时，才会出现此定义的例外。

II.总体结构

转到图1A至1F，根据本发明构思的一个实施例，示出了大规格微孔测定板(MWAP)组件。MWAP组件100通常由顶板102和底板104所限定。

顶板102包括完全延伸穿过顶板102的九十六(96)个大孔106。大孔106布置在大孔阵列108中，所述大孔阵列具有八(8)个行110和十二(12)个列112。顶板102也可以在顶板102的一侧上可选择地包括倒角。所述倒角可以用作对齐标记，以便于将具有相似的形状(例如，相应的倒角)的盖子组装到顶板102上，以封闭大孔106的一侧。

大孔106中的每一个均由具有周边上边缘118和周边下边缘116的周边侧壁114所限定。以这种方式，所述大孔基本上是无底的。

底板104包括九十六(96)个微孔组122，所述微孔组形成在底板104的一侧126上的基本上平面的表面124中。微孔组122中的每一组都包括微孔130的微孔阵列128，所述微孔具有各种形状和/或尺寸，其中微孔130通过平面的表面部分132彼此隔开。可以预见的是，在不脱离本发明构思的范围的情况下，微孔组122可以包括任意数量的微孔130，其中不同的微孔130具有不同的形状、尺寸、和/或样式。实际上，附图所示的微孔130的数量、尺寸、形状、和样式仅仅是出于理解本发明构思的说明性的目的。例如，关于微孔130的数量，不同的微孔组122可以包括3000至4000个微孔130。这样，底板104可以是微加工的，以包括多于300000个微孔130。如本文进一步所述，以这种方式，MWAP组件100有利地可操作成提供高通量。关于微孔130的尺寸和形状，各种微孔130的形状可以是例如但不限于：一个或多个立方体、一个或多个棱锥、一个或多个正四棱台、和/或类似的形状。这样，在不同的微孔组122中，不同的微孔130有利地可操作成为由MWAP组件100的使用者放置和贮存在MWAP组件中的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C提供不同程度的三维(3D)空间限制。以这种方式，微孔130有利地使MWAP组件100的使用者能够研究一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应于不同程度的3D空间限制。如本文所述，限制的细胞提供多种功能，所述功能包括根据细胞的限制的程度来分离细胞和诱导细胞休眠。在不对称的微孔(例如，不对称的棱锥形的微孔)中，空间限制的不对称有利于阻止细胞分裂。对于要分裂的细胞，需要对称的空间以分离成等同的部分。例如，在棱锥形的微孔中，如果细胞的表面接触棱锥形的微孔的所有侧面，由于棱锥的背侧-腹侧的不对称，细胞将难以分裂。由于大多数的肿瘤细胞处于持续的分裂状态，无法分裂会使肿瘤细胞进入细胞周期停滞(“休眠”的状态)。

底板104被固定在顶板102的储室140内。当底板104被固定到顶板102时，储室140包括周壁142，所述周壁从顶板102悬垂，并且围绕底板104。当顶板102与底板104对齐时，大孔106中的每一个都与微孔组122中的一组相对应，并且与之对齐，其中大孔106中的每一个的周边上边缘118都抵接周边抵接表面150，所述周边抵接表面围绕微孔组122中的每一组，并与平面的表面部分132共面地延伸。以这种方式，大孔106中的每一个的周边上边缘118和微孔组122中的每一个的周边抵接表面150都用作它们之间的界面。

当顶板102被固定到底板104时，大孔106中的每一个都将微孔组122中的一组与微孔组122中的另一组流体地隔离，并且形成经由大孔106、和微孔组122的微孔130所限定的孔网格或孔格栅156。如本文进一步所述，以这种方式，大孔106中的每一个都可操作成用作播种储室，从而将一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C导入到微孔组122中的选定的一组内，以及导入到选定的微孔组122中的选定的一组中的其中一个微孔130内。此外，大孔106中的每一个和相关联的一个微孔组122可操作成协作地隔离贮存在其中的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C。可以在MWAP组件100上改变各种环境条件(例如但不限于温度和/或湿度)。因此，在最接近于贮存在微孔组内的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的第一水平处，包含一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的微孔组122提供了第一隔离区，而在远离一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的第二水平处，大孔106中相关的一个提供了第二隔离区，其中第一隔离区在第二隔离区和所述一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C之间延伸。

如图所示，图1A和图1C分别示出了在组装到底板104(经由图1B示出)之前，MWAP组件100的顶板102的底部透视图和顶部透视图。图1D是在将顶板102固定到底板104以形成MWAP组件100之前，与底板104对齐的顶板102的顶部透视图。

图1E示出了底板104的微孔组122中的一组微孔中的一个微孔130的放大的顶部平面图。图1F示出了在组装MWAP组件100之后，顶板102的大孔106中的一个大孔的放大的横截面视图，该大孔被固定到底板104的微孔组122中的一组并与之流体地隔离。微孔130通过平面的表面部分132彼此隔开。在该微孔组122中的一组的示例中，微孔130被示出为具有一致的或相同的正四棱台的样式。所述正四棱台中的每一个都包括多个倾斜的侧壁表面160和平面的底部表面162，所述正四棱台中的每一个垂直于平面的表面部分132延伸。多个倾斜的侧壁表面160中的每一个都在平面的表面部分132中的一个和平面的底部表面162之间延伸，以部分地限定微孔130中的一个微孔的正四棱台中的一个。如前所述，微孔组122可以包括任意数量的微孔130。

