JP2024500268A

JP2024500268A - 高スループットマイクロウェルアレイプレートおよび製造方法

Info

Publication number: JP2024500268A
Application number: JP2023519979A
Authority: JP
Inventors: バチュー，ロバート・エム．; デイヴ，ディガント・ピー．
Original assignee: ザボードオブリージェンツオブザユニヴァーシティーオブテキサスシステム
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2024-01-09
Also published as: WO2022087370A1; EP4232542A4; CN116368214A; EP4232542A1; US20230407223A1

Abstract

細胞を研究するための高スループットマイクロ流体デバイス用のマイクロウェルアレイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリおよびその製造方法が提供される。ＭＷＡＰアセンブリは、フレーム内にアレイ状に配置された複数のマクロウェルを有する上部プレートを含む。ＭＷＡＰアセンブリはまた、フレームの底面に固定されるように使用可能な底部プレートを含み、底部プレートはマイクロウェルの複数のアレイを有する。ＭＷＡＰアセンブリは、底部プレートが複数のマクロウェルおよび複数のアレイマイクロウェルを介して上部プレートに固定されるときに形成されるウェルグリッドを含む。複数のマクロウェルおよび複数のアレイマイクロウェルを有するウェルグリッドは、高スループットによる細胞の可視化を可能にする。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１０４，１０５号の利益を主張し、その内容全体が参照により組み込まれている。

１．分野
本発明の概念は、単一細胞用途および多細胞用途のためのマイクロウェルの高密度アレイを有する細胞培養プレート、およびその製造方法を対象とする。細胞培養プレートは、腫瘍および癌薬剤のスクリーニングに使用できる。

２．関連技術の考察
薬剤開発は、時間がかかり、非常に高価なプロセスである。腫瘍薬剤の高い失敗率は、部分的には、インビトロスクリーニング中の薬剤分子の選択性が低いことに起因する可能性がある。腫瘍薬剤をスクリーニングするための従来のデバイスは、インビトロでの薬剤スクリーニングの感度が低いという欠点がある。

薬剤を試験するための従来のマイクロウェルデバイスは、単細胞用途および多細胞用途に限定される。これらの従来のデバイスは、数ある欠点の中でも、スループットが低いという欠点がある。

したがって、前述の欠点を被らず、改善されたインビトロ薬剤スクリーニング感度を有し、さまざまな用途要件に対応するように適応可能であり、効率的で経済的で、製造と利用が簡単である高スループット薬剤および癌スクリーニング用途のための装置および関連技術を開発する必要がある。

本発明の概念は、細胞を研究するための高スループットマイクロ流体デバイスとして機能するように使用可能な複数のマイクロウェルアレイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリ、マイクロ流体デバイスを製造する方法、およびＭＷＡＰアセンブリを使用する画像分析手順を提供する。

前述のことは、本発明の概念の一態様において、上部プレートおよび底部プレートによって画定されるＭＷＡＰアセンブリを形成することによって達成することができる。上部プレートは、上部プレートによって画定されるフレーム内にアレイ状に配置された複数のマクロウェルを有する。アレイは、複数の列および複数の行を含む。底部プレートは、アレイ状に配置された複数のマイクロウェルを有する。底部プレートは、上部プレートのフレームの底面に固定されるよう使用可能である。ＭＷＡＰアセンブリには、底部プレートが上部プレートに固定されたときに形成されるウェルグリッドが含まれる。ウェルグリッドは、複数のマクロウェルのそれぞれが複数のマイクロウェルの別のセットから複数のマイクロウェルのセットを隔離した状態で、複数のマクロウェルおよび複数のマイクロウェルにより画定される。底部プレートおよび／または上部プレートは、細胞培養プレートとして使用できる微細加工プレートであってもよい。複数のマイクロウェルは、単一細胞または複数の細胞を閉じ込めるように使用可能なさまざまな形状およびサイズのマイクロ流体ウェルの高密度アレイを形成する。上部プレートと底部プレートは、プレートが恒久的に一緒に固定されるように接合または接着され、それは例えば、プレートを一緒にレーザ溶接するか、選択的に互いに取り外し可能にすることにより、例えば、摩擦嵌合係合および／または再利用可能な接着剤を使用してプレートを接合することにより行われる。複数のマイクロウェルは、互いに対して、さまざまな程度の空間閉じ込めの非対称性を提供するために形成される。いくつかの変形例では、上部プレートは、標準的な９６ウェルプレートの単一のウェルと同じサイズを有し得る分割されたセクションを備えた底のないフレームであってもよい。いくつかの変形例では、底部プレートは、微細加工された光学的に透明なシートから形成されてもよく、複数のマクロウェルのうちの１つまたは複数のサイズおよび形状に対応するマイクロウェルのアレイを含む。

本開示は、異なるＭＷＡＰアセンブリ、例えば、大型アレイフォーマットおよび小型アレイフォーマットを提供する。いくつかの実施形態では、８×１２パターンで配置された９６セットのマイクロウェルのアレイを備えた大型アレイフォーマットのＭＷＡＰアセンブリは、業界標準の細胞培養用９６ウェルプレートと寸法的に同じサイズである。大型アレイフォーマットでのＭＷＡＰアセンブリの用途の１つは、高スループットである。いくつかの実施形態では、２×２パターンで配置された４セットのマクロウェルのアレイを有する小型アレイフォーマットのＭＷＡＰアセンブリは、標準的な顕微鏡スライドと同じサイズを有する。小型アレイフォーマットのＭＷＡＰアセンブリは、細胞を研究するための低スループットの基礎研究用途向けに設計される。ＭＷＡＰアセンブリは、腫瘍細胞の休眠を誘導し、固定サイズのクローンスフェロイドを生成するためのＭＷＡＰアセンブリの使用を含む、さまざまなインビトロ診断およびスクリーニング用途用のアッセイプロトコルを提供する。

本発明の概念の追加の態様、利点、および有用性は、以下の説明で部分的に説明され、一部は、説明から明らかであるか、または本発明の概念を実践することによって習得することができる。

上記は、例示を意図したものであり、限定的な意味を意味するものではない。本発明の概念の多くの特徴およびサブコンビネーションが可能であり、以下の明細書およびその一部を含む添付図面を検討することにより、それらは容易に明らかになるであろう。これらの特徴およびサブコンビネーションは、他の特徴およびサブコンビネーションを参照せずに使用することができる。

説明は、以下の図およびデータグラフを参照してより完全に理解され、これらは本発明の概念のさまざまな実施形態として提示され、本発明の概念の範囲の完全な説明として解釈されるべきではない。

本発明の概念の実施形態による、大型フォーマットマイクロウェルアッセイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリの上部プレートの底面斜視図であり、大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリのアセンブリ前の上部プレートを通って延びる９６個のマクロウェルを示している。本発明の概念の実施形態による、ＭＷＡＰアセンブリの組み立て前の、底部プレート内の９６セットのマイクロウェルを示す大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの底部プレートの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、図１Ａの上部プレートの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの組み立て前の図１Ａ～図１Ｃの上部プレートおよび底部プレートの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、底部プレートの単一のマイクロウェルセットの一部の平面図である。本発明の概念の実施形態による、ウェルグリッドの一部を形成するために大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリを組み立てた後の、上部プレートの単一のマクロウェルおよび底部プレートのマイクロウェルの単一アレイの立面断面図である。本発明の概念の実施形態による、ウェルグリッドの一部を形成するために大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリを組み立てた後の、上部プレートの単一のマクロウェルおよび底部プレートのさまざまなサイズを有するマイクロウェルの単一アレイの平面図である。本発明の概念の実施形態による、図２Ａの底部プレートのマイクロウェルの単一アレイの拡大部分を示す平面図である。本発明の概念の実施形態による、図２Ｂの底部プレートのマイクロウェルの単一アレイの拡大部分を示す平面図である。本発明の概念の実施形態による、底面を有する四角錐として形成された底部プレートの単一のマイクロウェルの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、図３Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの平面図である。本発明の概念の実施形態による、図３Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの立面断面図である。本発明の概念の実施形態による、底部共通点を有する三角錐として形成された底部プレートの単一のマイクロウェルの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、図４Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの平面図である。本発明の概念の実施形態による、図４Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの立面断面図である。本発明の概念の実施形態による、直線側壁面を有する正方形として形成された底部プレートの単一のマイクロウェルの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、図５Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの平面図である。本発明の概念の実施形態による、図５Ａの底部プレートの単一のマイクロウェルの立面断面図である。本発明の概念の実施形態による、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの組み立て前の、上部プレートを通って延びる４つのマクロウェルを示す、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの上部プレートの底面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの組み立て前の、図６Ａの上部プレートおよび４セットのマイクロウェルを示す底部プレートの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリまたは小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリを形成するステップを示すフローチャートである。本発明の概念の実施形態による、図１Ａ～図１Ｄの上部プレートおよび底部プレートが溶接プロセスによって一緒に接合された大型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、図６Ａ～図６Ｂの上部プレートおよび底部プレートが溶接プロセスを介して一緒に接合された小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリの上面斜視図である。本発明の概念の実施形態による、単一の腫瘍細胞休眠アッセイのための角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、図９Ａの単一の腫瘍細胞休眠アッセイのための底部プレート内の単一細胞を示す蛍光画像である。本発明の概念の実施形態による、図９Ａと９Ｂを合わせた角錐マイクロウェルに捕捉された単一の腫瘍細胞を含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイのための単一クローン細胞が捕捉された四角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、図１０Ａの単一細胞クローン原性アッセイにおけるクローン細胞のコロニーが捕捉された四角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイのための単一クローン細胞が捕捉された角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、図１１Ａの単一細胞クローン原性アッセイにおけるクローン細胞のコロニーが捕捉された角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、スフェロイドアッセイのために乳癌細胞が捕捉された四角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。本発明の概念の実施形態による、図１２Ａのスフェロイドアッセイにおいて増殖した乳癌細胞が捕捉された四角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。

