CN116368137A - 用于治疗隐孢子虫病的化合物和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有式I的化合物：式(I)或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中变量是如本文所定义的。本发明进一步提供了包含此类化合物的药物组合物和使用此类化合物的方法，这些方法用于通过施用此类化合物来治疗、预防、抑制、改善或根除隐孢子虫病的病理和/或症状的方法。

Description

用于治疗隐孢子虫病的化合物和组合物

背景技术

技术领域

本发明涉及化合物，包含此类化合物的药物组合物，和使用此类化合物来治疗、预防、抑制、改善或根除隐孢子虫病的病理和/或症状的方法。

背景技术

全球每年约有650万五岁以下儿童死亡。腹泻病是儿童死亡的第二大原因，并且在低收入国家造成约76万例死亡(2013)。腹泻造成的儿童死亡中有近80％发生在南亚和撒哈拉以南非洲。腹泻是由多种病原体导致的，这些病原体包括病毒(轮状病毒、诺如病毒等)、细菌(志贺氏菌、ETEC、弧菌、弯曲杆菌等)和原生动物寄生虫(贾第虫、阿米巴虫、隐孢子虫等)。轮状病毒是腹泻病的主要原因，造成约450,000死亡，但已经获得安全且有效的疫苗。由导致腹泻的原生动物寄生虫隐孢子虫属物种造成的儿童死亡近来得到认知(Striepen，2013)。

顶复门寄生虫造成一系列重要的人类疾病，如分别由系统发育学相关的寄生虫疟原虫属物种、隐孢子虫属物种和刚地弓形虫引发的疟疾、隐孢子虫病和弓形虫病。隐孢子虫病影响全世界的人；它是一种肠道疾病，表现为水样腹泻。在人类中，该病主要由人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)和小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)这两个物种引起。在健康的成人中，隐孢子虫病通常是症状持续1-2周的自限性感染。反之，免疫受损的个体很容易受到隐孢子虫病感染并遭受慢性、长期且危及生命的腹泻。近期一项调查5岁以下儿童中腹泻的原因和影响的流行病学研究将隐孢子虫病确定为严重腹泻的第二常见病原体并与12-23月龄的幼儿死亡相关(Kotloff等人，2012)。已知隐孢子虫每年在儿童中造成近100,000例死亡。隐孢子虫感染也与长期的发育迟缓及认知缺陷相关(Kotloff等人，2012，Striepen，2013，Checkley等人，2015)。隐孢子虫病仍是被低估的全球健康问题，没有可用的疫苗且只有一种FDA批准的药物硝唑尼特(Alinia)(2003)。在有需要的患者群体(例如，6-18月龄的营养不良儿童和免疫受损的患者)中，护理标准是不理想且未经证实的(Checkley等人，2015)。因此，找到高效的抗隐孢子虫病药物的医疗需求未被满足。

了解隐孢子虫的分子生物学的重大进展来自小球隐孢子虫的基因组测序(Abrahamsen等人，2004)和人隐孢子虫的基因组测序(Xu等人，2004)。这两个近缘种的基因组相似(96％-97％同一性)，具有约4000个基因分布在8条染色体上。隐孢子虫属物种的基因组远远小于其他顶复门原生动物寄生虫(如恶性疟原虫)(Gardner等人，2002)，具有较少的内含子和较短的非编码区。虽然隐孢子虫显示出与其他顶复门寄生虫(如疟原虫)的遗传趋异，但许多可药化分子靶标和途径在顶复门原生动物中是保守的(Abrahamsen等人，2004，Xu等人，2004)。

发明内容

本发明提供了具有式I的化合物：

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中

P是0、1、2、或3；

Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、或Y⁶中的每一个独立地是C或N；

R¹、R²、R³或R⁴中的每一个独立地是氢或C_1-6烷基；

每个R⁵独立地选自由以下组成的组：氢、C_1-6烷基、氰基、-C(O)C_1-6烷基；卤代、卤代C_1-6烷基、和-S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶选自由以下组成的组：

a)氢，和

b)未经取代的或被独立地选自由以下组成的组的1-3个取代基取代的C_1-6烷基：

i)C_1-6烷氧基，

ii)卤代，

iii)硫代C_1-6烷基，

iv)未经取代的或被独立地选自由氧代和C_1-6烷基组成的组的1-3个取代基取代的C_4-6杂环烷基；

v)未经取代的或被1-3个C_1-6烷基取代基取代的C_5-6杂芳基；

vi)-C(O)R⁷，和

vii)-C(O)NR⁷R⁷，其中每个R⁷独立地是氢或C_1-6烷基；以及用于制备此类化合物的方法。

在第二方面，本发明涉及化合物以及化合物在制造通过调节隐孢子虫寄生虫的磷脂酰肌醇-4-OH激酶的活性来预防、治疗、抑制、改善、或根除隐孢子虫病的病理和/或症状的药物中的方法和用途。

除非另有指明，否则术语“化合物”是指具有式(I)或其子式的化合物、该化合物的盐、该化合物的水合物或溶剂化物、以及所有立体异构体(包括非对映异构体和对映异构体)、互变异构体和同位素标记的化合物(包括氘取代)。具有式I(或其子式)的化合物进一步包含该化合物的多晶型物。

具体实施方式

定义

出于解释本说明书的目的，将应用下面的定义，并且在适宜的情况下，以单数形式使用的术语还包括复数形式，并且反之亦然。

如本文所用的“酰基”是指-C(＝O)R_a基团，其中R_a是羰基碳上的氢或非氢取代基，形成不同的含羰基的基团，这些基团包括但不限于酸、酸卤化物、醛、酰胺、酯、和酮。

如本文所用的“烷氧基”是指-O-烷基基团，其中该烷基如本文所定义。如本文所用的C_X烷氧基和C_X-Y烷氧基描述烷氧基基团，其中X和Y表示烷基链中的碳原子数。C_1-10烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基和癸氧基。该烷氧基的烷基部分可以任选地被取代，并且取代基包括下文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“烷基”是指具有多达10个碳原子的完全饱和的支链或无支链的烃链。如本文所用的C_X烷基和C_X-Y烷基描述烷基基团，其中X和Y表示烷基链中的碳原子数。例如，C_1-10烷基是指如上文所定义的含有一至十个碳原子的烷基基团。C_1-10烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。烷基与另一个基团一起表示如芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基烷基、烷氧基烷基、烷基氨基，其中该烷基部分应具有对烷基所述的相同含义并且与该另一个基团键合。例如，(C_6-10)芳基(C_1-3)烷基包括苄基、苯基乙基、1-苯基乙基、3-苯基乙基、2-噻吩基甲基、2-吡啶基甲基等。

除非在本说明书中另有说明，否则烷基基团可以是未经取代的或被一个或多个取代基取代，只要这样的取代在化学上有意义。典型的取代基包括但不限于卤代、羟基、烷氧基、氰基、氨基、酰基、芳基、芳基烷基、和环烷基，或者这些基团之一的异型，并且它们中的每一个可以被对该特定基团而言适当的取代基取代。

如本文所用的“烯基”是指具有多达10个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。如本文所用的C_X烯基和C_X-Y烯基描述烯基基团，其中X和Y表示烯基链中的碳原子数。C_2-7烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、1-丙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基等。该烯基可以任选地被取代，并且取代基包括本文所述的对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“亚烷基”是指本文所定义的二价烷基基团。C_1-10亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚仲丁基、亚异丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正己基、3-甲基亚己基、2，2-二甲基亚戊基、2，3-二甲基亚戊基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基和亚正癸基。亚烷基基团可以任选地被取代，并且取代基包括本文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“炔基”是指具有多达10个碳原子和至少一个碳-碳三键的直链或支链烃链。如本文所用的C_X烯基和C_X-Y烯基描述炔基基团，其中X和Y表示炔基链中的碳原子数。例如，C_2-7炔基包括但不限于乙炔基、炔丙基、3-甲基-1-戊炔基、2-庚炔基等。炔基可以任选地被取代，并且取代基包括本文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“亚烷基”是指本文所定义的二价烷基基团。C_1-10亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚仲丁基、亚异丁基、亚叔丁基、亚正戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚正己基、3-甲基亚己基、2，2-二甲基亚戊基、2，3-二甲基亚戊基、亚正庚基、亚正辛基、亚正壬基和亚正癸基。亚烷基基团可以任选地被取代，并且取代基包括本文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“亚烯基”是指本文所定义的二价烯基基团。C_1-3亚烯基的实例包括但不限于乙烯-1，2-二基、丙烯-1，3-二基、和亚甲基-1，1-二基。亚烯基可以任选地被取代，并且取代基包括本文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“亚炔基”是指本文所定义的二价炔基基团。亚炔基的实例包括乙炔-1，2-二亚基、丙炔-1，3-二亚基等。亚炔基可以任选地被取代，并且取代基包括本文对烷基基团所述的那些基团。