转到图2A至图2C，经由不同的放大的程度，示出了在组装MWAP组件100之后，顶板102的大孔106中的另一个被固定到底板104的微孔组122中的另一组并与其流体地隔离。如前所述，在不脱离本发明构思的范围的情况下，不同的微孔130可以具有不同的形状、尺寸、和/或样式。关于不同的尺寸和/或不同的样式，图2A和图2B将微孔组122中的一组的微孔130示出为具有多个不同的样式和多个不同的形状。如图所示，微孔组122中的一组包括具有方形形状的中心区域202，和围绕中心区域202的三(3)个同心的区域204、206、和208。区域208是区域202、204、206、和208中最外面的一个，并且直接抵接周边抵接表面150。分隔表面222、224、226在区域202、204、206、208中的彼此不同的区域之间延伸。以这种方式，不同样式的区域202、204、206、208通过分隔表面222、224、226彼此隔开。

图2B是图2A的微孔130的放大的视图。图2B示出了不同样式的区域202、204、206、208。如图所示，在不同的区域202、204、206、208中的微孔130具有不同的、分别增大的尺寸。最大尺寸的微孔130在区域202、204、206、和208中最外面的一个区域(即：区域208)内，并通过分隔表面226与中等尺寸的微孔130隔开。所述中等尺寸的微孔130在区域206内，并且围绕区域204内的较小的微孔130。微孔130中的所述中等尺寸的微孔和所述较小的微孔通过分隔表面224彼此隔开。较小的微孔130围绕在区域202内的最小的微孔130，并且通过分隔表面222与最小的微孔130隔开。可以预见的是，在区域202、204、206、和208中的一个或多个区域内的不同的微孔130除了具有不同的尺寸之外，还可以具有不同的形状。

图2C是图2B的六(6)个微孔130的放大的视图。如图所示，在该示例中，微孔130被成形为棱锥。所述棱锥中的每一个都包括延伸到公共点262的多个倾斜的表面260。多个倾斜的侧壁表面160中的每一个都在平面的表面部分132中的一个、和公共点262之间延伸，以部分地限定在区域204中的微孔130中的一个微孔的棱锥中的一个。

可以预见的是，在区域202、204、206、和208中的同一区域内的微孔130可以具有一个或多个共同的特征(例如，具有相同的形状)，但是具有不同的深度和/或不同的宽度，从而允许使用者区分一个或多个不同的特征，并且确定一个或多个不同的特征如何影响一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C。例如，在特定的实施例中，区域202、204、206、和208中的每一个都包括形状为棱锥的微孔130，其中区域202、204、206、和208中的每一个区域中的微孔都具有不同的尺寸(例如，其中倾斜的侧壁表面160各自具有10μm、25μm、50μm、和100μm的长度)。

转到图3A，示出了MWAP组件100的微孔130中的一个的透视图，所述微孔具有正四棱台的形状(即：正四棱台形的微孔302)。正四棱台形的微孔302由四(4)个倾斜的侧壁表面360所限定，所述侧壁表面向平面的底部表面362倾斜地延伸，从而限定了微孔130中的一个微孔的具有宽度和深度的内部370。多个倾斜的侧壁表面360中的每一个都在平面的表面部分132中的一个和平面的底部表面362之间延伸，以部分地限定微孔130中的一个的正四棱台形的微孔302。图3B是图3A的正四棱台形的微孔302的顶部平面图，其示出了在平面的表面部分132和平面的底部表面362之间延伸的四(4)个倾斜的侧壁表面360中的每一个。图3C是垂直于平面的表面部分132延伸的图3B的正四棱台形的微孔302的横截面视图，其示出了四(4)个倾斜的侧壁表面360中的每一个和平面的底部表面362。如图3C所示，正四棱台形的微孔302相对于竖直的Y轴是对称的，而相对于水平的X轴是不对称的。以此方式，当单细胞(例如，肿瘤细胞132A、132B、132C中的一个)通过顶板102的大孔106中相应的一个沿着Y轴被放置到底板104的正四棱台形的微孔302中时，所述单细胞经由多个表面(例如，平面的底部表面362、和四(4)个倾斜的侧壁表面360中的一个或多个)受到3D空间限制。以这种方式，正四棱台形的微孔302有利地使得MWAP组件100的使用者能够研究一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应由正四棱台形的微孔302所提供的3D空间限制，其可能不同于一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C在一个或多个其他的微孔130中如何响应。

转到图4A，示出了MWAP组件100的微孔130中的一个的透视图，所述微孔具有棱锥的形状(即：棱锥形的微孔402)。棱锥形的微孔402由四(4)个倾斜的侧壁表面460所限定，所述侧壁表面延伸到公共底部点462，从而限定了微孔130中的一个的具有宽度和深度的内部470。多个倾斜的侧壁表面460中的每一个都在平面的表面部分132中的一个和公共底部点462之间延伸，以部分地限定微孔130中的一个的棱锥形的微孔402。图4B是图4A的棱锥形的微孔402的顶部平面图，其示出了在平面的表面部分132和公共底部点462之间延伸的四(4)个倾斜的侧壁表面460中的每一个。图4C是图4B的棱锥形的微孔402的横截面视图，其示出了四(4)个倾斜的侧壁表面460中的每一个和公共底部点462。如图4C所示，棱锥形的微孔402相对于竖直的Y轴是对称的，而相对于水平的X轴是不对称的。同样地，当单细胞(例如，肿瘤细胞132A、132B、132C中的一个)通过顶板102的大孔106中相应的一个沿着Y轴被放置到底板104的棱锥形的微孔402中时，所述单细胞经由多个表面(例如，四(4)个倾斜的侧壁表面460中的多个)受到3D空间限制。以这种方式，棱锥形的微孔402有利地使得MWAP组件100的使用者能够研究一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应由棱锥形的微孔402所提供的3D空间限制，其可能不同于一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C在一个或多个其他的微孔130中如何响应。