図面は、本発明の概念を、本明細書で開示および説明する特定の実施形態に限定するものではない。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに、本発明の概念の特定の実施形態の原理を明確に示すことに重点が置かれている。

以下の発明を実施するための形態は、本発明の概念のさまざまな実施形態を示す添付の図面を参照する。図および説明は、当業者が本発明の概念を実施できるように、本発明の概念の態様および実施形態を十分に詳細に説明することを意図している。本発明の概念の範囲から逸脱することなく、他の構成要素を利用することができ、変更を行うことができる。したがって、以下の説明は、限定的な意味で解釈されるべきではない。本発明の概念の範囲は、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。

Ｉ．用語
本明細書で使用される表現および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものと見なされるべきではない。例えば、「ある（ａ）」などの単数形の用語の使用は、アイテムの数を限定することを意図したものではない。また、以下に限定されないが、「上（ｔｏｐ）」、「下（ｂｏｔｔｏｍ）」、「左（ｌｅｆｔ）」、「右（ｒｉｇｈｔ）」、「上（ｕｐｐｅｒ）」、「下（ｌｏｗｅｒ）」、「下（ｄｏｗｎ）」、「上（ｕｐ）」および「横（ｓｉｄｅ）」などの関係用語の使用は、図面を特に参照して明確にするために説明で使用され、本発明の概念または添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。

さらに、本発明の概念は、多くの異なる形態の実施形態に影響を受けやすいので、本開示は、本発明の概念の原理の例として考えられることが意図されており、本発明の概念を示され、説明される特定の実施形態に限定することは意図されていない。本発明の概念の特徴のいずれか１つは、別個に、または任意の他の特徴と組み合わせて使用することができる。説明における用語「実施形態」、「実施形態（複数）」などへの言及は、言及される特徴および／または特徴（複数）が、説明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。説明における用語「実施形態」、「実施形態（複数）」などへの別個の言及は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではなく、また、そのように述べられていない限り、および／または説明から当業者に容易に明らかであることを除いて、相互に排他的ではない。例えば、一実施形態で説明された特徴、構造、プロセス、ステップ、アクションなどは、他の実施形態にも含まれ得るが、必ずしも含まれるわけではない。したがって、本発明の概念は、本明細書に記載された実施形態のさまざまな組み合わせおよび／または統合を含むことができる。さらに、本明細書に記載される本開示のすべての態様は、その実施に必須ではない。同様に、本発明の概念の他のシステム、方法、特徴、および利点は、図面および説明を検討することにより、当業者には明らかになるか、または明らかになるであろう。そのような追加のシステム、方法、特徴、および利点はすべて、この説明に含まれ、本発明の概念の範囲内にあり、特許請求の範囲に含まれ得ることが意図される。

説明および添付の特許請求の範囲で使用される「実質的に」などであるがそれに限定されない任意の程度の用語は、正確な、または類似の、しかし正確ではない構成を含むと理解されるべきである。例えば、「実質的に平面の表面」は、正確な平面または類似の、しかし正確な平面ではない表面を有することを意味する。同様に、説明および添付の特許請求の範囲で使用される「約」または「およそ」という用語は、列挙された値、または列挙された値の３倍もしくは３分の１である値を含むと理解されるべきである。例えば、約３ｍｍには１ｍｍから９ｍｍまでのすべての値が含まれ、約５０度には１６．６度から１５０度までのすべての値が含まれる。例えば、それらは、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．２％以下、±０．１％以下、±０．０５％以下など、±５％以下を指し得る。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、本開示において交換可能に使用される。「含む」、「含む」、および「有する」という用語は、そのように記載されたものを含むことを意味するが、必ずしも限定されない。

最後に、用語「または」および「および／または」は、本明細書で使用される場合、包括的または任意の１つもしくは任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。したがって、「Ａ、ＢまたはＣ」または「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、次のいずれかを意味する。「Ａ」、「Ｂ」または「Ｃ」、「ＡとＢ」、「ＡとＣ」、「ＢとＣ」、「Ａ、ＢとＣ」。この定義の例外は、要素、機能、ステップ、または行為の組み合わせが何らかの形で本質的に相互に排他的である場合にのみ発生する。

ＩＩ．一般的なアーキテクチャ
図１Ａ～図１Ｆを参照すると、本発明の概念の一実施形態による大型フォーマットのマイクロウェルアッセイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリが示される。ＭＷＡＰアセンブリ１００は、一般に、上部プレート１０２および底部プレート１０４によって画定される。

上部プレート１０２は、上部プレート１０２を完全に貫通して延びる９６個のマクロウェル１０６を含む。マクロウェル１０６は、８行１１０および１２列１１２を有するマクロウェルアレイ１０８に配置される。上部プレート１０２はまた、上部プレート１０２の一方の側に面取りされた角を任意に含んでもよい。面取りされた角は、マクロウェル１０６の一方の側を閉じるために、例えば、対応する面取りされた角を有する同様の形状のカバーの上部プレート１０２への組み立てを容易にするための位置合わせマーカーとして機能することができる。

マクロウェル１０６のそれぞれは、上部周縁１１８および下部周縁１１６を有する周囲側壁１１４によって画定される。このように、マクロウェルは実質的に底なしである。

底部プレート１０４は、底部プレート１０４の一方の側１２６上に実質的に平面の表面１２４に形成された９６個のマイクロウェルセット１２２を含む。マイクロウェルセット１２２のそれぞれは、さまざまな形状および／またはサイズを有するマイクロウェル１３０のマイクロウェルアレイ１２８を含み、マイクロウェル１３０は、平面部分１３２によって互いに離間される。マイクロウェルセット１２２は、任意の数のマイクロウェル１３０を含むことができ、マイクロウェル１３０の異なるものは、異なる形状、サイズ、および／またはパターンであることが予想され、本発明の概念の範囲から逸脱することはない。実際、図によって示されるマイクロウェル１３０の数、サイズ、形状、およびパターンは、本発明の概念を理解するための例示目的のためだけのものである。例えば、マイクロウェル１３０の数に関して、マイクロウェルセット１２２の異なるものは、３０００から４０００個のマイクロウェル１３０を含み得る。したがって、底部プレート１０４は、３００，０００個を超えるマイクロウェル１３０を含むように微細加工され得る。このように、ＭＷＡＰアセンブリ１００は、本明細書でさらに説明するように、高スループットを提供するように有利に使用し得る。マイクロウェル１３０のサイズおよび形状に関して、マイクロウェル１３０のさまざまなものは、１つまたは複数の立方体、１つまたは複数の角錐、１つまたは複数の四角錐などであるがこれらに限定されない形状にすることができる。このように、マイクロウェルセット１２２の異なるものにおいて、マイクロウェル１３０の異なるものは、ＭＷＡＰアセンブリ１００のユーザによってその中に配置され保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃに対して三次元（３Ｄ）空間閉じ込めをさまざまな程度で提供するように有利に使用し得る。このように、マイクロウェル１３０は、ＭＷＡＰアセンブリ１００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃが３Ｄ空間閉じ込めのさまざまな程度にどのように応答するかを調べることを有利に可能にする。本明細書で論じるように、細胞を閉じ込めることは、細胞の閉じ込めの程度に応じて隔離し、休眠を誘導することを含むさまざまな機能を果たす。非対称マイクロウェル、例えば非対称角錐マイクロウェルにおける空間閉じ込めの非対称性は、細胞分裂を止めるのに有益である。細胞が分裂するには、均等に分離するために対称的な空間が必要である。例えば、角錐マイクロウェルでは、細胞の表面が角錐マイクロウェルのすべての側面に接触している場合、角錐の背側と腹側の非対称性により、細胞は分裂しにくくなる。ほとんどの腫瘍細胞は一定の分裂状態にあるため、分裂できないと、腫瘍細胞が細胞周期停止、つまり「休眠」状態になる可能性がある。