如本文所用的“氨基”指基团-NH₂。当氨基被描述为“取代的”或“任选地被取代”时，该术语包括NR’R”，其中R’和R”各自独立地为H，或者为烷基、芳基、环烷基、芳基烷基、环烷基烷基基团或这些基团之一的异型，并且烷基、芳基、芳基烷基或环烷基烷基基团或这些基团之一的异型中的每一个任选地被本文所述的适于相应基团的取代基取代。

术语“氨基”还包括其中R′和R″连接在一起以形成3-8元环的形式，该3-8元环可以是饱和的、不饱和的或芳族的，并且含有1-3个独立地选自N、O和S的杂原子作为环成员，并且任选地被描述为适合于烷基的取代基取代，或者，如果NR′R″是芳族基团，则其任选地被描述为典型用于杂芳基的取代基取代。

除非另有说明，否则含有氨基部分的本发明的化合物可以包括其被保护的衍生物。适于氨基部分的保护基包括乙酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。

如本文所用的“烷基氨基”是指基团-NR_aR_b，其中R_a和R_b中的至少一个或两个均为如本文所述的烷基基团。C1-4烷基氨基基团包括-NHC_1-4烷基和-N(C_1-4烷基)₂；例如，-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NH(CH₂CH₃)、-N(CH₂CH₃)₂等。

如本文所用的“芳族”是指其中组成原子构成不饱和环系统的部分，其中在环系统中的所有原子均为sp2杂化，并且pi电子的总数等于4n+2。芳族环中的环原子可以仅为碳原子，或者其可以包含碳和非碳原子(参见杂芳基)。

如本文所用的“芳基”是指其中所有环原子均为碳原子的6-14元单环或多环芳族环组件。典型地，芳基是6元单环、10-12元双环或14元稠合三环芳族环系统。如本文所用的C_X芳基和C_X-Y芳基描述芳基基团，其中X和Y表示环系统中的碳原子数。C_6-14芳基包括但不限于苯基、联苯基、萘基、薁基和蒽基。

芳基可以是未经取代的，或者被1-5个(例如一个或两个或三个)取代基取代，这些取代基独立地选自由以下组成的组：羟基、巯基、氰基、硝基、C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、C_1-4烷氧基、硫代C_1-4烷基、C_1-4烯基氧基、C_1-4炔基氧基、卤素、C_1-4烷基羰基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、氨基、C_1-4烷基氨基、二-C_1-4烷基氨基、C_1-4烷基氨基羰基、二-C_1-4烷基氨基羰基、C_1-4烷基羰基氨基、C_1-4烷基羰基(C_1-4烷基)氨基、磺酰基、氨磺酰基、烷基氨磺酰基、C_1-4烷基氨基磺酰基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基，其中前述取代基中的每一个可以进一步被一个或多个独立地选自卤素、烷基、羟基或C_1-4烷氧基基团的取代基取代。

当“芳基”与另一个基团一起表示如“芳基烷基”、“芳基氧基烷基”、“芳基氧基羰基”、“芳基氧基-羰基烷基”时，芳基部分应当具有与上述“芳基”定义中所述相同的含义。

如本文所用的“芳基氧基”是指基团-O-芳基，其中芳基如本文所定义。

如本文所用的“双环”或“双环基”是指两个环的环组件，其中两个环稠合到一起、通过单键连接或者通过两个桥接原子连接。这些环可以是碳环基、杂环基或其混合物。

如本文所用的“桥接环”是指多环系统，其中两个环共有的两个环原子彼此不直接键合。该环系统中的一个或多个环还可以含有杂原子作为环原子。桥接环的非排他性实例包括降冰片基、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷基、金刚烷基等。

如本文所用的“氨基甲酰基”是指基团-C(O)NR_a-，其中R_a是H，或者是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、或芳基烷基基团或这些基团之一的异型，并且烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、芳基烷基或这些基团之一的异型中的每一个任选地被本文所述的适于相应基团的取代基取代。

如本文所用的“环烷基”意指包含3-20个碳原子的非芳族、饱和或部分不饱和的单环、双环、三环、稠合、桥接或螺多环烃环系统的基团。典型地使用C_X环烷基和C_X-Y环烷基，其中X和Y表示环组件中的碳原子数。例如，C_3-6环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2，5-环己二烯基等。

示例性单环环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基等。

示例性双环环烷基包括冰片基、降冰片基、吲哚基、六氢吲哚基、四氢萘基、十氢萘基、双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.1]庚烯基、6，6-二甲基双环[3.1.1]庚基、2，6，6-三甲基双环[3.1.1]庚基、双环[2.2.2]辛基。示例性三环环烷基基团包括例如金刚烷基。

环烷基可以是未经取代的，或者被一个、或两个、或三个、或更多个取代基取代，这些取代基独立地选自由以下组成的组：羟基、巯基、氰基、硝基、氧代、烷基亚氨基、C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、C_1-4烷氧基、C_1-4硫代烷基、C_1-4烯基氧基、C_1-4炔基氧基、卤素、C_1-4烷基羰基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、氨基、C_1-4烷基氨基、二-C_1-4烷基氨基、C_1-4烷基氨基羰基、二-C_1-4烷基氨基羰基、C_1-4烷基羰基氨基、C_1-4烷基羰基(C_1-4烷基)氨基、磺酰基、氨磺酰基、烷基氨磺酰基、C_1-4烷基氨基磺酰基，其中上述烃基团(例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基残基)中的每一个可以进一步被一个或多个残基取代，这些残基在每次出现时独立地选自卤素、羟基或C_1-4烷氧基基团。

如本文所用的“亚环烷基”是指包含如本文所定义的环烷基环组件的二价基团。

如本文所用的“环烷氧基”是指-O-环烷基，其中该环烷基是如本文所定义的。C3.12环烷氧基的代表性实例包括但不限于单环基团，如环丙氧基、环丁氧基、环戊基氧基、环戊烯基氧基、环己基氧基和环己烯基氧基等。示例性双环烃基团包括冰片基氧基、吲哚基氧基、六氢吲哚基氧基、四氢萘基氧基、十氢萘基氧基、双环[2.1.1]己氧基、双环[2.2.1]庚氧基、双环[2.2.1]庚烯基氧基、6，6-二甲基双环[3.1.1]庚氧基、2，6，6-三甲基双环[3.1.1]庚氧基、双环[2.2.2]辛氧基等。示例性三环烃基团包括，例如，金刚烷基氧基。

如本文所用的“氰基”是指基团-CN。如本文所用的“氰基”是指基团-CN。

“EC50”是指产生50％功效的抑制剂或调节剂的摩尔浓度。

如本文所用的“稠合环”是指多环组件，其中包含该环组件的环如此连接，使得两个环共有的环原子彼此直接键合。稠合环组件可以是饱和的、部分饱和的、芳族的、碳环的、杂环的等。常见稠合环的非排他性实例包括十氢化萘、萘、蒽、菲、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、喹啉等。

如本文所用的“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用的“卤代烷基或卤代取代的烷基”是指如本文所定义的烷基，其被一个或多个本文所定义的卤原子取代。卤代烷基可以是单卤代烷基、二卤代烷基或包括全卤代烷基的多卤代烷基。单卤代烷基可以在烷基基团内具有一个碘、溴、氯或氟。二卤代烷基和多卤代烷基基团可以在烷基内具有两个或更多个相同的卤原子或不同的卤基基团的组合物。典型地使用C_x卤代烷基和C_X-Y卤代烷基，其中X和Y表示烷基链中的碳原子数。C_1-4卤代烷基的非限制性实例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。C_1-4全卤代烷基基团是指所有氢原子均被卤原子替代的C_1-4烷基基团。