转到图5A，示出了MWAP组件100的微孔130中的一个的透视图，所述微孔具有方形的形状(即：方形的微孔502)。方形的微孔502由四(4)个竖直的侧壁表面560所限定，所述侧壁表面垂直于平面的底部表面562延伸，从而限定了微孔130中的一个的具有宽度和深度的内部570。多个竖直的侧壁表面560中的每一个都在平面的表面部分132中的一个和平面的底部表面562之间延伸，以部分限定微孔130中的一个的方形的微孔502。图5B是图5A的方形的微孔502的顶部平面图，其示出了在平面的表面部分132和平面的底部表面562之间延伸的四(4)个竖直的侧壁表面560中的每一个。图5C是垂直于平面的表面部分132延伸的图5B的方形微孔502的横截面视图，其示出了四(4)个竖直的侧壁表面560中的每一个和平面的底部表面562。如图5C所示，方形的微孔502相对于竖直的Y轴是对称的，而相对于水平的X轴是不对称的。当单细胞(例如，肿瘤细胞132A、132B、132C中的一个)通过顶板102的大孔106中相应的一个沿Y轴被放置到底板104的方形的微孔502中时，所述单细胞经受对称的限制，这不利于阻止细胞分裂。以这种方式，方形微孔502有利地使MWAP组件100的使用者能够研究和对比相对于一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C在一种或多种其他微孔130中如何响应，所述一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应于由方形的微孔502提供的对称限制。例如，方形的微孔502可以用于研究当微孔只能横向地保持一个细胞时(例如，保持在X-Z平面上)的限制。在这种情况下，细胞没有空间来横向地分裂，但可能会沿y轴向上分裂。方形的微孔502也可用于本文所述的克隆生成测定。

转到图6A至图6B，根据本发明构思的一个实施例，示出了小规格微孔测定板(MWAP)组件600。MWAP组件600通常由顶板602和底板604所限定。

顶板602包括完全延伸穿过顶板602的四(4)个大孔606。大孔606布置在大孔阵列608中，所述大孔阵列具有两(2)个行611、和两(2)个列612。大孔606中的每一个都由周边侧壁614所限定，其中周边侧壁614的周边下边缘616和周边上边缘618间隔开。周边侧壁614限定了完全延伸穿过顶板602的储室620，从而使得大孔606中的每个基本上都是无底的。

底板604包括四(4)个微孔组622，所述微孔组形成在底板604的一侧626上的基本上平面的表面624中。微孔组622中的每一组都包括微孔630的微孔阵列628，所述微孔具有各种形状和/或尺寸，其中微孔630通过平面的表面部分632彼此隔开。可以预见的是，在不脱离本发明构思的范围的情况下，微孔组622可以包括任意数量的微孔630，其中不同的微孔630具有不同的形状、尺寸、和/或样式。实际上，附图所示的微孔630的数量、尺寸、形状、和样式仅仅是出于理解本发明构思的说明性的目的。例如，关于微孔630的数量，不同的微孔组622可以包括3000至4000个微孔630。这样，底板604可以是微加工的，以包括多于300000个微孔630。如本文进一步所述，以这种方式，MWAP组件600有利地可操作成提供高通量。关于微孔630的尺寸和形状，各种微孔630的形状可以是例如但不限于：一个或多个立方体、一个或多个棱锥、一个或多个正四棱台、和/或类似的形状。这样，在不同的微孔组622中，不同的微孔630有利地可操作成为由MWAP组件600的使用者放置和贮存在MWAP组件中的一个或多个肿瘤细胞(例如，一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C)提供不同程度的三维(3D)空间限制。以这种方式，微孔630有利地使小规格MWAP组件600的使用者能够研究一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应不同程度的3D空间限制。如本文所述，通过限制细胞提供了多种功能，所述功能包括根据细胞的限制程度来分离细胞和诱导细胞休眠。不对称的限制(例如，不对称的棱锥形的微孔)有利于阻止细胞分裂。

底板604被固定在顶板602的储室640内。储室640包括周壁642，所述周壁从顶板602悬垂，并且在底板604被固定到顶板602时围绕底板604。当顶板602与底板604对齐时，大孔606中的每一个都与微孔组622中的一组相对应并与之对齐，其中大孔106中的每一个的周边上边缘618都抵接周边抵接表面650，所述周边抵接表面围绕微孔组622中的每一组，并与平面的表面部分132共面地延伸。以这种方式，大孔606中的每一个的周边上边缘618、和微孔组622中的每一组的周边抵接表面650都用作它们之间的界面。

当顶板602被固定到底板604时，大孔606中的每一个都将微孔组622中的一组与微孔组622中的另一组流体地隔离，并且形成经由大孔606、和微孔组622的微孔630所限定的孔网格或孔格栅656。如本文进一步所述，以这种方式，大孔606中的每一个都可操作成用作播种储室，从而将一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C导入到微孔组622中的选定的一组内，以及导入到微孔组622中的选定的一组中的其中一个微孔630内。此外，大孔606中的每一个和相关联的一个微孔组622可操作成协作地隔离贮存在其中的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C。可以在小规格MWAP组件600上改变各种环境条件(例如但不限于温度和/或湿度)。因此，在最接近于贮存在微孔组内的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的第一水平处，包含一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的微孔组622提供了第一隔离区，而在远离一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C的第二水平处，大孔606中相关的一个大孔提供了第二隔离区，其中第一隔离区在第二隔离区和所述一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C之间延伸。