底部プレート１０４は、上部プレート１０２のレシーバ１４０内に固定される。レシーバ１４０は、底部プレート１０４が上部プレート１０２に固定されると、上部プレート１０２から垂下し、底部プレート１０４を取り囲む周囲壁１４２を含む。上部プレート１０２が底部プレート１０４と位置合わせされると、マクロウェル１０６のそれぞれは、マイクロウェルセット１２２のうちの１つに対応し、それと位置合わせし、マクロウェル１０６のそれぞれの上部周縁１１８が周囲当接面１５０に当接し、これは、マイクロウェルセット１２２のそれぞれを取り囲み、平面部分１３２まで同一平面上に延びる。このようにして、マクロウェル１０６のそれぞれの上部周縁１１８とマイクロウェルセット１２２のそれぞれの周囲当接面１５０は、それらの間の界面として機能する。

上部プレート１０２が底部プレート１０４に固定されると、マクロウェル１０６の各々は、マイクロウェルセット１２２の１つをマイクロウェルセット１２２の別の１つから流体的に隔離し、マイクロウェルセット１２２のマクロウェル１０６およびマイクロウェル１３０を介して画定されるウェルネットワークまたはウェルグリッド１５６が形成される。このようにして、本明細書でさらに説明されるように、マクロウェル１０６のそれぞれは、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを、マイクロウェルセット１２２のうちの選択された１つ、およびマイクロウェルセット１２２のうちの選択された１つのマイクロウェル１３０のうちの１つに誘導するための播種リザーバとして機能するように使用し得る。さらに、マクロウェル１０６のそれぞれおよびマイクロウェルセット１２２の関連するものは、そこに保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを協働して隔離するように使用し得る。温度および／または湿度などであるがこれらに限定されないさまざまな環境条件は、ＭＷＡＰアセンブリ１００全体で変化し得る。したがって、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを含むマイクロウェルセット１２２は、その中に保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃに最も近い第１のレベルで第１の隔離ゾーンを提供し、一方、マクロウェル１０６のうちの関連する１つは、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃからさらに離れた第２のレベルで第２の隔離ゾーンを提供し、第１の隔離ゾーンは、第２の隔離ゾーンと１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃとの間に延びる。

示されるように図１Ａおよび１Ｃは、それぞれ、底部プレート１０４に組み立てる前のＭＷＡＰアセンブリ１００の上部プレート１０２の底面および上面斜視図を示しており、これは図１Ｂによって示される。図１Ｄは、上部プレート１０２を底部プレート１０４に固定してＭＷＡＰアセンブリ１００を形成する前に、底部プレート１０４と位置合わせされた上部プレート１０２の上面斜視図である。

図１Ｅは、底部プレート１０４のマイクロウェルセット１２２のうちの１つのマイクロウェル１３０のうちの１つの拡大上面図を示す。図１Ｆは、ＭＷＡＰアセンブリ１００の組み立て後、底部プレート１０４のマイクロウェルセット１２２のうちの１つに固定され、流体隔離する上部プレート１０２のマクロウェル１０６のうちの１つの拡大断面図を示す。マイクロウェル１３０は、平面部分１３２によって互いに離間される。マイクロウェルセット１２２の１つのこの例では、マイクロウェル１３０は、四角錐の均一または同じパターンを有するものとして示される。四角錐のそれぞれは、複数の傾斜した側壁面１６０と、平面部分１３２に垂直に延びる平面底面１６２とを含む。複数の傾斜した側壁面１６０のそれぞれは、平面部分１３２のうちの１つと平面底面１６２との間に延びて、マイクロウェル１３０のうちの１つの四角錐のうちの１つを部分的に画定する。前述のように、マイクロウェルセット１２２は、任意の数のマイクロウェル１３０を含むことができる。

図２Ａ～図２Ｃを参照すると、上部プレート１０２のマクロウェル１０６の別の１つが、ＭＷＡＰアセンブリ１００の組み立て後に、底部プレート１０４のマイクロウェルセット１２２の別の１つに固定され、流体的に隔離し、さまざまな倍率で示される。前述のように、マイクロウェル１３０の異なるものは、本発明の概念の範囲から逸脱することなく、異なる形状、サイズ、および／またはパターンであってもよい。異なるサイズおよび／または異なるパターンに関しては、図２Ａおよび２Ｂは、マイクロウェルセット１２２のうちの１つのマイクロウェル１３０を、複数の異なるパターンおよび複数の異なる形状を有するものとして示している。図示のように、マイクロウェルセット１２２の１つは、正方形の形状を有する中央領域２０２と、中央領域２０２を取り囲む３つの同心領域２０４、２０６、および２０８とを含む。領域２０８は、領域２０２、２０４、２０６、および２０８のうちの最も外側の領域であり、周囲当接面１５０に直接隣接している。分割面２２２、２２４、２２６は、互いに異なる領域２０２、２０４、２０６、２０８の間に延びる。このようにして、領域２０２、２０４、２０６、２０８の異なるパターンは、分割面２２２、２２４、２２６によって互いに離間される。

図２Ｂは、図２Ａのマイクロウェル１３０の拡大図である。図２Ｂは、領域２０２、２０４、２０６、２０８の異なるパターンを示す。示されるように、領域２０２、２０４、２０６、２０８の異なる領域におけるマイクロウェル１３０は、さまざまな、それぞれ増加するサイズである。マイクロウェル１３０の最大サイズのものは、領域２０２、２０４、２０６、および２０８の最も外側の１つ、すなわち領域２０８内にあり、マイクロウェル１３０の中サイズのものから分割面２２６によって分離される。マイクロウェル１３０の中サイズのものは、領域２０６内にあり、領域２０４内のマイクロウェル１３０のより小さいものを取り囲む。マイクロウェル１３０の中サイズのものと小さいものは、分割面２２４によって互いに分離される。マイクロウェル１３０のより小さいものは、領域２０２内でマイクロウェル１３０の最も小さいものを取り囲み、分割面２２２によってマイクロウェル１３０のより小さいものから分離される。領域２０２、２０４、２０６、および２０８のうちの１つまたは複数内のマイクロウェル１３０の異なるものは、異なるサイズに加えて、異なる形状を有し得ることが予想される。

図２Ｃは、図２Ｂのマイクロウェル１３０の６つの拡大図である。示されるように、マイクロウェル１３０は、この例では、角錐として成形される。角錐のそれぞれは、複数の傾斜面２６０を含み、共通点２６２まで延びる。複数の傾斜した側壁面１６０のそれぞれは、平面部分１３２のうちの１つと共通点２６２との間に延びて、領域２０４内のマイクロウェル１３０のうちの１つの角錐のうちの１つを部分的に画定する。

領域２０２、２０４、２０６、および２０８のうちの同じ領域内のマイクロウェル１３０は、１つまたは複数の共通の特徴、例えば、同じ形状であるが異なる深さおよび／または異なる幅を有し得ることが予想される。これにより、ユーザは、１つまたは複数の異なる特徴を隔離し、１つまたは複数の異なる特徴が１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃにどのように影響するかを決定することができる。例えば、特定の実施形態では、領域２０２、２０４、２０６、および２０８のそれぞれは、角錐として成形されたマイクロウェル１３０を含み、異なるサイズの領域２０２、２０４、２０６、および２０８のそれぞれを備え、例えば、傾斜側壁面１６０は、それぞれ１０μｍ、２５μｍ、５０μｍ、および１００μｍの長さを有する。