如本文所用的“杂芳基”是指具有选自N、O和S的1至8个杂原子作为环原子且剩余环原子是碳原子的5-14元环组件(例如，5-7元单环、8-10元双环、或13-14元三环系统)。此类杂芳基环的氮原子可以任选地被四级化，且此类杂芳基环的硫原子可以任选地被氧化。如本文所用的C_X杂芳基和C_X-Y杂芳基描述杂芳基，其中X和Y表示杂芳基环中的环原子数。典型的C_5-7杂芳基基团包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、吡咯基、吡咯啉基、噻唑基、1，3，4-噻二唑基、异噻唑基、噁唑基、噁二唑异噁唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吡嗪基、嘧啶基等。双环或三环C_8-14杂芳基包括但不限于衍生自以下的那些杂芳基：苯并[b]呋喃、苯并[b]噻吩、苯并咪唑、咪唑并[4，5-c]吡啶、喹唑啉(quinazoline)、噻吩并[2，3-c]吡啶、噻吩并[3，2-b]吡啶、噻吩并[2，3-b]吡啶、喹唑啉(quinazolinyle)、蝶啶基、吲哚嗪、咪唑并[1，2a]吡啶、喹啉、喹啉基、异喹啉、酞嗪、喹喔啉、萘啶、萘啶基、喹嗪、吲哚基、吲哚、异吲哚、吲唑、吲哚啉、苯并噁唑、苯并吡唑、苯并噻唑、咪唑并[1，5-a]吡啶、吡唑并[1，5-a]吡啶、咪唑并[1，2-a]嘧啶、咪唑并[1，2-c]嘧啶、咪唑并[1，5-a]嘧啶、咪唑并[1，5-c]嘧啶、吡咯并[2，3-b]吡啶、吡咯并[2，3-c]吡啶、吡咯并[3，2-c]吡啶、吡咯并[3，2-b]吡啶、吡咯并[2，3-d]嘧啶、吡咯并[3，2-d]嘧啶、吡咯并[2，3-b]吡嗪、吡唑并[1，5-a]吡啶、吡咯并[1，2-b]哒嗪、吡咯并[1，2-c]嘧啶、吡咯并[1，2-a]嘧啶、吡咯并[1，2-a]吡嗪、叠氮基[1，5-a]吡啶、蝶啶、嘌呤、嘌呤基、咔唑、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、1，2-二氢吡咯并[3，2，1-hi]吲哚、吲哚嗪、吡啶并[1，2-a]吲哚和2(1H)-吡啶酮。

杂芳基可以是未经取代的，或者被一个或多个取代基取代，这些取代基独立地选自由以下组成的组：羟基、巯基、氰基、硝基、C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、C_1-4烷氧基、硫代C_1-4烷基、C_1-4烯基氧基、C_1-4炔基氧基、卤素、C_1-4烷基羰基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、氨基、C_1-4烷基氨基、二-C_1-4烷基氨基、C_1-4烷基氨基羰基、二-C_1-4烷基氨基羰基、C_1-4烷基羰基氨基、C_1-4烷基羰基(C_1-4烷基)氨基、磺酰基、氨磺酰基、烷基氨磺酰基、C_1-4烷基氨基磺酰基，其中上述烃基团(例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基残基)中的每一个可以进一步被一个或多个残基取代，这些残基在每次出现时独立地选自卤素、羟基或C_1-4烷氧基基团。

当杂芳基与另一个基团一起表示如“杂芳基氧基”、“杂芳基氧基烷基”、“杂芳基氧基羰基”时，杂芳基部分应当具有与上述“杂芳基”的定义所述相同的含义。

如本文所用的“杂芳基氧基”是指-O-杂芳基基团，其中该杂芳基是如本申请所限定的。

如本文所用的“杂原子”指不是碳原子的原子。杂原子的特定实例包括但不限于氮、氧和硫。

如本文所用的“杂环烷基”是指具有1至8个杂原子作为环原子且剩余环原子是碳原子的4-20元非芳族的饱和或部分不饱和单环或多环系统。杂原子选自N、O和S，优选地选自O和N。杂环烷基的氮原子可以任选地被四级化，且杂环烷基的硫原子可以任选地被氧化。杂环烷基可以包括稠合的或桥连的环以及螺环。典型地使用C_X杂环烷基和C_X-Y杂环烷基，其中X和Y表示环中的环原子数。典型地，该杂环烷基是含有1至3个杂原子的4-8元单环、含有1-5个杂原子的7至12元双环系统、或含有1至7个杂原子的10-15元三环系统。C_4-6杂环烷基的实例包括氮杂环丁烷基、四氢呋喃(THF)、二氢呋喃、1，4-二噁烷、吗啉、1，4-二噻烷、哌嗪、哌啶、1，3-二氧戊环、咪唑烷、咪唑啉、吡唑烷基、吡咯啉、吡咯烷、四氢吡喃、二氢吡喃、氧硫杂环戊烷、二硫环戊烷、1，3-二噁烷、1，3-二噻烷、氧硫杂环己烷、硫代吗啉等。

杂环烷基可以是未经取代的，或者被1-5个取代基(例如一个、或两个、或三个)取代，每个取代基独立地选自羟基、巯基、氰基、硝基、氧代、烷基亚氨基、C_1-4烷基、C_1-4烯基、C_1-4炔基、C_1-4烷氧基、C_1-4硫代烷基、C_1-4烯基氧基、C_1-4炔基氧基、卤素、C_1-4烷基羰基、羧基、C_1-4烷氧基羰基、氨基、C_1-4烷基氨基、二-C_1-4烷基氨基、C_1-4烷基氨基羰基、二-C_1-4烷基氨基羰基、C_1-4烷基羰基氨基、C_1-4烷基羰基(C_1-4烷基)氨基、磺酰基、氨磺酰基、烷基氨磺酰基、C_1-4烷基氨基磺酰基，其中上述烃基团(例如，烷基、烯基、炔基、烷氧基残基)中的每一个可以进一步被一个或多个残基取代，这些残基在每次出现时独立地选自卤素、羟基或C_1-4烷氧基基团。

当杂环烷基形成其他基团的一部分如“杂环烷基-烷基”、“杂环烷氧基”、“杂环烷基-芳基”时，杂芳基部分应当具有与上述“杂芳基”的定义所述相同的含义。

如本文所用的“与苯基稠合的杂环烷基”是指其中一个环是如上所定义的杂环烷基且另一个环是苯基的双环稠合环系统。与苯基稠合的杂环烷基包括但不限于苯并[b][1，4]噁嗪基、氧代-苯并[b][1，4]噁嗪基、四氢喹喔啉基、四氢喹啉基、二氢吲哚基、苯并[d]咪唑基等。

如本文所用的“杂环基”、“杂环”或“杂环的”是指每个环中含有至少一个杂原子部分(选自由N、O、SO、SO₂、(C＝O)、和S，并且优选地N、O、S组成的组)、任选地含有一至四个其他杂原子的3-20元单环或多环系统。典型地使用C_X杂环基和C_X-Y杂环基，其中X和Y表示环系统中的环原子数。除非另有指明，否则杂环基可以是饱和的、部分不饱和的、芳族的或部分芳族的。

如本文所用的“羟基”是指基团-OH。

如本文所用的“羟烷基”或“羟基取代的烷基”是指如本文所定义的烷基，其中烷基中一个或多个可用氢被羟基基团替代。例如，羟基C_1-4烷基包括但不限于-CH₂CH₂OH、-CH(OH)CH₂CH₂OH、-CH(OH)CH₂CH(OH)CH₃。