如图所示，图6A示出了在组装到底板604之前，小规格MWAP组件600的顶板602的底部透视图。图6B是在将顶板602固定到底板604以形成小规格MWAP组件600之前，与底板604对齐的顶板602的顶部透视图。

微孔设计

如上所述，微孔130、630可以在底板104、604上改变形状和/或尺寸，以能够在同一大孔106、406中形成并能够研究各种尺寸的细胞。相对于MWAP组件100，如前文所描述的图1E、1F、2A、2B、2C、3A、3B、3C、4A、4B、4C、5A、5B、和5C同样适用于小规格MWAP组件600。实际上，可以预见的是，在不脱离本发明构思的范围的情况下，MWAP组件100和小规格MWAP组件600的特征(包括但不限于大孔106、606，和微孔130、630)可以是相同的。

在一些变型中，底板104、604可以具有方形的微孔130、630，所述微孔具有相同的横截面和固定的深度，以及具有竖直的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有方形的微孔130、630，所述微孔具有相同的横截面和固定的深度，以及具有倾斜的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有方形的微孔130、630，所述微孔具有变化的横截面和变化的深度，以及具有倾斜的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有方形的微孔130、630，所述微孔具有变化的横截面和变化的深度，以及具有竖直的侧壁。

在一些变型中，底板104、604可以具有三角形的微孔130、630，所述微孔具有相同的横截面和固定的深度，以及具有竖直的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有三角形的微孔130、630，所述微孔具有相同的横截面和固定的深度，以及具有倾斜的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有三角形的微孔130、630，所述微孔具有变化的横截面和变化的深度，以及具有竖直的侧壁。在一些变型中，底板104、604可以具有三角形的微孔130、630，所述微孔具有变化的横截面和变化的深度，以及具有倾斜的侧壁。

在一些变型中，顶板102、602和/或底板104、604可以使用不同硬度的聚合物或凝胶涂层。在一些变型中，顶板102、602和/或底板104、604可以涂覆有一种或多种化学物质，以改变顶板102、602和/或底板104、604的一种或多种性质(例如，硬度和/或粘附性)。

在一些变型中，微孔130、630中的每一个的横截面尺寸的范围可以为8μm至100μm。例如，微孔130、630中的每一个的方形横截面的边长可以为8μm至100μm。微孔130、630中的每一个的等边三角形横截面的边长可以为8μm至100μm。

在一些变型中，具有尺寸为8μm至25μm的横截面的小尺寸的微孔130、630可以用于单细胞应用。在一些变型中，具有尺寸为26μm至100μm的横截面的大尺寸的微孔130、630可以用于多细胞应用。

微孔130、630中的每一个的尺寸可以包括边长、边宽、和/或深度。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸都可以等于或大于8μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸都可以等于或大于10μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于15μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于20μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于25μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于30μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于40μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于50μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于60μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于70μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于80μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以等于或大于90μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于100μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于90μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于80μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于70μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于60μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于50μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于40μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于30μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于25μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于20μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于15μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的尺寸可以小于或等于10μm。在一些变型中，微孔130、630中的每一个的深度的范围可以是从8μm至100μm。微孔130、630中的每一个的深度都部分地由微孔130、630中的每一个的侧壁所限定。

MWAP组件的制造

制造工艺700包括使用黑色的环烯烃聚合物(COP)来形成顶板102、602。以这种方式，可以便于顶板102、602的激光焊接，并且由于减少了反射和荧光，可以经由黑色的COP获得无伪影的成像。在操作702处，使用黑色的COP，利用注射成型工艺来形成顶板102、602。注射成型是一种通过将熔融材料注入到模具中以生产塑料零件的制造工艺。例如，所述模具可以具有顶板102、602的样式(例如，包括大孔106、606和储室120、620)。将COP颗粒送入加热筒中，并注入到模腔中，COP在模腔中冷却下来以形成顶板102、602。

接下来，制造工艺700包括使用光学上透明的COP来形成底板104、604，其在观察底板104、604的微孔130、630中储存的一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C时提供光学上透明的窗口。以这种方式，底板104、604使得能够对MWAP组件100、600内的细胞进行检查或成像，并且能够对图像进行分析，以使细胞可视化。在操作704处，使用光学上透明的COP，利用热压成型(hot embossing)工艺形成底板104、604。所述热压成型工艺是一种通过在聚合物被加热至其玻璃化转变温度左右时将压模压入聚合物中来构建聚合物膜或片材的工艺。所述聚合物比压模结构的高度厚得多。浮凸部是聚合物的总厚度的扰动。热压成型比纳米压印光刻更不容易产生缺陷，并且不限于纳米结构或微结构。首先，用所需的微孔组122、622的印迹来创建硅母模。SU-8是常用的环氧基负性光刻胶。微孔组122、622中的每一组都包括微孔130、630(例如，3000至4000个微孔130)。硅SU-8母模使用光刻工艺(在硅晶圆上旋涂SU-8光刻胶，然后在光刻机中暴露于紫外光)生产。然后，洗去非交联的光刻胶。生产硅酮SU-8母模，所述硅酮SU-8母模具有在微孔组122、622中的每个微孔130、630的特征。接下来，通过在硅材料上浇注和剥离硅酮来生产硅酮的负压模。在最后的步骤中，通过热压成型工艺，将在硅酮压模上的特征转移或压印到COP平片材上制造底板104、604。在一些实施例中，COP片材可以具有从100μm到800μm的范围内的厚度。在一些实施例中，COP片材可以具有从100μm到400μm的范围内的厚度。在一些实施例中，COP片材的厚度可以是188μm。以这种方式，底板104、604是微细加工的。