図３Ａを参照すると、ＭＷＡＰアセンブリ１００のマイクロウェル１３０のうちの１つの斜視図が示され、それは四角錐、すなわち四角錐マイクロウェル３０２の形状を有する。四角錐マイクロウェル３０２は、平面底面３６２に対して斜めに延びる４つの傾斜した側壁面３６０によって画定され、それによって幅および深さを有するマイクロウェル１３０のうちの１つの内部３７０を画定する。複数の傾斜した側壁面３６０のそれぞれは、平面部分１３２のうちの１つと平面底面３６２との間に延びて、マイクロウェル１３０のうちの１つの四角錐マイクロウェル３０２を部分的に画定する。図３Ｂは、図３Ａの四角錐マイクロウェル３０２の平面図である。図３Ａは、平面部分１３２と平面底面３６２との間に延びる４つの傾斜した側壁面３６０のそれぞれを示す。図３Ｃは、図３Ｂの四角錐マイクロウェル３０２の断面図である。図３Ｂは、４つの傾斜した側壁面３６０のそれぞれと、平面部分１３２に垂直に延びる平面底面３６２とを示している。図３Ｃに示すように、四角錐マイクロウェル３０２は、垂直Ｙ軸に関して対称であり、水平Ｘ軸に関して非対称である。このように、単一の細胞、例えば、腫瘍細胞１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃのうちの１つが、底部プレート１０４の四角錐マイクロウェル３０２内に、Ｙ軸に沿って、上部プレート１０２のマクロウェル１０６のうちの対応する１つを通って配置されるとき、単一細胞は、複数の表面、例えば、平面底面３６２と、４つの傾斜した側壁面３６０のうちの1つまたは複数を介して３Ｄ空間閉じ込めを経験する。このように、四角錐マイクロウェル３０２は、ＭＷＡＰアセンブリ１００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃが、四角錐マイクロウェル３０２によって提供される３Ｄ空間閉じ込めにどのように応答するかを調べることを有利に可能にする。これは、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃがマイクロウェル１３０の１つまたは複数の他のものでどのように応答するかとは異なり得る。

図４Ａを参照すると、ＭＷＡＰアセンブリ１００のマイクロウェル１３０のうちの１つの斜視図が示され、それは角錐の形状、すなわち角錐マイクロウェル４０２を有する。角錐マイクロウェル４０２は、共通の底点４６２まで延びる４つの傾斜した側壁面４６０によって画定され、それによって幅と深さを有するマイクロウェル１３０のうちの１つの内部４７０を画定する。複数の傾斜した側壁面４６０のそれぞれは、平面部分１３２のうちの１つと共通の底点４６２との間に延びて、マイクロウェル１３０のうちの１つの角錐マイクロウェル４０２を部分的に画定する。図４Ｂは、図４Ａの角錐マイクロウェル４０２の平面図である。図４Ａは、平面部分１３２と共通の底点４６２との間に延びる４つの傾斜した側壁面４６０のそれぞれを示す。図４Ｃは、図４Ｂの角錐マイクロウェル４０２の断面図である。図４Ｂは、４つの傾斜した側壁面４６０のそれぞれと共通の底点４６２を示している。図４Ｃに示すように、角錐マイクロウェル４０２は、垂直Ｙ軸に関して対称であり、水平Ｘ軸に関して非対称である。再び、単一の細胞、例えば腫瘍細胞１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃのうちの１つが、上部プレート１０２のマクロウェル１０６のうちの対応する１つを通して、Ｙ軸に沿って底部プレート１０４の角錐マイクロウェル４０２に配置されるとき、単一細胞は、複数の表面、例えば複数の４つの角度付き側壁面４６０を介して３Ｄ空間閉じ込めを受ける。このように、角錐マイクロウェル４０２は、ＭＷＡＰアセンブリ１００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃが、角錐マイクロウェル４０２によって提供される３Ｄ空間閉じ込めにどのように応答するかを調べることを有利に可能にし、これは、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃがマイクロウェル１３０の１つまたは複数の他のものでどのように応答するかとは異なり得る。

図５Ａを参照すると、ＭＷＡＰアセンブリ１００のマイクロウェル１３０のうちの１つの斜視図が示され、それは正方形、すなわち正方形マイクロウェル５０２の形状を有する。正方形マイクロウェル５０２は、平面底面５６２に対して垂直に延びる４つの直線側壁面５６０によって画定され、それによって幅と深さを有するマイクロウェル１３０のうちの１つの内部５７０を画定する。複数の直線側壁面５６０のそれぞれは、平面部分１３２のうちの１つと平面底面５６２との間に延びて、マイクロウェル１３０のうちの１つの正方形マイクロウェル５０２を部分的に画定する。図５Ｂは、図５Ａの正方形マイクロウェル５０２の平面図である。図５Ａは、平面部分１３２と平面底面５６２との間に延びる４つの直線側壁面５６０のそれぞれを示す。図５Ｃは、図５Ｂの正方形マイクロウェル５０２の断面図である。図５Ｂは、４つの直線側壁面５６０のそれぞれと、平面部分１３２に垂直に延びる平面底面５６２とを示している。図５Ｃに示すように、正方形マイクロウェル５０２は、垂直Ｙ軸に関して対称であり、水平Ｘ軸に関して非対称である。単一細胞、例えば腫瘍細胞１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃのうちの１つが、上部プレート１０２のマクロウェル１０６のうちの対応する１つを通して、Ｙ軸に沿って底部プレート１０４の正方形マイクロウェル５０２に配置される場合、単一細胞は対称的な閉じ込めを経験するが、これは細胞分裂を止めるのに有益ではない。このように、正方形マイクロウェル５０２は、有利には、ＭＷＡＰアセンブリ１００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃが、正方形マイクロウェル５０２によって提供される対称閉じ込めにどのように応答するか、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃがマイクロウェル１３０の１つまたは複数の他のものでどのように応答するかを研究して対比することを可能にする。例えば、正方形マイクロウェル５０２は、マイクロウェルが横方向に、例えばＸＺ平面上に１つの細胞のみを保持できる場合、閉じ込めを調査するために使用され得る。この場合、細胞には横方向に分裂する空間がないが、ｙ軸に沿って分裂する可能性がある。正方形マイクロウェル５０２はまた、本明細書で説明されるクローン原性アッセイにも使用することができる。

図６Ａ～図６Ｂを参照すると、本発明の概念の一実施形態による小型フォーマットのマイクロウェルアッセイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリ６００が示される。ＭＷＡＰアセンブリ６００は、一般に、上部プレート６０２および底部プレート６０４によって画定される。

上部プレート６０２は、上部プレート６０２を完全に貫通する４つのマクロウェル６０６を含む。マクロウェル６０６は、２つの行６１１および２つの列６１２を有するマクロウェルアレイ６０８に配置される。マクロウェル６０６のそれぞれは、周囲側壁６１４の上部周縁６１８から離間した下部周縁６１６を有する周囲側壁６１４によって画定される。周囲側壁６１４は、上部プレート６０２を完全に貫通して延びるリザーバ６２０を画定し、それによってマクロウェル６０６の各々を実質的に底なしにする。

底部プレート６０４は、底部プレート６０４の一方の側６２６上に実質的に平坦な表面６２４に形成された４つのマイクロウェルセット６２２を含む。マイクロウェルセット６２２のそれぞれは、さまざまな形状および／またはサイズを有するマイクロウェル６３０のマイクロウェルアレイ６２８を含み、マイクロウェル６３０は、平面部分６３２によって互いに離間される。マイクロウェルセット６２２は、任意の数のマイクロウェル６３０を含むことができ、マイクロウェル６３０の異なるものは、異なる形状、サイズ、および／またはパターンであることが予想され、本発明の概念の範囲から逸脱することはない。実際、図によって示されるマイクロウェル６３０の数、サイズ、形状、およびパターンは、本発明の概念を理解するための例示目的のためだけのものである。例えば、マイクロウェル６３０の数に関して、マイクロウェルセット６２２の異なるものは、３０００から４０００個のマイクロウェル６３０を含み得る。したがって、底部プレート６０４は、３００，０００個を超えるマイクロウェル６３０を含むように微細加工され得る。このように、ＭＷＡＰアセンブリ６００は、本明細書で説明するように、高スループットを提供するように有利に使用し得る。マイクロウェル６３０のサイズおよび形状に関して、マイクロウェル６３０のさまざまなものは、１つまたは複数の立方体、１つまたは複数の角錐、１つまたは複数の四角錐などであるがこれらに限定されない形状にすることができる。したがって、マイクロウェルセット６２２の異なるものにおいて、マイクロウェル６３０の異なるものは、有利には、１つまたは複数の腫瘍細胞に対してさまざまな程度の三次元（３Ｄ）空間閉じ込めを提供するように使用可能であり、例えば、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃは、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００のユーザによってそこに配置および保存される。このように、マイクロウェル６３０は、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃがさまざまな程度の３Ｄ空間閉じ込めにどのように応答するかを調べることを有利に可能にする。本明細書で論じるように、細胞を閉じ込めることは、細胞の閉じ込めの程度に応じて隔離し、休眠を誘導することを含むさまざまな機能を果たす。非対称な閉じ込めは、非対称角錐マイクロウェルなどの細胞分裂を止めるのに役立つ。