如本文所用的“硝基”是指基团-NO₂。

如本文所用的“氧代”是指二价基团＝O

“被保护的衍生物”意指抑制剂的衍生物，其中一个或多个反应部位被保护基团阻断。被保护的衍生物可用于制备抑制剂，或者它们自身可以具有抑制剂的活性。被保护的基团的实例包括但不限于乙酰基、四氢吡喃、甲氧基甲基醚、β-甲氧基乙氧基甲基醚、对甲氧基苄基、甲硫基甲基醚、新戊酰、甲硅烷基醚、苄氧羰基、苄基、叔丁氧基羰基、对甲氧基苯基、9-芴基甲基氧基羰基、缩醛、缩酮、缩羰酯(acylal)、二噻烷、甲基酯、苄基酯、叔丁基酯和甲硅烷基酯。合适的保护基团的详细清单可以在T.W.Greene，Protecting Groups inOrganic Synthesis[有机合成中的保护基团]，第3版，John Wiley&Sons，Inc.[约翰·威利父子公司]1999中找到。

如本文所用的“未经取代或取代的”或“任选地被取代”表示取代基键合到指定基团的可用价位上。如本文所用的“未经取代的”表示指定基团不再有非氢取代基。如本文所用的“取代的”或“任选地被取代”表示指定基团中至少一个可用氢原子被(或者可以被)非氢取代基替代。

如本文所用的“末端被......取代”是指取代基在母体分子的末端位置取代氢。例如，末端被氨基取代的C_1-4烷基意指-C_1-4亚烷基-氨基，其包括-(CH₂)-NH₂、-(CH₂)₂-NH₂、-(CH₂)₃-NH₂、-(CH₂)CH₂(CH₂-NH₂)、-(CH₂)4-NH₂、-C(CH₂)(CH₂CH₂-NH₂)、--C(CH₃)₂(CH₂-NH₂)等。

除非另有指明，否则取代基的实例可以包括但不限于卤代、硝基、氰基、硫代、氧基、羟基、羰基氧基、C_1-6烷氧基、C_6-10芳基氧基、杂C_5-10芳基氧基、羰基、氧基羰基、氨基羰基、氨基、C1-6烷基氨基、磺酰氨基、亚氨基、磺酰基、亚磺酰基、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、羟基C_1-6烷基、羰基C_1-6烷基、硫代羰基C_1-10烷基、磺酰基C_1-6烷基、亚磺酰基C_1-6烷基、C_1-10氮杂烷基、亚氨基C_1-6烷基、C_3-12环烷基C_1-6烷基、C_4-15杂环烷基C_1-6烷基、C_6-10芳基C_1-6烷基、C_5-10杂芳基C_1-6烷基、C_10-12双环芳基C_1-6烷基、C_9-12杂双环芳基C_1-6烷基、C_3-12环烷基、C_4-12杂环烷基、C_9-12双环烷基、C_3-12杂双环烷基、C_4-12芳基、杂C_1-10芳基、C_9-12双环芳基和C_4-12杂双环芳基。如本文所用的“氨磺酰基”是指基团-S(O)2NRaRb，其中Ra和Rb独立地是H，或是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、芳基、环烷基、芳基烷基、环烷基烷基基团或这些基团之一的异型，并且烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、芳基烷基基团或这些基团之一的异型中的每一个任选地被本文所述的适于相应基团的取代基取代。

如本文所用的“硫烷基”意指基团-S-。

如本文所用的“亚磺酰基”意指基团-S(O)-。应当注意，术语“亚磺酰基”当表示单价取代基时可以替代地是指被取代的亚磺酰基基团S(＝O)R，其中R是氢或硫原子上的非氢取代基，这形成不同的亚磺酰基基团，包括亚磺酸、亚磺酰胺、亚磺酰酯和亚砜。

如本文所用的“磺酰基”意指基团-S(O)2-。应当注意，术语“磺酰基”当表示单价取代基时可以替代地是指被取代的磺酰基基团S(＝O)2R，其中R为氢或硫原子上的非氢取代基，这形成不同的磺酰基基团，包括磺酸、磺酰胺、磺酸酯和砜。

如本文所用的“硫代羰基”是指基团-C(＝S)-。应当注意，术语硫代羰基当表示单价取代基时可以替代地是指被取代的硫代羰基的基团C(＝S)R，其中R为氢或碳原子上的非氢取代基，这形成不同的硫代羰基基团，包括硫代酸、硫代酰胺、硫代酯和硫酮。

“

”和“/>

”是表示X与分子的其他部分的附接点的符号。

本文中的任意定义可以与任意其他定义组合使用以描述复合结构基团。按照惯例，任意这类定义的末端元素是与母体部分连接的元素。例如，复合基团烷氧基烷基表示与母体分子通过烷基基团连接的烷氧基基团。

关于所有本文提供的定义应当注意，这些定义应当被解释为是开放的，其可以包括那些指明的取代基以外的取代基。因此，C1烷基表示有一个碳原子但不表示碳原子上的取代基是什么。因此，C₁烷基包含甲基(即，-CH₃)以及-CR_aR_bR_c，其中R_a、R_b和R_c可以各自独立地是氢或任何其他取代基，其中与碳连接的原子不是氢原子。因此，例如-CF₃、-CH₂OH和-CH₂CN均为C₁烷基。

优选实施例的描述

本发明提供一类新型化合物、包含此类化合物的药物组合物以及使用此类化合物治疗或预防与寄生虫相关的疾病或障碍的方法。特别地，这些化合物可以用于治疗隐孢子虫病。

在一个实施例中，本发明的化合物具有式I：

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中

P是0、1、2、或3；

Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、或Y⁶中的每一个独立地是C或N；

R¹、R²、R³或R⁴中的每一个独立地是氢或C_1-6烷基；

每个R⁵独立地选自由以下组成的组：氢、C_1-6烷基、氰基、-C(O)C_1-6烷基；卤代、卤代C_1-6烷基、和-S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶选自由以下组成的组：

a)氢，和

b)未经取代的或被独立地选自由以下组成的组的1-3个取代基取代的C_1-6烷基：

i)C_1-6烷氧基，

ii)卤代，

iii)硫代C_1-6烷基，

iv)未经取代的或被独立地选自由氧代和C_1-6烷基组成的组的1-3个取代基取代的C_4-6杂环烷基；

v)未经取代的或被1-3个C_1-6烷基取代基取代的C_5-6杂芳基；

vi)-C(O)R⁷，和

vii)-C(O)NR⁷R⁷，其中每个R⁷独立地是氢或C_1-6烷基。

在本发明的化合物的一个实施例中，参考式I，Y²和Y⁵是N，且Y¹、Y³、Y⁴和Y⁶是C。

在另一个变化中，Y³和Y⁵是N，且Y¹、Y²、Y⁴和Y⁶是C。

在另一个变化中，Y³是N，且Y¹、Y²、Y⁴、Y⁵和Y⁶是C。

在本发明的化合物、或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体的具体实施例中，该化合物具有式Ia

在本发明的化合物的一个变化中，参考以上的具体实施例，R¹、R²和R³是氢，且R⁴是C_1-6烷基。

在本发明的化合物的另一个变化中，参考以上的具体实施例和任一以上的变化，R⁴是甲基。

在本发明的化合物的还另一个变化中，参考以上的具体实施例或任一以上的变化，R⁵是卤代。

在本发明的化合物的还另一个变化中，参考以上的具体实施例或任一以上的变化，R⁵是氯。

根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体的具体实例包括但不限于：甲基5-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氯苯甲酸酯；

叔丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸；

2-(甲硫基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

异丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-甲氧基-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

噻唑-5-基甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-吗啉代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2，2，2-三氟乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-甲氧基乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯

异丙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

外消旋-1-((乙氧基羰基)氧基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

外消旋-(四氢呋喃-2-基)甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

叔丁基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸；

2-吗啉代乙基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(2-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(3-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯：

甲基2-氯-5-(3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯；

甲基5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氰基苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；和

甲基2-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-5-氯苯甲酸酯。

应当注意，本发明的化合物可以呈药学上可接受的盐的形式。还需要注意的是，本发明的化合物可以是立体异构体的混合物，或该化合物可以包含单一立体异构体。

本发明的其他化合物具体见下文的实例中。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的、作为活性成分的根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物。

在一个实施例中，该药物组合物进一步包含第二药剂，该第二药剂可以是激酶抑制剂或抗炎剂。

在另一个实施例中，该药物组合物是调整为适于口服施用的固体配制品。在另一个实施例中，该组合物是调整为适于口服施用的液体配制品。在又一个实施例中，该组合物是片剂。在还另一个实施例中，该组合物是调整为适于肠胃外施用的液体配制品。