接下来，在操作706中，制造工艺700包括将顶板102、602和底板104、604对齐。一旦对齐，顶板102、602和底板104、604由固定装置和真空装置所保持。例如，顶板102、602和底板104、604可以被对齐，以用于相对于大孔106、406精确定位微孔组122、622，然后在操作708中，在连接过程期间，经由真空装置在3D自动传送台系统上将顶板102、602和底板104、604保持在吸力下。

所述连接过程包括将顶板102、602和底板104、604连接或结合在一起，以形成MWAP组件100、600。如下文进一步讨论的，顶板102、602和底板104、604沿着微孔组122、622和大孔106、406的周边在顶板102、602和底板104、604之间的界面或接合处通过激光焊接工艺连接或结合在一起并且流体地密封。

激光焊接与其他的结合工艺(例如，胶粘)相比具有许多优势。激光焊接比胶粘更快，并且也可以用于自动加工和大规模的工艺。此外，通过胶所提供的结合通常具有低通量，并且由于所述胶与细胞的化学相互作用而存在潜在的复杂问题。本发明构思的激光焊接工艺是自动的并且更快，因此具有更高的通量。此外，本发明构思的激光焊接工艺更好地确保了不会形成泄漏，并且不需要化学品。与焊接相比，诸如经由摩擦配合的接合和/或胶粘的其它的附接工艺具有许多优点。例如，顶板102、602和底板104、604可以连接在一起，以形成MWAP组件100、600，使得顶板102、602可选择性地从底板104、604拆卸。例如，连接工艺可以利用摩擦配合的接合和/或可重复使用的粘合剂，以允许使用者选择性地将顶板102、602与底板104、604附接和拆卸。以这种方式，有利地为使用者提供了对微孔130、630内的细胞的直接访问，从而允许进一步的测试和/或检查。

转到图8A，示出了形成MWAP组件100的操作706。在激光焊接过程中，顶板102和底板104在包括传送台的3D自动传送台系统上对齐，并被保持在吸力下。接下来，经由操作708，来自激光源802的激光点聚焦在顶板102和底板104之间的第一界面上。使用对齐标记作为在底板104上的参考，所述传送台在激光源802被激活的情况下以固定的2D图案移动，从而使得底板104以正方形图案沿着大孔106的每个周边被焊接、连接、和固定到顶板102上。以这种方式，顶板102和底板104彼此流体地密封，并且形成具有孔格栅156的MWAP组件100。

转向图8B，示出了形成小规格MWAP组件600的操作506。在激光焊接过程中，顶板602和底板604在包括传送台的3D自动传送台系统上对齐，并被保持在吸力下。接下来，经由操作508，来自激光源652的激光点聚焦在顶板602和底板604之间的第一界面上。使用对齐标记作为底板604上的参考，传送台在激光源652被激活的情况下以固定的2D图案移动，从而使得底板604以正方形图案沿着大孔606的每个周边被焊接到顶板602。接下来，来自激光源852的激光点聚焦在顶板602和底板604之间的第二界面上。使用对齐标记作为在底板604上的参考，传送台相对于激光点以另一个固定的2D图案移动，从而使得底板604以正方形图案沿着储室周边中的每一个进一步焊接到顶板602。以这种方式，顶板602和底板604彼此流体地密封，并且形成具有孔格栅656的MWAP组件600。

用于细胞的可视化的图像分析

本发明构思利用了荧光扫描电子显微镜(SEM)拍摄显微照片，以检测在微孔130、630中的每一个中的细胞。当微孔阵列128、628包括一个或多个荧光标记的肿瘤细胞时，图像通过SEM被采集。例如，图1E是具有十六(16)个微孔130的微孔阵列128的示例性的荧光图像。肿瘤细胞134A、134B是荧光标记的肿瘤细胞，它们已经被放置和储存在微孔阵列128内。SEM或其他的分析工具让使用者能够在各种药物下观察细胞生长和/或分裂。以这种方式，微孔130、630有利地使MWAP组件100、600的使用者能够研究一个或多个肿瘤细胞134A、134B、134C如何响应于不同程度的3D空间限制。

应用

药物开发是耗时且极其昂贵的过程。肿瘤药物的高失效率可部分地归因于体外筛选过程中药物分子的选择性差。MWAP组件100、600显著地提高了肿瘤药物的体外药物筛选的灵敏度。

MWAP组件100、600有助于药物筛选的应用，其中高通量和高容量是有益的(例如，当需要筛选大量药物分子库时)。具有3000至4000个微孔130的MWAP组件100被特别地设计成提供光学上透明的底板或窗口以能够实现高通量，并且与用于药物筛选测定的高容量平板成像器兼容。