底部プレート６０４は、上部プレート６０２のレシーバ６４０内に固定される。レシーバ６４０は、底部プレート６０４が上部プレート６０２に固定されたときに、上部プレート６０２から垂下し、底部プレート６０４を取り囲む周囲壁６４２を含む。上部プレート６０２が底部プレート６０４と位置合わせされると、マクロウェル６０６のそれぞれは、マイクロウェルセット６２２のうちの１つに対応し、位置合わせし、マクロウェル１０６のそれぞれの上部周縁６１８は、マイクロウェルセット６２２のそれぞれを取り囲み、平面部分１３２に対して同一平面上に延びる周囲当接面６５０に当接する。このようにして、マクロウェル６０６のそれぞれの上部周縁６１８と、マイクロウェルセット６２２のそれぞれの周囲当接面６５０とは、それらの間の界面として機能する。

上部プレート６０２が底部プレート６０４に固定されると、マクロウェル６０６の各々は、マイクロウェルセット６２２の１つをマイクロウェルセット６２２の別の１つから流体的に隔離し、マイクロウェルセット６２２のマクロウェル６０６およびマイクロウェル６３０を介して画定されるウェルネットワークまたはウェルグリッド６５６が形成される。このようにして、マクロウェル６０６のそれぞれは、播種リザーバとして機能するように使用可能であり、本明細書でさらに論じるように、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを、マイクロウェルセット６２２のうちの選択された１つ、およびマイクロウェルセット６２２のうちの選択された１つのマイクロウェル６３０のうちの１つに誘導する。さらに、マクロウェル６０６のそれぞれおよびマイクロウェルセット６２２の関連するものは、そこに保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを協働して隔離するように使用し得る。温度および／または湿度などであるがこれらに限定されないさまざまな環境条件は、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００全体にわたって変化し得る。したがって、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを含むマイクロウェルセット６２２は、その中に保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃに最も近い第１のレベルで第１の隔離ゾーンを提供し、一方、マクロウェル６０６のうちの関連する１つは、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃからさらに離れた第２のレベルで第２の隔離ゾーンを提供し、第１の隔離ゾーンは、第２の隔離ゾーンと１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃとの間に延びる。

示されるように、図６Ａは、底部プレート６０４に組み立てる前の小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００の上部プレート６０２の底面斜視図を示す。図６Ｂは、上部プレート６０２を底部プレート６０４に固定して小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００を形成する前に、底部プレート６０４と位置合わせされた上部プレート６０２の上面斜視図である。

［マイクロウェル設計］
論じたように、マイクロウェル１３０、６３０は、底部プレート１０４、６０４にわたって形状および／またはサイズが異なり、マクロウェル１０６、４０６のうちの同じものにおいてさまざまなサイズの細胞の形成および研究を可能にすることができる。図１Ｅ、１Ｆ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、ＭＷＡＰアセンブリ１００に関して、本明細書で前述したように、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００に同様に適用可能である。実際、ＭＷＡＰアセンブリ１００および小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００の特徴は、マクロウェル１０６、６０６およびマイクロウェル１３０、６３０を含むがこれらに限定されないが、本発明の概念の範囲から逸脱することなく同じであってもよい。

いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、同じ断面および一定の深さを有し、側壁が直線である正方形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、同じ断面および一定の深さを有し、側壁が傾斜した正方形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、さまざまな断面およびさまざまな深さを有し、側壁が傾斜した正方形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、さまざまな断面およびさまざまな深さを有し、側壁が直線である正方形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。

いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、同じ断面および一定の深さを有し、側壁が直線である三角形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、同じ断面および一定の深さを有し、側壁が傾斜した三角形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、さまざまな断面およびさまざまな深さを有し、側壁が直線である三角形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。いくつかの変形例では、底部プレート１０４、６０４は、さまざまな断面およびさまざまな深さを有し、側壁が傾斜した三角形の形状のマイクロウェル１３０、６３０を有し得る。

いくつかの変形例では、上部プレート１０２、６０２および／または底部プレート１０４、６０４は、さまざまな剛性のポリマーまたはゲルコーティングを使用することができる。いくつかの変形例では、上部プレート１０２、６０２および／または底部プレート１０４、６０４は、上部プレート１０２、６０２および／または底部プレート１０４、６０４の１つまたは複数の特性を変更するために、１つまたは複数の化学物質でコーティングすることができ、例えば、デュロタクティックおよび／またはアドヒアランスである。

いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの断面寸法は、８μｍから１００μｍの範囲であってもよい。例えば、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの正方形の断面は、８μｍから１００μｍまでの一辺の長さを有し得る。マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの正三角形の断面は、８μｍから１００μｍまでの辺の長さを有することができる。

いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のうち、断面寸法が８μｍから２５μｍの小さい寸法のものを、単一細胞用途に使用することができる。いくつかの変形例では、断面寸法が２６μｍから１００μｍであるマイクロウェル１３０、６３０の大きな寸法のものを、多細胞用途に使用することができる。

マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、側面の長さ、側面の幅、および／または深さを含み得る。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、８μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、１０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、１５μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、２０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、２５μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、３０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、４０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、５０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、６０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、７０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、８０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、９０μｍ以上であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、１００μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、９０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、８０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０のそれぞれの寸法は、７０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、６０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、５０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、４０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、３０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、２５μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、２０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、１５μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの寸法は、１０μｍ以下であってもよい。いくつかの変形例では、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの深さは、８μｍから１００μｍの範囲であってもよい。マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの深さは、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの側壁によって部分的に画定される。

［ＭＷＡＰアセンブリの製造］
製造プロセス７００は、黒色の環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）を使用して上部プレート１０２、６０２を形成することを含む。このようにして、上部プレート１０２、６０２のレーザ溶接を容易にすることができ、黒色ＣＯＰを介して反射および蛍光の減少によるアーティファクトのない撮像を得ることができる。動作７０２で、黒色ＣＯＰを使用して、上部プレート１０２、６０２が射出成形プロセスを使用して形成される。射出成形は、溶融材料を金型に射出することによってプラスチック部品を製造する製造プロセスである。例えば、金型は、マクロウェル１０６、６０６およびリザーバ１２０、６２０を含むなど、上部プレート１０２、６０２のパターンを有してもよい。ＣＯＰペレットは、加熱されたバレルに供給され、金型キャビティに射出され、そこでＣＯＰが冷却されて上部プレート１０２、６０２を形成する。

次に、製造プロセス７００は、光学的に透明なＣＯＰを使用して底部プレート１０４、６０４を形成することを含み、これは、底部プレート１０４、６０４のマイクロウェル１３０、６３０とともに保存された１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃを見るときに、光学的に透明なウィンドウを提供する。このように、底部プレート１０４、６０４は、ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００内の細胞の検査または撮像、および細胞を視覚化するための画像の分析を可能にする。動作７０４で、光学的に透明なＣＯＰを使用して、底部プレート１０４、６０４がホットエンボスプロセスを使用して形成される。ホットエンボスプロセスは、ポリマーをガラス転移温度付近まで加熱しながらスタンプをポリマーに押し付けることによって、ポリマーフィルムまたはシートを構造化するプロセスである。ポリマーは、スタンプ構造の高さよりもはるかに厚い。レリーフは、ポリマーの総厚さの摂動である。ホットエンボス加工は、ナノインプリントリソグラフィよりも欠陥が発生しにくく、ナノ構造やマイクロ構造に限定されない。最初に、所望のマイクロウェルセット１２２、６２２のインプリントを有するシリコンマスター金型が作成される。ＳＵ－８は、一般的に使用されるエポキシ系ネガ型フォトレジストである。マイクロウェルセット１２２、６２２の各セットは、マイクロウェル１３０、６３０、例えば３０００から４０００個のマイクロウェル１３０を含む。シリコンＳＵ－８マスター金型は、シリコンウエハー上にＳＵ－８フォトレジストをスピンコーティングし、マスクアライナでＵＶ光を照射するリソグラフィプロセスを使用して製造される。次に、架橋されていないフォトレジストが洗い流される。マイクロウェルセット１２２、６２２内の各マイクロウェル１３０、６３０の特徴を備えたシリコンＳＵ－８マスター金型が製造される。次に、シリコンマスターにシリコンを流し込んで剥がし、シリコンのネガスタンプを作製する。最終ステップでは、底部プレート１０４、６０４は、シリコンスタンプの特徴をホットエンボスプロセスによってＣＯＰのプレーンシートに転写またはインプリントすることによって製造される。いくつかの実施形態では、ＣＯＰシートは、１００μｍから８００μｍの範囲の厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＯＰシートは、１００μｍから４００μｍの範囲の厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＯＰシートは１８８μｍの厚さであり得る。このようにして、底部プレート１０４、６０４は微細加工される。

次に、製造プロセス７００は、動作７０６で、上部プレート１０２、６０２と底部プレート１０４、６０４とを位置合わせすることを含む。位置合わせしたら、上部プレート１０２、６０２および底部プレート１０４、６０４は固定具および真空によって保持される。例えば、上部プレート１０２、６０２および底部プレート１０４、６０４は、マクロウェル１０６、４０６に対してマイクロウェルセット１２２、６２２を正確に位置決めするために位置合わせすることができ、次に、動作７０８で、接合プロセス中に３Ｄ自動並進ステージシステム上で真空を介して吸引下に保持される。