在又一个实施例中，将该药物组合物调整为适于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经口含化、鼻内、脂质体、经由吸入、阴道内、眼内、经由局部递送(例如通过导管或支架)、皮下、脂肪内、关节内和鞘内。

在另一个方面，本发明涉及根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物或药物组合物，其用于治疗应用。

在另一个方面，本发明涉及根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物或药物组合物，其用作药物。

在又另一个方面，本发明涉及用于预防、抑制、改善或根除隐孢子虫病的病理和/或症状的方法，该隐孢子虫病由隐孢子虫属的原生动物(特别地，人隐孢子虫和小球隐孢子虫)引起。选定的化合物有效地最小化隐孢子虫感染的致细胞病变效应，从而降低感染率。发明人进一步证明了化合物靶向磷脂酰肌醇-4-OH激酶(PI(4)K)，一种隐孢子虫的脂质激酶。

可用于本发明的方法的特定化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体选自下表I：

表I.化合物的列表

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应当注意，可用于本发明的方法的化合物可以呈药学上可接受的盐的形式。还需要注意的是，在本发明的方法中可用的化合物可以是立体异构体的混合物，或该化合物可以包含单一立体异构体。

在另一个方面，本发明的方法涉及药物组合物的用途，该药物组合物包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的、作为活性成分的根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物。

在另一个实施例中，该药物组合物是调整为适于口服施用的固体配制品。在另一个实施例中，该组合物是调整为适于口服施用的液体配制品。在又一个实施例中，该组合物是片剂。在还另一个实施例中，该组合物是调整为适于肠胃外施用的液体配制品。

在又一个实施例中，将该药物组合物调整为适于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经口含化、鼻内、脂质体、经由吸入、阴道内、眼内、经由局部递送(例如通过导管或支架)、皮下、脂肪内、关节内和鞘内。

在另一个方面，本发明涉及根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物或药物组合物，其用于治疗应用。

在另一个方面，本发明涉及根据上文实施例和变化中任一项所述的化合物或药物组合物，其用作药物。

列举的实施例

本文描述了本发明的各种列举的实施例。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外实施例。

在第一实施例中，本发明提供了一种根据式I的化合物，

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中

P是0、1、2、或3；

Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、或Y⁶中的每一个独立地是C或N；

R¹、R²、R³或R⁴中的每一个独立地是氢或C_1-6烷基；

每个R⁵独立地选自由以下组成的组：氢、C_1-6烷基、氰基、-C(O)C_1-6烷基；卤代、卤代C_1-6烷基、和-S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶选自由以下组成的组：

a)氢，和

b)未经取代的或被独立地选自由以下组成的组的1-3个取代基取代的C_1-6烷基：

i)C_1-6烷氧基，

ii)卤代，

iii)硫代C_1-6烷基，

iv)未经取代的或被独立地选自由氧代和C_1-6烷基组成的组的1-3个取代基取代的C_4-6杂环烷基；

v)未经取代的或被1-3个C_1-6烷基取代基取代的C_5-6杂芳基；

vi)-C(O)R⁷，和

vii)-C(O)NR⁷R⁷，其中每个R⁷独立地是氢或C_1-6烷基。

实施例2.根据实施例1所述的化合物，其中Y³是N，且Y¹、Y²、Y⁴、Y⁵和Y⁶是C。

实施例3.根据实施例1所述的化合物，其中Y³和Y⁵是N，且Y¹、Y²、Y⁴和Y⁶是C。

实施例4.根据实施例1所述的化合物，其中Y²和Y⁵是N，且Y¹、Y³、Y⁴和Y⁶是C。

实施例5.根据实施例1-4中任一项所述的化合物，其中所述化合物能够抑制或调节隐孢子虫原生动物的磷脂酰肌醇-4-OH激酶(PI4K)的活性。

实施例6.根据实施例1-5中任一项所述的化合物，其中所述隐孢子虫原生动物是人隐孢子虫或小球隐孢子虫。

实施例7.根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物具有式Ia

实施例8.根据实施例1-7中任一项所述的化合物，其中R¹、R²和R³是氢，且R⁴是C_1-6烷基。

实施例9.根据实施例1-8中任一项所述的化合物，其中R⁴是甲基。

实施例10.根据实施例1所述的化合物，其中R⁵是卤代。

实施例11.根据实施例10所述的化合物，其中R⁵是氯。

实施例12.根据实施例1所述的化合物，其中所述化合物选自表I中列出的化合物的组。

实施例13.一种用于治疗、抑制、改善或根除由隐孢子虫原生动物引起的隐孢子虫病的病理和/或症状的化合物，所述化合物包括向有需要的患者施用治疗有效量的能够调节或抑制所述原生动物的磷脂酰肌醇-4-OH激酶(PI4K)的活性的药剂。

实施例14.根据实施例13所述的化合物，其中所述隐孢子虫原生动物是人隐孢子虫或小球隐孢子虫。

实施例15.根据实施例13或14所述的化合物，其中所述药剂是化合物，其是根据实施例1-12中任一项所述的化合物。

如本文所用，术语“光学异构体”或“立体异构体”是指本发明的给定化合物可存在的各种立体异构构型中的任一种且包括几何异构体。应了解取代基可以连接在碳原子的手性中心。术语“手性的”是指在其镜像配偶体上具有非重叠性特性的分子，而术语“非手性的”是指在其镜像配偶体上是可重叠的分子。因此，本发明包括化合物的对映异构体、非对映异构体或外消旋物。“对映异构体”是彼此为不能重叠镜像的一对立体异构体。对映异构体对的1∶1混合物是“外消旋”混合物。该术语用于在适当的情况下表示外消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个非对称原子，但其彼此非镜像的立体异构体。绝对立体化学根据Cahn-lngold-Prelog R-S系统指定。当化合物是纯的对映异构体时，每个手性碳的立体化学可以由R或S表示。未知绝对构型的拆分化合物可以取决于其在钠D线的波长处使平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)来指定(+)或(-)。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心或轴且由此可以产生对映异构体、非对映异构体和其他可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的立体异构体形式。

根据起始材料和程序的选择，化合物可以呈可能的异构体形式或作为其混合物(例如作为纯的光学异构体或作为异构体混合物，如外消旋体和非对映异构体混合物)存在，这取决于不对称碳原子的数目。本发明旨在包括所有这些可能的异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学纯的形式。光学活性(R)-和(S)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术拆分。如果化合物含有双键，则取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。所有互变异构形式也旨在包括在内。

如本文所用，术语“盐(salt或salts)”是指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和特性，并且通常不是生物学上或其他方面不合需要的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。

可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳糖酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。

可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。

可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代胺(包括天然存在的取代胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从碱或酸部分合成。通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等)反应来制备，或通过将这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。典型地，此类反应在水中或在有机溶剂中、或在这两者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，希望使用非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、或乙腈。另外的合适的盐的列表可见于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]”，第20版，Mack Publishing Company[麦克出版公司]，Easton，Pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿]，(1985)；以及Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection and Use[药用盐手册：特性、选择和使用]”(Wiley-VCH[约翰威立国际出版公司]，Weinheim，Germany[德国魏因海姆]，2002)。

本文中给出的任何式还旨在代表化合物的非标记形式以及同位素标记形式。除了一个或多个原子被具有选定原子量或质量数的原子替代以外，同位素标记的化合物具有本文中给出的式所描述的结构。可以掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²p、³⁵S、³⁶Cl、¹²⁵I。本发明包括如本文所定义的各种同位素标记的化合物，例如其中存在放射性同位素(如³H和¹⁴C)的那些化合物，或其中存在非放射性同位素(如²H和¹³C)。这种同位素标记的化合物可用于代谢研究(用¹⁴C)、反应动力学研究(例如用²H或³H)、检测或成像技术，例如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定，或用于患者的放射治疗。特别地，¹⁸F或标记的化合物对于PET或SPECT研究可能是特别期望的。同位素标记的具有式(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实例和制备中所述的那些类似的工艺，使用适当的同位素标记的试剂代替未标记的先前使用的试剂来制备。