MWAP组件100、600可操作成在空间上将单细胞或多细胞限制在微孔130、630中，所述微孔具有不同程度的在尺寸和对称性方面的空间限制。在尺寸和对称性方面的空间限制的程度可以随着微孔130、630的形状和尺寸而变化。微孔130、630可以产生空间限制，所述空间限制可以具有多种功能，所述功能可以针对特定的应用而变化。

当一个或多个微孔130、630足够小时，肿瘤单细胞或多细胞可以在空间上被限制在微孔130、630中，例如，通过接触微孔130、630的侧壁和底壁，微孔130、630的物理限制可以为所述细胞提供3D限制。

除空间限制之外，微孔130、630的限制空间的对称性对细胞分裂的能力也具有深远的影响。微孔130、630捕获单细胞，并且引入不同程度的对称性限制，这进而产生不同的结果。微孔130、630的对称性限制的范围可以从具有竖直壁的对称的(背侧-腹侧、和前侧-后侧)方形孔(立方体)至具有倾斜壁的不对称的三角形的孔(例如，棱锥)。

可以预见的是，肿瘤细胞可能需要对称的空间来分裂和生长。在一些实施例中，一个或多个微孔130、630是不对称的，从而防止肿瘤细胞的分裂和生长。例如，微孔130、630可以具有每条边的长度不同或相等的三角形或棱锥形的形状。

在一些实施例中，提供了细胞培养方案。

MWAP组件100、600被设计成用于但不限于三种癌症相关的应用，即：1)休眠测定(在不同对称度中的单细胞限制)；2)球状体测定(克隆球状体形细胞的标准化尺寸)；3)克隆生成测定。

休眠测定

休眠细胞是原发部位和/或转移的继发部位在治疗多年后癌症复发的原因。由于休眠细胞处于某些形式的细胞周期停滞(例如，闲置模式)，这些休眠细胞逃避了最初的治疗，鉴于休眠细胞没有分裂，因此其对分裂细胞的靶向化疗或放疗有抵抗力。配制针对休眠细胞的药物的挑战之一是缺乏体外或体内模型来测试药物。没有常规的技术能够在空间上诱导肿瘤细胞的休眠和测试药物。

MWAP组件100、600可操作成在空间上诱导肿瘤细胞的休眠并且测试药物(包括用作休眠检测的抗休眠药物)，所述MWAP组件包括具有各种形状和空间限制的微孔阵列128、628，并且可以诱导肿瘤单细胞的休眠。可以预见的是，经由本发明构思，使用细胞分裂的对称性作为检测也可以在肿瘤细胞中诱导不同程度的休眠。

可将多种抗休眠药物与肿瘤单细胞一起引入到顶板102、602的一个或多个大孔106、606中。然后，可以用底板104，604的各种形状和空间限制的微孔130，630中的不同微孔来测试所述多种抗休眠药物。以这种方式，MWAP组件100、600可以用于确定哪种药物在诱导肿瘤单细胞的休眠方面更有效。

可以预见的是，根据空间限制的程度，将单细胞限制在较小的微孔130、630中，可以起到包括隔离和诱导休眠的作用。可以预见的是，微孔130、630中的小尺寸的微孔(例如，横截面尺寸为8μm至25μm的微孔)可以用于单细胞限制或单细胞应用。

进行了单细胞休眠测定的实验，并且证明了在单细胞休眠测定中，单个肿瘤细胞不会在棱锥形的微孔中分裂。

图9A为根据本发明构思的实施例的底板908的顶部透视图，所述底板包括用于单细胞休眠测定的棱锥形的微孔906。如图9A所示，底板908包括经由分隔壁910彼此分开或隔离的多个棱锥形的微孔906，所述分隔壁在垂直于底板908的方向上延伸。微孔906包括宽度约为10μm的侧面914。

图9B为根据本发明构思的实施例的荧光图像，其示出了用于图9A的单细胞休眠测定的在底板908中的肿瘤单细胞。如图9B所示，亮点902A-E代表肿瘤单细胞。

图9C为根据本发明构思的实施例的底板908的顶部透视图，所述底板908包括捕集在棱锥形的微孔908中的肿瘤单细胞902A-E。图9C是图9A和图9B合并在一起的视图。如图9C所示，肿瘤单细胞902A-E被捕获在棱锥形的微孔906中(如箭头912所示)。肿瘤单细胞902A-E在置固(即：将肿瘤单细胞902A-E引入棱锥形的微孔908中)6天后没有分裂。值得注意的是，一般的倍增时间是36小时。本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明构思的范围的情况下，对于单细胞休眠测定，棱锥形的微孔908的形状和/或尺寸可以变化。

克隆生成测定

克隆生成测定通常用于量化肿瘤药物和放射疗法破坏肿瘤单细胞生长为克隆细胞群(例如，50个克隆细胞或更多)的效果。传统的孔板通常用于每个孔用单细胞来播种的测定。使用传统的孔板有几个缺点，包括传统的孔是有限的，并且不能让使用者测试和观察变化。例如，传统的孔在每个板上孔的数量有限。此外，重叠的克隆群计数起来也成问题。

MWAP组件100、600被设计成用作克隆生成测定。在克隆生成测定中，可以将肿瘤单细胞播种在足够大的方形的微孔中，以容纳大量的克隆细胞(例如，50个或更多的克隆细胞)。在微孔的粘附和非粘附的表面特性下，所述肿瘤细胞在药物处理前后，基于其形成克隆群/球状体的能力来量化。药物和放射疗法可能能够破坏肿瘤单细胞生长成克隆细胞的克隆群。可以将多种药物与肿瘤单细胞一起引入微孔130、630。然后，包括方形的微孔502、正四棱台形的微孔302、和棱锥形的微孔402的微孔130、630可以用于测试该多种药物，以观察哪种药物在破坏单细胞克隆细胞生长成克隆细胞的克隆群方面更有效。