接合プロセスは、上部プレート１０２、６０２および底部プレート１０４、６０４を一緒に接合または接着して、ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００を形成することを含む。上部プレート１０２、６０２および底部プレート１０４、６０４は、以下でさらに説明するようにマイクロウェルセット１２２、６２２およびマクロウェル１０６、４０６の周囲に沿った上部プレート１０２、６０２と底部プレート１０４、６０４との間の界面または接合部におけるレーザ溶接プロセスによって、一緒に接合または接着され、流動的にシールされる。

レーザ溶接は、接着などの他の接着プロセスよりも多くの利点を提供する。レーザ溶接は接着よりも高速で、自動プロセスや大規模プロセスにも使用できる。さらに、接着剤を介して提供される接着は、一般に低スループットで、細胞との化学的相互作用により複雑になる可能性がある。本発明の概念のレーザ溶接プロセスは、自動で高速であるため、スループットが高くなる。さらに、本発明の概念のレーザ溶接プロセスは、漏れが形成されず、化学薬品を必要としないことをより確実に保証する。摩擦嵌め係合および／または接着などの他の取り付けプロセスは、溶接よりも多くの利点を提供する。例えば、上部プレート１０２、６０２および底部プレート１０４、６０４は、上部プレート１０２、６０２が底部プレート１０４、６０４から選択的に取り外し可能であるように、一緒に接合されてＭＷＡＰアセンブリ１００、６００を形成することができる。例えば、接合プロセスは、ユーザが底部プレート１０４、６０４から上部プレート１０２、６０２を選択的に取り付けおよび取り外すことを可能にするために、摩擦嵌め係合および／または再利用可能な接着剤を利用し得る。このようにして、ユーザは有利には、マイクロウェル１３０、６３０内の細胞への直接アクセスを提供され、それによってさらなる試験および／または検査が可能になる。

図８Ａを参照すると、ＭＷＡＰアセンブリ１００を形成する動作７０６が示される。上部プレート１０２と底部プレート１０４は、レーザ溶接プロセス中、並進ステージを含む３Ｄ自動並進ステージシステム上で位置合わせされ、吸引下に保持される。次に、動作７０８を介して、レーザ源８０２からのレーザスポットが、上部プレート１０２と底部プレート１０４との間の第１の界面に集束される。底部プレート１０４上の基準として位置合わせマーカーを使用して、並進ステージは、レーザ源８０２をアクティブにして、固定された２Ｄパターンで移動し、これにより、底部プレート１０４は、マクロウェル１０６の各周縁に沿って正方形のパターンで上部プレート１０２に溶接され、接合され、固定される。このようにして、上部プレート１０２と底部プレート１０４は互いに流体シールされ、ウェルグリッド１５６を有するＭＷＡＰアセンブリ１００が形成される。

図８Ｂを参照すると、小型フォーマットＭＷＡＰアセンブリ６００を形成するための動作５０６が示される。上部プレート６０２と底部プレート６０４は、レーザ溶接プロセス中、並進ステージを含む３Ｄ自動並進ステージシステム上で位置合わせされ、吸引下に保持される。次に、動作５０８を介して、レーザ源６５２からのレーザスポットが、上部プレート６０２と底部プレート６０４との間の第１の界面に集束される。底部プレート６０４上の基準として位置合わせマーカーを使用して、並進ステージは固定された２Ｄパターンで移動し、レーザ源６５２がアクティブになり、これにより、底部プレート６０４は、マクロウェル６０６の各周縁に沿って正方形パターンで上部プレート６０２に溶接される。次に、レーザ源８５２からのレーザスポットは、上部プレート６０２と底部プレート６０４との間の第２の界面に集束される。底部プレート６０４上の基準として位置合わせマーカーを使用して、並進ステージは、レーザスポットに対して別の固定２Ｄパターンで移動し、これにより、底部プレート６０４は、四角形のパターンでリザーバ周縁のそれぞれに沿って上部プレート６０２にさらに溶接される。このようにして、上部プレート６０２と底部プレート６０４は互いに流体シールされ、ウェルグリッド６５６を有するＭＷＡＰアセンブリ６００が形成される。

［細胞の可視化のための画像解析］
本発明の概念は、蛍光走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を利用して顕微鏡写真を撮り、マイクロウェル１３０、６３０のそれぞれの細胞を検査する。マイクロウェルアレイ１２８、６２８が1つまたは複数の蛍光標識された腫瘍細胞を含む場合、ＳＥＭによって画像が撮影される。例えば、図１Ｅは、１６個のマイクロウェル１３０を有するマイクロウェルアレイ１２８の蛍光画像の例である。腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂは、蛍光標識された腫瘍細胞であり、マイクロウェルアレイ１２８内に配置され、保存される。ＳＥＭまたはその他の分析ツールを使用すると、ユーザは、さまざまな種類の薬剤の下での細胞の増殖および／または分裂を視覚化できる。このように、マイクロウェル１３０、６３０は、ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００のユーザが、１つまたは複数の腫瘍細胞１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃがさまざまな程度の３Ｄ空間閉じ込めにどのように応答するかを調べることを有利に可能にする。

［用途］
薬剤開発は、時間がかかり法外に費用のかかるプロセスである。腫瘍薬剤の高い失敗率は、部分的には、インビトロスクリーニング中の薬剤分子の選択性が低いことに起因する可能性がある。ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、腫瘍薬剤のインビトロ薬剤スクリーニング感度を著しく改善する。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、例えば薬剤分子の大きなライブラリーをスクリーニングする必要がある場合など、高スループットおよび高含有能力が有益な薬剤スクリーニング用途を容易にする。３０００から４０００のマイクロウェル１３０を備えたＭＷＡＰアセンブリ１００は、光学的に透明な底部プレートまたはウィンドウを提供し、高スループットを可能にし、薬剤スクリーニングアッセイ用のハイコンテントプレートイメージャーと互換性があるように特に設計される。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、サイズおよび対称性の空間的閉じ込めの程度がさまざまなマイクロウェル１３０、６３０内に単一細胞または複数の細胞を空間的に閉じ込めるように使用し得る。サイズおよび対称性における空間閉じ込めの程度は、マイクロウェル１３０、６３０の形状およびサイズによって異なり得る。マイクロウェル１３０、６３０は、特定の用途のために変化し得る複数の機能を有し得る空間的閉じ込めを作り出すことができる。

マイクロウェル１３０、６３０の１つまたは複数が十分に小さい場合、例えば、マイクロウェル１３０、６３０の側壁および底壁に触れることによって、単一の腫瘍細胞または多細胞細胞をマイクロウェル１３０、６３０内に空間的に閉じ込めることができ、マイクロウェル１３０、６３０の物理的閉じ込めは、細胞の３Ｄ閉じ込めを提供することができる。

空間的閉じ込めに加えて、マイクロウェル１３０、６３０の閉じ込め空間の対称性は、細胞の分裂能力に大きな影響を与える。マイクロウェル１３０、６３０は、細胞の単一の細胞を捕捉し、さまざまな程度の閉じ込め対称性を導入し、これによりさまざまな結果が得られる。マイクロウェル１３０、６３０の閉じ込め対称性は、直線壁を有する対称（背腹および前後）正方形ウェル（立方体）から、傾斜壁を有する非対称三角形ウェル（例えば角錐）までの範囲であり得る。

腫瘍細胞は、分裂および増殖するために対称空間を必要とし得ることが予想される。いくつかの実施形態では、マイクロウェル１３０、６３０のうちの１つまたは複数が非対称であり、それによって腫瘍細胞が分裂および増殖するのを防止する。例えば、マイクロウェル１３０、６３０は、各辺がさまざまな長さまたは等しい長さを有する三角形の形状または角錐形状を有してもよい。

いくつかの実施形態では、細胞培養プロトコルが提供される。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、癌に関連する３つの用途向けに設計されるが、これらに限定されない。つまり、１）休眠アッセイ（さまざまな程度の対称性における単一細胞の閉じ込め）、２）スフェロイドアッセイ（クローンスフェロイドの標準化されたサイズ）、および３）クローン原性アッセイである。