此外，用较重的同位素，特别是氘(即，²H或D)取代可以提供来源于更大的代谢稳定性(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少或治疗指数改进)的某些治疗优点。应理解，在此上下文中的氘被认为是具有式(I)的化合物的取代基。这种较重的同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语“同位素富集因子”意指同位素丰度与指定同位素的天然丰度之间的比率。如果本发明的化合物中的取代基指示氘，这样的化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)。

根据本发明的药学上可接受的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以被同位素取代的那些，例如D₂O、d₆-丙酮、d₆-DMSO。

本发明的化合物，即含有能够充当氢键供体和/或受体的基团的具有式(I)的化合物，能够与适合的共晶形成体形成共晶体。这些共晶体可以通过已知的共晶形成程序由具有式(I)的化合物制备。此类程序包括在结晶条件下研磨、加热、共升华、共熔或使具有式(I)的化合物与共晶形成体在溶液中接触，并分离由此形成的共晶体。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合物，如本领域技术人员将已知的(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第18版，Mack Printing Company[马克出版公司]，1990，第1289-1329页)。除了任何常规载体与活性成分均不相容的情况外，考虑了其在治疗或药物组合物中的用途。

本发明的化合物的术语“治疗有效量”是指将引起受试者的生物学或医学应答(例如，酶或蛋白活性的降低或抑制，或改善症状、缓解病症、减慢或延迟疾病进展或预防疾病等)的本发明的化合物的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的如下量，当施用于受试者时，该量有效地(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善(i)由疟原虫介导，或(ii)与疟原虫活性相关，或(iii)表征为疟原虫的活性(正常或异常)的病症或障碍或疾病；或(2)降低或抑制疟原虫的活性；或(3)降低或抑制疟原虫的生长。在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明化合物的如下量，该量当被施用至细胞、或组织、或非细胞生物材料、或介质时有效地至少部分降低或抑制疟原虫的活性；或至少部分降低或抑制疟原虫的生长。

如本文所用，术语“受试者”是指动物。典型地，该动物是哺乳动物。受试者还指例如灵长类动物(例如人，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施例中，受试者是灵长类动物。在又其他实施例中，受试者是人。

如本文所用，术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状、或障碍、或疾病，或生物活性或过程的基础活性的显著降低。

如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个实施例中是指改善疾病或障碍(即，减慢或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指减轻或改善至少一种身体参数，包括不能被患者辨别的那些。在又一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)或在生理上(例如，身体参数的稳定化)或两者调节疾病或障碍。在又一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发作或发展或进展。

如本文所用，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中获益，则这种受试者是“需要”这种治疗的。

如本文所用，术语“一个/种(a/an)”、“该/所述(the)”以及在本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的类似术语应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文中另有指示或与上下文明显相矛盾。

在本文描述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。

本发明的一种或多种化合物的任何非对称原子(例如，碳等)可以以外消旋或对映异构体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R，S)-构型。在某些实施例中，每个非对称原子具有至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量、或至少99％对映异构体过量的(R)-或(S)-构型。如果可能，在具有不饱和双键的原子上的取代基可以以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。

因此，如本文所用，本发明的化合物可以呈可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体或其混合物之一的形式，例如，作为基本上纯的几何(顺式或反式)异构体、非对映异构体、光学异构体(对映体)、外消旋体或其混合物。

任何所得的异构体混合物可以基于成分的物理化学差异例如通过色谱法和/或分级结晶被分离成纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体。

可以通过已知方法将任何所得的最终产物或中间体的外消旋体拆分成旋光对映体，例如通过分离用光学活性酸或碱获得的其非对映异构体盐，并释放出光学活性的酸性或碱性化合物来拆分。特别地，因此可以采用碱性部分将本发明的化合物拆分成它们的旋光对映体，例如通过用光学活性酸形成的盐的分级结晶，该光学活性酸例如酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二乙酰酒石酸、二-O，O′-对甲苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。外消旋产物还可以通过手性色谱法拆分，例如使用手性吸附剂的高压液相色谱法(HPLC)。

此外，本发明的化合物(包括它们的盐)还可以按其水合物形式获得，或包括用于其结晶的其他溶剂。本发明的化合物可以固有地或通过设计形成具有药学上可接受的溶剂(包括水)的溶剂化物；因此，旨在将本发明包括溶剂化形式和非溶剂化形式两者。术语“溶剂化物”是指本发明的化合物(包括其药学上可接受的盐)与一种或多种溶剂分子的分子复合物。此类溶剂分子是制药领域常用的那些，已知它们对接受者是无害的，例如水、乙醇等。术语“水合物”是指溶剂分子为水的复合物。

本发明的化合物(包括其盐、水合物和溶剂化物)，可以固有地或通过设计形成多晶型物。

一般而言，可用于本发明的方法的化合物将以治疗有效量经由本领域已知的任何常用且可接受的模式单独或与一或多种治疗剂组合施用。治疗有效量可广泛地改变，这取决于疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所使用化合物的效力和其他因素。一般而言，指示以约0.03至2.5mg/kg体重的日剂量可全身性地获得令人满意的结果。较大的哺乳动物(例如人)中所指示的日剂量在从约0.5mg至约100mg的范围内，例如以多达一天四次的分剂量或以缓释形式方便地施用。用于口服施用的合适的单位剂型包含从约1至50mg的活性成分。

本发明的化合物可以通过任何常规的途径，特别是肠内，例如口服(例如以片剂或胶囊的形式)、或肠胃外(例如以可注射溶液或悬浮液的形式)、局部地(例如以洗剂、凝胶、软膏或乳膏的形式或以鼻或栓剂形式)作为药物组合物施用。包含呈游离形式或呈药学上可接受的盐形式的本发明的化合物以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物可以通过混合、制粒或包衣方法以常规方式制造。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊，其包含活性成分以及a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有c)粘合剂，例如，硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和或聚乙烯吡咯烷酮；如果希望，d)崩散剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸附剂、着色剂、调味剂和甜味剂。可注射组合物可以是水性等渗溶液或悬浮液，并且栓剂可以由脂肪乳液或悬浮液制备。这些组合物可以是灭菌的和/或含有佐剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂)。另外，它们还可以含有其他有治疗价值的物质。用于经皮施加的合适的配制品包括有效量的本发明的化合物和载体。载体可以包含可吸收的药理学上可接受的溶剂以帮助穿过宿主的皮肤。例如，经皮装置呈绷带的形式，该绷带包括背部构件、任选地具有载体的含有该化合物的储库、任选地用于将化合物以控制的和预定的速率在延长的时间段内递送至宿主的皮肤的速率控制屏障以及用于将该装置固定至皮肤的器件。还可以使用基质经皮配制品。用于局部施加例如至皮肤和眼睛的合适的配制品优选地是本领域中熟知的水溶液、软膏、乳膏或凝胶。此类系统可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。

当本发明的化合物与其他疗法联合施用时，共同施用的化合物的剂量当然将根据所用的联合药物的类型、所用的特定药物、所治疗的病症等而变化。

本发明还提供了药物组合(例如试剂盒)，该药物组合包含a)第一药剂，其是呈游离形式或药学上可接受的盐形式的如本文披露的本发明化合物；和b)至少一种共药剂。该试剂盒可以包括其施用说明书。

如本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等旨在涵盖将所选择的治疗剂施用至单个患者，并且意欲包括其中药剂不一定通过相同施用途径施用或在同时间施用的治疗方案。

如本文所用的术语“药物组合”意指由多于一种活性成分的混合或组合所产生的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指将活性成分，例如具有式I的化合物和共药剂两者以单一实体或剂量的形式同时施用至患者。术语“非固定组合”意指活性成分，例如具有式I的化合物和共药剂两者以分开的实体同时、并行或顺序施用至患者(没有特定的时间限制)，其中这种施用在患者体内提供了2种化合物的治疗有效水平。后者还适用于混合物疗法，例如，3种或更多种活性成分的施用。

实例

本发明由展示本发明化合物的制备的以下实例和中间体进一步例证，但不局限于此。应理解，如果特定化合物的名称和结构之间存在差异，则结构应被视为正确的，因为化合物名称是从结构生成的。