在单细胞克隆生成测定中进行了实验，并且证明了在单细胞克隆生成测定中单克隆细胞至克隆细胞的克隆群的生长。

图10A是根据本发明构思的实施例的底板1008的顶部透视图，所述底板包括捕获有用于单细胞克隆测定的克隆单细胞的正四棱台形的微孔1006。如图10A所示，底板1008包括多个由分隔壁1010彼此分开或隔离的正四棱台形的微孔1006，所述分隔壁在垂直于底板1008的方向上延伸。正四棱台形的微孔1006之前作为正四棱台形的微孔302被讨论，并经由图3A至图3C示出。如图10A所示，克隆单细胞1002A-D被捕获在正四棱台形的微孔1006中。与微孔1006的尺寸相比，克隆单细胞1002A-D较小，使得存在供克隆单细胞1002A-D在微孔1006中生长的空间。

图10B是根据本发明构思的实施例的底板1008的顶部透视图，所述底板包括在单细胞克隆生成测定中捕获克隆细胞1002A-D的克隆群的正四棱台形的微孔1006。如图10B中所示，一个克隆细胞1002D生长成克隆细胞1002A-D的克隆群1004，从而扩展并填充由微孔1006所提供的空间。

图11A是根据本发明构思的实施例的底板1108的顶部透视图，所述底板包括在单细胞克隆生成测定中捕获克隆单细胞的棱锥形的微孔1106。如图11A所示，底板1108包括通过分隔壁1110彼此分开或隔离的多个棱锥形微孔1106，所述分隔壁在垂直于底板1108的方向上延伸。棱锥形的微孔1106之前作为棱锥形的微孔402进行了讨论，并经由图4A至图4C所示出。如图11A所示，克隆单细胞1102A-D被捕获在棱锥形微孔1106中。与微孔1106的尺寸相比，克隆单细胞1102A-D较小，使得存在供克隆单细胞1102A-D在微孔1106中生长的空间。

图11B是根据本发明构思的实施例的底板1108的顶部透视图，所述底板包括在单细胞克隆生成测定中捕获克隆细胞1102A-D的克隆群的棱锥形的微孔1106。如图11B所示，几个克隆细胞1102A-D生长成克隆细胞1102A-D的克隆群1104A-D，从而扩展并填充由微孔1106所提供的空间。本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明构思的范围的情况下，对于单细胞克隆生成测定，棱锥形微孔1106的形状和/或尺寸可以变化。

球状体测定

多细胞肿瘤球状体(MCTS)是用于基础研究和药物筛选应用的实体肿瘤的3D体外模型。尽管有一些常规的平台可供使用者尝试创建MCTS，但此类常规的平台是有限的，并且无法生成固定尺寸的克隆MCTS。实际上，没有一个常规的平台能够操作成产生固定尺寸或标准化的克隆MCTS。

MWAP组件100、600被设计为球状体测定，并且可操作成产生用于MCTS的标准尺寸，所述标准尺寸可以用于研究或药物筛选应用。可以预见的是，在微孔130、630中的多细胞限制可操作成用于将细胞诱导和限制成形成固定尺寸或标准尺寸的球状体。可以预见的是，横截面尺寸为26μm至300μm的较大尺寸的微孔130、630可以用于多细胞的限制或应用。

在球状体测定中进行了实验，并且证明了乳癌细胞的小克隆体在球状体测定的正四棱台形的微孔中生长，以填充正四棱台形的微孔中的空间，从而获得固定大小或标准大小的乳癌细胞。

图12A是根据本发明构思的实施例的底板1208的顶部透视图，所述底板包括用于球状体测定的捕获有乳癌细胞的正四棱台形的微孔1206。如图12A所示，底板1208包括通过分隔壁1210彼此分离或隔离的多个正四棱台形的微孔1206，所述分隔壁在垂直于底板1208的方向上延伸。正四棱台形的微孔1206之前作为正四棱台形的微孔302被讨论，并通过图3A至图3C示出。如图12A所示，多个乳癌细胞、或乳癌细胞1202A-D的小克隆体被捕获在正四棱台形的微孔1206中。与正四棱台形的微孔1206相比，小的克隆细胞2002A-D的尺寸较小，使得存在用于乳癌细胞1202A-D的小克隆体在微孔1206中生长的空间。此外，对于球状体测定，所有的正四棱台形的微孔1206具有相同的尺寸或固定的尺寸。

图12B为根据本发明构思的实施例的底板的顶部透视图，所述底板包括在图12A的球状体测定中捕获有生长的乳癌细胞的正四棱台形的微孔。如图12B所示，乳癌细胞的小克隆体1202A-D在3天后生长成乳癌细胞的更大的克隆体1204A-D。随着时间的推移，所述乳癌细胞的更大的克隆体可以继续生长，直到乳癌细胞的克隆体填充了正四棱台形的微孔1206中的空间，以形成固定尺寸的MCTS的克隆体，所述克隆体由正四棱台形的微孔1206所限定。本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本发明构思的范围的情况下，正四棱台形的微孔1206的形状和/或尺寸可以根据球状体测定而变化。