［休眠アッセイ］
休眠細胞は、一次部位および／または転移した二次部位での治療から数年後の癌の再発の原因である。これらの休眠細胞は、休眠細胞が細胞周期停止の何らかの形態、例えばアイドリングモードにあるため、初期治療を免れ、したがって、休眠細胞が分裂していない場合、分裂細胞を標的とする化学療法または放射線療法に耐性がある。休眠細胞を標的とする薬剤を処方する際の課題の１つは、薬剤を試験するためのインビトロまたはインビボモデルがないことである。腫瘍細胞の休眠を空間的に誘導し、薬剤を試験することができる従来の技術はない。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、腫瘍細胞の休眠を空間的に誘導し、抗休眠薬を含む薬剤を休眠アッセイとして試験するように使用可能であり、これは、さまざまな形状および空間的閉じ込めを有するマイクロウェルアレイ１２８、６２８を含み、単一の腫瘍細胞の休眠を誘導することができる。アッセイとしての細胞分裂の対称性の使用は、本発明の概念を介して、腫瘍細胞においてさまざまな程度の休眠を誘導する可能性があることも予想される。

上部プレート１０２、６０２のマクロウェル１０６、６０６のうちの１つまたは複数に、単一の腫瘍細胞とともに多数の抗休眠薬を導入することができる。次いで、さまざまな形状のマイクロウェル１３０、６３０の異なるもの、および底部プレート１０４、６０４の空間的閉じ込めを使用して、多数の抗休眠薬を試験することができる。このようにして、ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００を使用して、単一の腫瘍細胞の休眠を誘導するのにどの薬剤がより効果的であるかを決定することができる。

マイクロウェル１３０、６３０のより小さなものにおける単一細胞の閉じ込めは、空間的閉じ込めの程度に応じて、隔離および休眠の誘導を含む機能を果たし得ることが予想される。マイクロウェル１３０、６３０の小さい寸法のもの、例えば、断面寸法が８μｍから２５μｍのものは、単一細胞閉じ込めまたは単一細胞用途に使用できることが予想される。

単一細胞休眠アッセイで実験を行い、単一細胞休眠アッセイでは、単一の腫瘍細胞が角錐マイクロウェル内で分裂しないことを実証した。

図９Ａは、本発明の概念の実施形態による、単一細胞休眠アッセイのための角錐マイクロウェル９０６を含む底部プレート９０８の上面図である。図９Ａに示すように、底部プレート９０８は、底部プレート９０８に垂直な方向に延びる分割壁９１０によって互いに分離または隔離された多数の角錐マイクロウェル９０６を含む。マイクロウェル９０６は、約１０μｍの幅を有する側面９１４を含む。

図９Ｂは、本発明の概念の実施形態による、図９Ａの単一細胞休眠アッセイのための底部プレート９０８内の単一の腫瘍細胞を示す蛍光画像である。図９Ｂに示すように、輝点９０２Ａ～９０２Ｅは、単一の腫瘍細胞を表す。

図９Ｃは、本発明の概念の実施形態による、角錐マイクロウェル９０８内に捕捉された単一の腫瘍細胞９０２Ａ～９０２Ｅを含む底部プレート９０８の上面図である。図９Ｃは、図９Ａおよび図９Ｂを合成した図である。図９Ｃに示すように、単一の腫瘍細胞９０２Ａ～９０２Ｅが、矢印９１２によって示されるように、角錐マイクロウェル９０６内に捕捉される。単一の腫瘍細胞９０２Ａ～９０２Ｅは、被覆、すなわち、単一の腫瘍細胞９０２Ａ～９０２Ｅを角錐マイクロウェル９０８に導入した後６日後に分裂しなかった。注目すべきは、典型的な倍加時間は３６時間である。角錐マイクロウェル９０８の形状および／またはサイズは、本発明の概念の範囲から逸脱することなく、単一細胞休眠アッセイのために変化し得ることが当業者によって理解される。

［クローン原性アッセイ］
クローン原性アッセイは、腫瘍薬剤および放射線治療の効果を定量化するために一般的に使用され、クローン細胞、例えば５０以上のクローン細胞のコロニーへの単一の腫瘍細胞の増殖を妨害する。従来のウェルプレートは、各ウェルに単一細胞を播種することにより、伝統的にアッセイに使用される。従来のウェルプレートを使用することにはいくつかの欠点があり、従来のウェルには制限があり、ユーザが変動を試験および観察することができないことが含まれる。例えば、従来のウェルはプレート当たりのウェルの数が限られている。また、重複するコロニーは、カウントする際に問題になる。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、クローン原性アッセイとして使用するために設計される。クローン原性アッセイでは、多数のクローン細胞、例えば５０以上のクローン細胞を保持するのに十分な大きさの正方形マイクロウェルに単一の腫瘍細胞を播種することができる。腫瘍細胞は、マイクロウェルの接着性および非接着性表面特性の下で、薬剤治療の前後にコロニー／スフェロイドを形成する能力に基づいて定量化される。薬剤や放射線療法は、クローン細胞のコロニーへの単一の腫瘍細胞の増殖を妨害できる可能性がある。単一の腫瘍細胞とともに、多数の薬剤をマイクロウェル１３０、６３０に導入することができる。次に、正方形マイクロウェル５０２、四角錐マイクロウェル３０２、および角錐マイクロウェル４０２を含むマイクロウェル１３０、６３０は、クローン細胞のコロニーへの単一の腫瘍細胞の増殖を妨害するのにどの薬剤がより効果的であるかを調べるために、これらの多数の薬剤を試験するために使用できる。

単一細胞クローン原性アッセイで実験を行い、単一細胞クローン原性アッセイにおいてクローン細胞のコロニーへの単一クローン細胞の増殖を実証した。

図１０Ａは、本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイのために単一クローン細胞が捕捉された四角錐マイクロウェル１００６を含む底部プレート１００８の上面図である。図１０Ａに示されるように、底部プレート１００８は、底部プレート１００８に垂直な方向に延びる隔壁１０１０によって互いに分離または隔離された多数の四角錐マイクロウェル１００６を含む。四角錐マイクロウェル１００６は、前に四角錐マイクロウェル３０２として論じられ、図３Ａ－３Ｃに示される。図１０Ａに示すように、単一クローン細胞１００２Ａ～１００２Ｄが、四角錐マイクロウェル１００６に捕捉された。単一クローン細胞１００２Ａ～１００２Ｄは、単一クローン細胞１００２Ａ～１００２Ｄがマイクロウェル１００６内で増殖するための空間があるように、マイクロウェル１００６のサイズと比較して小さい。

図１０Ｂは、本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイにおけるクローン細胞１００２Ａ～１００２Ｄのコロニーが捕捉された四角錐マイクロウェル１００６を含む底部プレート１００８の上面図である。図１０Ｂに示すように、１つのクローン細胞１００２Ｄが増殖してクローン細胞１００２Ａ～１００２Ｄのコロニー１００４になり、それによって、マイクロウェル１００６によって提供される空間が拡大し、満たされた。

図１１Ａは、本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイのための単一クローン細胞が捕捉された角錐マイクロウェル１１０６を含む底部プレート１１０８の上面図である。図１１Ａに示されるように、底部プレート１１０８は、底部プレート１１０８に垂直な方向に延びる分割壁１１１０によって互いに分離または隔離された多数の角錐マイクロウェル１１０６を含む。角錐マイクロウェル１１０６は、角錐マイクロウェル４０２として前に論じられ、図４Ａ－４Ｃに示される。図１１Ａに示すように、単一のクローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄが角錐マイクロウェル１１０６に捕捉された。単一クローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄは、単一クローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄがマイクロウェル１１０６内で増殖するための空間があるように、マイクロウェル１１０６のサイズと比較して小さい。

図１１Ｂは、本発明の概念の実施形態による、単一細胞クローン原性アッセイにおけるクローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄのコロニーが捕捉された角錐マイクロウェル１１０６を含む底部プレート１１０８の上面図である。図１１Ｂに示されるように、いくつかのクローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄは、クローン細胞１１０２Ａ～１１０２Ｄのコロニー１１０４Ａ～１１０４Ｄに増殖し、それによって、マイクロウェル１１０６内の空間を拡張および満たした。角錐マイクロウェル１１０６の形状および／またはサイズは、本発明の概念の範囲から逸脱することなく、単一細胞クローン原性アッセイのために変化し得ることが当業者によって理解される。

［スフェロイドアッセイ］
多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）は、基礎研究および薬剤スクリーニング用途のための固形腫瘍の３Ｄインビトロモデルである。ユーザがＭＣＴＳの作成を試みるために利用できる従来のプラットフォームがいくつかあるが、そのような従来のプラットフォームは限定されており、固定サイズのクローンＭＣＴＳを生成することはできない。実際、従来のプラットフォームのいずれも、固定サイズまたは標準化されたクローンＭＣＴＳを生成するために動作できない。