温度以摄氏度给出。如果没有另外提及，所有蒸发都在减压下进行，典型地在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133毫巴)之间进行。最终产物、中间体和起始材料的结构通过标准分析方法(例如，微量分析和光谱特征(例如，MS、IR、NMR))确认。所使用的缩写是本领域常规的缩写。

用于合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产(Houben-Weyl第4版1952，Methods of Organic Synthesis[有机合成方法]，Thieme[蒂梅出版社]，第21卷)。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产，如以下实例所示。

LC-MS方法

方法1：

Waters Acquity二元梯度泵；Waters Acquity PDA检测器。Waters自动进样器；带有ESI和APCI离子源的Waters Quattro微型API质谱仪；UPLC柱：Waters Acquity；BEH；C181.7um 50×2.1mm；流动相：(A)H₂O+0.025％TFA和(B)乙腈+0.025％TFA。梯度：0.4mL/分钟，初始15％B经3.0分钟斜升至95％B，然后保持直至4.0分钟，在4.1分钟时返回至15％B直至运行结束，然后将柱平衡2.0分钟；MS扫描：在0.5秒内100至1000amu/通道；二极管阵列检测器：200nm和400nm。

方法2：

Waters Acquity二元梯度泵；Waters Acquity PDA检测器。Waters自动进样器；带有ESI和APCI离子源的Waters Quattro微型API质谱仪；UPLC柱：Waters Acquity；BEH；C181.7um 50×2.1mm；流动相：(A)H₂O+0.025％TFA和(B)乙腈+0.025％TFA。梯度：0.4mL/分钟，初始20％B经2.0分钟斜升至90％B，然后保持直至4.0分钟，在4.1分钟时返回至20％B直至运行结束，然后将柱平衡2.0分钟；MS扫描：在0.5秒内100至1000amu/通道；二极管阵列检测器：200nm和400nm。

方法3：

Waters Acquity二元梯度泵；Waters Acquity PDA检测器。Waters自动进样器；Waters Acquity蒸发光散射检测器；带有ESI和APCI离子源的Waters Quattro微型API质谱仪；UPLC柱：Waters Acquity；BEH；C18 1.7um 100×2.1mm；流动相：(A)H₂O+0.025％TFA和(B)乙腈+0.025％TFA。梯度：0.3mL/分钟，初始10％B经4.0分钟斜升至80％B，然后保持直至6.0分钟，在6.1分钟时返回至10％B直至运行结束，然后将柱平衡2.5分钟；MS扫描：在0.5秒内100至1000amu/通道；二极管阵列检测器：200nm和400nm；漂移管温度：50℃，和N2气流量：对ELSD检测器为40Psi。

方法4：

Waters Acquity二元梯度泵；Waters Acquity PDA检测器。Waters自动进样器；带有ESI和APCI离子源的Waters Quattro微型API质谱仪；UPLC柱：Waters Acquity；BEH；C181.7um 50×2.1mm；流动相：(A)H2O+0.025％TFA和(B)乙腈+0.025％TFA。梯度：0.4mL/分钟，初始20％B经2.0分钟斜升至80％B，然后保持直至4.0分钟，在4.1分钟时返回至20％B直至运行结束，然后将柱平衡2.0分钟；MS扫描：在0.5秒内100至1000amu/通道；二极管阵列检测器：200nm和400nm

方法5：

Waters Acquity二元梯度泵；Waters Acquity PDA检测器。Waters自动进样器；带有ESI和APCI离子源的Waters Quattro微型API质谱仪；UPLC柱：Waters Acquity；BEH；C181.7um 50×2.1mm；流动相：(A)H2O+0.025％TFA和(B)乙腈+0.025％TFA。梯度：0.4mL/分钟，初始10％B经3.0分钟斜升至80％B，然后保持直至4.0分钟，在4.1分钟时返回至20％B直至运行结束，然后将柱平衡2.0分钟；MS扫描：在0.5秒内100至1000amu/通道；二极管阵列检测器：200nm和400nm

方法6：

Agilent G1379A脱气器；Agilent G1312A二元泵；Agilent G1315C二极管阵列检测器；Agilent G1367A自动进样器；带有ESI源的Agilent离子阱质谱仪；HPLC柱：Waters X-Terra；MS；C18；2.5um 50×4.6mm；流动相：(A)在水中的0.01M碳酸氢铵和(B)乙腈；梯度：1mL/分钟，初始50％B经4.0分钟斜升至80％B，并且保持直至6.0分钟，在6.1分钟时返回至50％B直至运行结束。将柱再平衡3分钟。MS扫描：100至1200amu；二极管阵列检测器：200nm-400nm。

方法7：

Agilent G1379A脱气器；Agilent G1312A二元泵；Agilent G1315C二极管阵列检测器；Agilent G1367A自动进样器；带有ESI源的Agilent离子阱质谱仪；HPLC柱：Waters X-Bridge；C18；3.5um 150×4.6mm；流动相：(A)在水中的0.01M碳酸氢铵和(B)乙腈；梯度：1mL/分钟，初始20％B经4.0分钟斜升至80％B，并且保持直至8.0分钟，在8.1分钟时返回至20％B直至运行结束。将柱再平衡3分钟。MS扫描：100至1200amu；二极管阵列检测器：200nm-400nm。

方法8：

Agilent G1379A脱气器；Agilent G1312A二元泵；Agilent G1315C二极管阵列检测器；Agilent G1367A自动进样器；带有ESI源的Agilent离子阱质谱仪；HPLC柱：WatersSymmetry；C18；3.5um 75×4.6mm；流动相：(A)H₂O+0.1％甲酸和(B)乙腈+0.1％甲酸；梯度：1mL/分钟，初始20％B经4.0分钟斜升至80％B，并且保持直至7.0分钟，在7.1分钟时返回至20％B直至运行结束。将柱再平衡3分钟。MS扫描：100至1200amu；二极管阵列检测器：200nm-400nm。

实例1.01：N-(4-氰基苯基)-N-甲基-3-(4-(三氟甲基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺

甲基5-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氯苯甲酸酯(1.01a)

向500mL烧瓶中装入甲基5-氨基-2-氯苯甲酸酯(58.6g，316mmol)和水(250ml)。将混合物在铝块上加热至33℃。缓慢添加Boc₂O(76g)并将烧瓶装配隔膜。在3h处，添加另外的Boc₂O(7.6g)。30min后，将混合物冷却至室温并过滤。将固体用水(150mL)洗涤并在玻璃料上干燥，随后在35℃的烘箱中干燥12h以产生呈棕色固体的1.01a(87.6g，307mmol，97％产率)。LC-MS(m/z)：230.1[M+H]⁺，RT＝0.91min。¹H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.83(d，J＝2.7Hz，1H)，7.51-7.45(m，1H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，6.55(s，1H)，3.92(s，3H)，1.52(s，9H)。

甲基5-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-2-氯苯甲酸酯(1.01b)

将1.01a(87.6g，307mmol)均匀分到三个配备有搅拌棒的500mL烧瓶中。向每个烧瓶中添加MeCN(100mL)。将烧瓶冷却至0℃并且向每个烧瓶中添加Cs₂CO₃(66.6g)。15min后，向每个烧瓶中添加碘甲烷(13mL)并且去除冰浴。在5h处，添加碘甲烷(2mL)并且将浆液搅拌过夜。将混合物合并，用EtOAc(300mL)稀释并且用水和盐水洗涤。将庚烷(100mL)添加至有机层，并且将溶液经Na₂SO₄干燥、过滤并浓缩以提供呈棕色油状物的1.01b(94g，314mmol，102％产率)。LC-MS(m/z)：244.2[M+H]⁺，RT＝0.94min。¹H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.72(d，J＝2.5Hz，1H)，7.38(d，J＝8.6Hz，1H)，7.33(t，J＝5.6Hz，1H)，3.92(s，3H)，3.25(s，3H)，1.45(s，9H)。

甲基2-氯-5-(甲基氨基)苯甲酸酯盐酸盐(1.01c)