已经描述了几个实施例，本领域技术人员应当认识到，在不脱离本发明构思的精神的情况下，可以使用各种修改、替代性结构、和等价物。此外，为了避免不必要地模糊本发明构思，没有描述许多众所周知的过程和元件。因此，该描述不应被视为限制本发明构思的范围。

本领域技术人员应当理解的是，当前公开的实施例通过示例而非限制的方式进行教导。因此，本说明书中包含的或在附图中示出的内容应当被解释为说明性的，而非限制性的。下面的权利要求旨在涵盖本文描述的所有通用的和具体的特征，以及方法和组件的范围的所有陈述，就语言而言，可以说这些陈述落在它们之间。

Claims (28)

1.一种微孔阵列板(MWAP)组件，其特征在于，所述MWAP组件包括：

顶板，所述顶板具有布置成阵列的多个大孔；

底板，所述底板能够操作成被固定到所述顶板，所述底板具有多个微孔；和

孔格栅，所述孔格栅在所述底板被固定到所述顶板时形成，所述孔格栅经由所述多个大孔和所述多个微孔限定，其中所述多个大孔中的每一个大孔都将所述多个微孔中的一组微孔与所述多个微孔中的另一组微孔隔离。

2.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述多个微孔能够操作成提供不同程度的三维(3D)空间限制。

3.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，

所述多个大孔中的每一个大孔都包括由从所述顶板的底部表面延伸至所述顶板的顶部表面的周壁所包围的空腔，并且

所述多个大孔中的两个相邻的大孔共享所述周壁的一部分。

4.根据权利要求3所述的组件，其特征在于，

所述多个微孔中的至少一部分微孔包括一个或多个三角形微孔、具有底部表面的正四棱台、或者具有底部公共点的棱锥，以提供不对称的限制，并且

所述多个微孔中的每一个微孔都包括微孔周壁，所述微孔周壁的第一长度的上周边等于或长于第二长度的下周边。

5.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述隔离使得所述多个微孔中的所述一组微孔与所述多个微孔中的所述另一组微孔被流体地密封。

6.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述孔格栅在所述顶板的大孔的多个下周向周边抵接所述底板的所述多个微孔的多个上周向周边时形成。

7.根据权利要求6所述的组件，其特征在于，所述多个下周向周边中的每一个都围绕所述多个大孔中的一个大孔。

8.根据权利要求6所述的组件，其特征在于，所述多个上周向周边中的每一个都围绕不同组的所述多个微孔。

9.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述顶板和所述底板被永久地接合在一起。

10.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述多个微孔中的至少一部分微孔包括竖直的侧壁或倾斜的侧壁并且具有相同的深度。

11.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述多个微孔中的至少一部分微孔具有竖直的侧壁和在不同深度处的底部表面。

12.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述多个微孔中的每一个微孔都包括垂直于一基底延伸的竖直侧壁并具有底部表面、或者所述多个微孔中的每一个微孔都包括倾斜于所述基底延伸的倾斜侧壁并且没有底部表面。

13.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，

所述多个微孔中的每一个微孔都由垂直于底部表面延伸的多个侧壁所限定，并且

所述多个侧壁在所述多个微孔中的不同微孔中具有不同的深度，从而在所述多个微孔中的所述不同微孔中限定了不同的深度。

14.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述MWAP组件是单细胞MWAP组件，所述单细胞MWAP组件能够操作成在空间上诱导肿瘤细胞休眠以作为休眠测定。

15.根据权利要求14所述的组件，其特征在于，所述微孔的横截面尺寸的范围为从8μm至25μm。

16.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述MWAP组件能够操作成产生固定尺寸的克隆多细胞肿瘤球状体(MCTS)以作为球状体测定。

17.根据权利要求16所述的组件，其特征在于，所述微孔的横截面尺寸的范围为从26μm至300μm。

18.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，

所述MWAP组件能够操作成量化肿瘤药物和放射疗法的效果，以用多种药物中的至少一种来破坏肿瘤单细胞生长成克隆细胞的克隆群以作为克隆生成测定，

所述多个大孔中的每一个大孔都能够操作成利用所述多种药物中的所述至少一种播种所述肿瘤单细胞，并且

所述多个微孔包括96组微孔。

19.根据权利要求18所述的组件，其特征在于，所述多个微孔中的每一个微孔都是方形的微孔。

20.根据权利要求18所述的组件，其特征在于，所述多个微孔中的每一个微孔都被配置为保持50个或更多个克隆细胞。

21.根据权利要求1所述的组件，其特征在于，所述多个微孔包括2000至5000个微孔，使得所述MWAP组件能够操作成具有高通量。

22.一种制造微孔阵列板组件的方法，其特征在于，所述方法包括：

形成顶板，所述顶板具有在框架内布置成阵列的多个大孔；

形成具有多个微孔的阵列的底板，所述微孔的阵列能够操作成提供不同程度的三维(3D)空间限制；和

通过将所述底板固定到所述顶板上形成孔格栅，所述孔格栅经由所述多个大孔和所述多个微孔限定，其中所述多个大孔中的每一个大孔都将所述多个微孔的一组微孔与所述多个微孔的另一组微孔隔离。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

对齐所述顶板和所述底板。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述顶板经由注射成型工艺所形成。

25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述底板经由压模成型工艺所形成。

26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述底板使用光学上清晰或透明的生物相容性的环烯烃聚合物(COP)来形成，以能够观察至少所述多个微孔的内部。

27.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述顶板使用黑色的环烯烃聚合物(COP)来形成。

28.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述顶板和所述底板经由激光焊接工艺固定在一起，以形成微孔板。

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