ＭＷＡＰアセンブリ１００、６００は、スフェロイドアッセイとして設計され、研究または薬剤スクリーニング用途に使用できるＭＣＴＳの標準化されたサイズを生成するように使用し得る。マイクロウェル１３０、６３０内の多細胞閉じ込めは、細胞を誘導および制限して固定サイズまたは標準サイズのスフェロイドを形成するように機能するように使用可能であることが予想される。断面寸法が２６μｍから３００μｍであるマイクロウェル１３０、６３０のより大きなサイズのものは、多細胞閉じ込めまたは適用のために使用され得ることが予想される。

実験はスフェロイドアッセイで実施され、スフェロイドアッセイの四角錐マイクロウェルで乳癌細胞の小さなクローンの増殖が実証され、固定サイズまたは標準化されたサイズの乳癌細胞を得るために、四角錐マイクロウェルの空間を満たす。

図１２Ａは、本発明の概念の実施形態による、スフェロイドアッセイのために乳癌細胞が捕捉された四角錐マイクロウェル１２０６を含む底部プレート１２０８の上面図である。図１２Ａに示されるように、底部プレート１２０８は、底部プレート１２０８に垂直な方向に延びる分割壁１２１０によって互いに分離または隔離された多数の四角錐マイクロウェル１２０６を含む。四角錐マイクロウェル１２０６は、前に四角錐マイクロウェル３０２として論じられ、図３Ａ－３Ｃに示される。図１２Ａに示すように、複数の乳癌細胞または乳癌細胞１２０２Ａ～１２０２Ｄの小さなクローンは、四角錐マイクロウェル１２０６に捕捉された。小さなクローン細胞２００２Ａ～２００２Ｄは、マイクロウェル１２０６内で乳癌細胞１２０２Ａ～１２０２Ｄの小さなクローンが増殖するための空間が存在するように、四角錐マイクロウェル１２０６のサイズと比較して小さかった。また、すべての四角錐マイクロウェル１２０６は、スフェロイドアッセイのために同じサイズまたは固定サイズを有していた。

図１２Ｂは、本発明の概念の実施形態による、図１２Ａのスフェロイドアッセイにおいて増殖した乳癌細胞が捕捉された四角錐マイクロウェルを含む底部プレートの上面図である。図１２Ｂに示すように、乳癌細胞１２０２Ａ～１２０２Ｄの小さなクローンは、３日後に乳癌細胞１２０４Ａ～１２０４Ｄのより大きなクローンに増殖する。乳癌細胞のより大きなクローンは、乳癌細胞のクローンが四角錐マイクロウェル１２０６の空間を満たすまで、より多くの時間とともに増殖し続けることができ、四角錐マイクロウェル１２０６によって画定される固定サイズのＭＣＴＳのクローンを形成する。四角錐マイクロウェル１２０６の形状および／またはサイズは、本発明の概念の範囲から逸脱することなく、スフェロイドアッセイのために変更できることを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態を説明してきたが、当業者であれば、本発明の概念の趣旨から逸脱することなく、さまざまな修正、代替構造、および均等物を使用できることが理解されよう。さらに、本発明の概念を不必要に曖昧にすることを避けるために、多くの周知のプロセスおよび要素については説明していない。したがって、この説明は、本発明の概念の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

当業者は、現在開示される実施形態が限定ではなく例として教示していることを理解するであろう。したがって、この説明に含まれる、または添付の図面に示される事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載されたすべての一般的および特定の特徴、ならびに方法およびアセンブリの範囲のすべての記述をカバーすることを意図しており、言語の問題として、それらの間にあると言える。

Claims

アレイ状に配置された複数のマクロウェルを有する上部プレートと、
前記上部プレートに固定されるように使用可能であり、複数のマイクロウェルを有する、底部プレートと、
前記底部プレートが前記上部プレートに固定されたときに形成されるウェルグリッドであって、前記複数のマクロウェルのそれぞれが前記複数のマイクロウェルの１つのセットを前記複数のマイクロウェルの別のセットから隔離した状態で、前記複数のマクロウェルおよび前記複数のマイクロウェルにより画定される、ウェルグリッドと、
を含む、マイクロウェルアレイプレート（ＭＷＡＰ）アセンブリ。
前記複数のマイクロウェルは、さまざまな程度の三次元（３Ｄ）空間閉じ込めを提供するように使用可能である、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマクロウェルのそれぞれは、前記上部プレートの底面から前記上部プレートの上面まで延びる周壁によって取り囲まれたキャビティを含み、
前記複数のマクロウェルのうちの隣接する２つのマクロウェルは、前記周壁の一部を共有する、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルの少なくとも一部は、非対称な閉じ込めを提供するために、１つもしくは複数の三角形のマイクロウェル、底面を有する四角錐、または底部共通点を有する角錐を含み、
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、下部周囲の第２の長さ以上である第１の長さの上部周囲を有するマイクロウェル周囲壁を含む、請求項３に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記隔離した状態は、前記複数のマイクロウェルの前記１つのセットが、前記複数のマイクロウェルの前記別のセットから流体的にシールされている状態である、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記上部プレートの前記マクロウェルの複数の下部周縁が前記底部プレートの前記複数のマイクロウェルの複数の上部周縁に当接する場合に、前記ウェルグリッドが形成される、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数の下部周縁のそれぞれは、前記複数のマクロウェルの１つを取り囲む、請求項６に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数の上部周縁のそれぞれは、前記複数のマイクロウェルの異なるセットを取り囲む、請求項６に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記上部プレートと前記底部プレートとが恒久的に接着される、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルの少なくとも一部は、直線側壁または傾斜した側壁と同じ深さとを含む、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルの少なくとも一部は、さまざまな深さの底面を備えた直線側壁を有する、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、底面を有する基部に対して垂直に延びる直線側壁、または前記底面のない前記基部に対して斜めに延びる傾斜した側壁を含む、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、底面に対して垂直に延びる複数の側壁によって画定され、
前記複数の側壁は、前記複数のマイクロウェルの異なるものの間でさまざまな深さを有し、それによって、前記複数のマイクロウェルの前記異なるものの間でさまざまな深さを画定する、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記ＭＷＡＰアセンブリは、休眠アッセイとして腫瘍細胞の休眠を空間的に誘導するように使用可能な単細胞ＭＷＡＰアセンブリである、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記マイクロウェルは、８μｍから２５μｍの範囲の断面寸法を有する、請求項１４に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記ＭＷＡＰアセンブリは、スフェロイドアッセイとして固定サイズのクローン多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）を生成するように使用可能である、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記マイクロウェルは、２６μｍから３００μｍの範囲の断面寸法を有する、請求項１６に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記ＭＷＡＰアセンブリは、腫瘍薬剤および放射線療法の効果を定量化して、クローン原性アッセイとして、複数の薬剤のうちの少なくとも１つを用いて単一の腫瘍細胞のクローン細胞のコロニーへの増殖を妨害するように使用可能であり、
前記複数のマクロウェルのそれぞれは、前記複数の薬剤のうちの前記少なくとも１つを含む前記単一の腫瘍細胞を播種するように使用可能であり、
前記複数のマイクロウェルは、９６セットのマイクロウェルを含む、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、正方形マイクロウェルである、請求項１８に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、５０以上のクローン細胞を保持するように構成される、請求項１８に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
前記複数のマイクロウェルが２０００個から５０００個のマイクロウェルを含むため、前記ＭＷＡＰアセンブリが高スループットを有するように使用可能である、請求項１に記載のＭＷＡＰアセンブリ。
マイクロウェルアレイプレートアセンブリを製造する方法であって、
フレーム内にアレイ状に配置された複数のマクロウェルを有する上部プレートを形成することと、
さまざまな程度の三次元（３Ｄ）空間閉じ込めを提供するように使用可能なマイクロウェルの複数のアレイを有する底部プレートを形成することと、
前記底部プレートを前記上部プレートに固定することによりウェルグリッドを形成することであって、前記ウェルグリッドは、前記複数のマクロウェルのそれぞれが前記複数のマイクロウェルの１つのセットを前記複数のマイクロウェルの別のセットから隔離した状態で、前記複数のマクロウェルおよび前記複数のマイクロウェルにより画定される、前記ヴェルグリッドを形成することと、
を含む、方法。
前記上部プレートと前記底部プレートを位置合わせすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
前記上部プレートが射出成形プロセスによって形成される、請求項２２に記載の方法。
前記底部プレートは、エンボス加工によって形成される、請求項２２に記載の方法。
少なくとも前記複数のマイクロウェルの内部の検査を可能にするために、光学的に透明または透明な生体適合性環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）を使用して前記底部プレートが形成される、請求項２２に記載の方法。
前記上部プレートが、黒色環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）を使用して形成される、請求項２２に記載の方法。
前記上部プレートおよび前記底部プレートが一緒に固定されて、レーザ溶接プロセスによって前記マイクロウェルプレートを形成する、請求項２２に記載の方法。