将1.01b(94g，314mmol)均匀分到三个250mL烧瓶中。向每个烧瓶中添加二噁烷(50mL)。向每个烧瓶中添加在二噁烷(80mL)中的4.0M HCl。将混合物搅拌过夜。将混合物合并，并且在40℃下在8托真空中浓缩。将所得固体悬浮在甲苯(250mL)中，然后在50℃下在8托下浓缩。将所得粉末在35℃下1托下干燥过夜以提供呈棕色固体的1.01c(70.6g，299mmol，95％产率)。LC-MS(m/z)：200.1[M+H]⁺，RT＝0.55min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ7.27(d，J＝8.7Hz，1H)，6.99(d，J＝2.8Hz，1H)，6.80(dd，J＝8.9，2.8Hz，1H)，3.82(s，3H)，2.69(s，3H)。

甲基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.01d)

向3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(87.0g，360mmol)在DCM(1.9L)中的溶液中添加草酰氯(48.1g)，然后逐滴添加DMF(1.39mL)。将混合物搅拌5h。添加NEt₃(127g)，随后添加1.01c(76.6g)，并且将混合物搅拌3h。浓缩反应混合物以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO₂，1％至66％石油醚/EtOAc)纯化以提供呈黄色固体的1.01a(115g，272mmol，75.3％产率)。LC-MS(m/z)：422.0[M+H]⁺，RT＝0.884min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.65(d，J＝7.20Hz，1H)8.19(s，1H)7.84(d，J＝0.80Hz，1H)7.57(s，1H)7.50(s，2H)6.81(d，J＝6.40Hz，1H)3.82(s，3H)3.40(s，3H)。

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.01)

在N₂下，向(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(54.6g)和1.01d(100g，236mmol)在THF(2480mL)和水(468mL)中的溶液中添加PdCl₂(tbdpf)(7.71g)。将NEt₃(98.7mL)添加至上述混合物中。将混合物在53℃下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO₂，在DCM中的1％-10％MeOH)纯化两次。将产物用甲醇(500mL)研磨1h、过滤、并通过在50℃下从10/1DCM/MeOH(400mL)再结晶来纯化。获得呈黄色固体的化合物1.01(41.0g，86.7mmol，36.6％产率)。LC-MS(m/z)：463.1[M+H]⁺，RT＝0.816min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.67(d，J＝7.15Hz，1H)8.46(s，1H)8.01-7.97(m，1H)7.96-7.92(m，2H)7.91-7.84(m，2H)7.58-7.48(m，4H)7.38-7.31(m，1H)6.91-6.84(m，1H)3.41(s，3H)3.81(s，3H)。

实例1-02：

叔丁基5-氨基-2-氯苯甲酸酯(1.02a)

叔丁基2-氯-5-硝基苯甲酸酯(10.5g，40.8mmol)吸收于4∶1的THF：水(50mL)中。添加饱和氯化铵水溶液(21.8g)和锌(26.7g)。将混合物在65℃下搅拌3h。冷却至室温后，将反应混合物经硅藻土过滤。将滤液用水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将粗材料通过快速柱色谱法(24g SiO₂，在己烷中的10％-15％EtOAc)纯化以提供1.02a(7g，30.8mmol，75.5％)。LC-MS(m/z)：228[M+H]⁺，RT＝1.53min。

叔丁基2-氯-5-(甲基氨基)苯甲酸酯(1.02b)

将1.02a(7.0g，30.8mmol)吸收于二噁烷(50mL)中。添加Cu(OAc)₂(14.0g)和吡啶(8.3mL)并将混合物搅拌30min。添加甲基硼酸(4.54g)并将混合物加热到100℃持续12h。冷却至室温后，将混合物通过硅藻土过滤、浓缩、并通过快速柱色谱法(24g SiO₂，在己烷中的5％-10％EtOAc)纯化以提供1.02b(3.0g，12mmol，41％)。LC-MS(m/z)：242[M+H]⁺，RT＝2.4min。

叔丁基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.02c)

在0℃下，向3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(3.89g)在DCM(25mL)中的溶液中添加草酰氯(2.74mL)和DMF(0.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌1h。在减压下蒸发溶剂。将所得固体溶解于DCM(15mL)中。将1.02b(3.0g，12.4mmol)溶解于DCM(10ml)和DIPEA(8.5mL)中。在0℃下，将此反应混合物添加至上述酰基氯混合物。将反应混合物在室温下搅拌4h。将反应用水淬灭并用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗固体通过快速柱色谱法(24g SiO₂，在己烷中的10％-20％EtOAc)纯化以提供1.02c(2.8g，3.03mmol，49％)。LC-MS(m/z)：465.9[M+H]⁺，RT＝2.45min。

叔丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.02)

在氩气下，向(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(42mg)和1.02c(80mg，0.172mmol)在9∶1二噁烷：水(8mL)中的溶液中添加Cs₂CO₃(0.167)。添加PdCl₂(dppf)(14mg)。将混合物在80℃下搅拌3h。将反应混合物倾倒入水中并用EtOAc萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Kinetex EVO，150mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经3min 20％-40％B，经5min 40％-70％B)纯化，以提供获得呈固体的化合物1.02(23mg，0.045mmol，27％产率)。LC-MS(m/z)：505.0[M+H]⁺，RT＝1.454min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.68(d，J＝7.2Hz，1H)，8.49(s，1H)，8.01(s，1H)，7.98-7.93(m，2H)，7.91(s，1H)，7.69-7.65(m，1H)，7.58(d，J＝8.1Hz，2H)，7.54(d，J＝1.7Hz，2H)，7.38(s，1H)，6.83(d，J＝7.5Hz，1H)，3.43(s，3H)，1.39(s，9H)。

实例1-03：

5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸(1.03)

将1.02(550mg，1.1mmol)吸收于DCM(5.0mL)中。将溶液冷却至0℃并添加TFA(5.0mL)。将混合物在室温下搅拌6h，并将挥发物在真空中去除。将所得固体用Et₂O洗涤并通过HPLC(Kinetex EVO，150mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经2min 15％-25％B，经5min 25％-40％B)纯化，以提供呈固体的1.03(190mg，0.42mmol，39％)。LC-MS(m/z)：449.05[M+H]⁺，RT＝1.37min。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.69(d，J＝7.2Hz，1H)，8.48(s，1H)，8.03-7.92(m，3H)，7.91-7.82(m，2H)，7.56(d，J＝8.1Hz，2H)，7.50(d，J＝3.1Hz，2H)，7.39(s，1H)，6.88(dd，J＝7.1，1.7Hz，1H)，3.42(s，3H)。

实例1-04：

2-(甲硫基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.04)

向烧瓶中装入1.03(0.1g，0.22mmol)、DMF(1mL)、DIPEA(0.037mL)、3-(甲硫基)丙烷-醇(7mg)和HATU(33mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min20％-30％B，经7min 30％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.04(12mg，0.037mmol，18％)。LC-MS(m/z)：537.0[M+H]⁺，RT＝1.41min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.40(dd，J＝7.3，0.9Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.96-7.88(m，2H)，7.77(d，J＝2.7Hz，1H)，7.65-7.60(m，1H)，7.42(d，J＝8.5Hz，1H)，7.36-7.30(m，2H)，7.14(dd，J＝8.5，2.7Hz，1H)，6.94(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.46(bs，1H)，5.86(bs，1H)，4.46(t，J＝6.3Hz，2H)，3.56(s，3H)，2.61(t，J＝7.1Hz，2H)，2.11(s，3H)，2.05(p，J＝6.8Hz，2H)。

实例1-05：

异丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.05)

向烧瓶中装入1.03(50mg，0.111mmol)、DMF(1mL)、DIPEA(0.1mL)、2-甲基丙醇(35mg)和HATU(84mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min10％-20％B，经7min 20％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.05(15mg，0.037mmol，30％)。LC-MS(m/z)：505.0[M+H]⁺，RT＝1.47min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.39(d，J＝7.2Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.98-7.89(m，2H)，7.74(d，J＝2.7Hz，1H)，7.64(d，J＝1.7Hz，1H)，7.44(d，J＝8.5Hz，1H)，7.36-7.30(m，2H)，7.16(dd，J＝8.5，2.8Hz，1H)，6.93(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.51(bs，1H)，6.03(bs，1H)，4.11(d，J＝6.5Hz，2H)，3.56(s，3H)，2.03(dq，J＝13.4，6.8Hz，1H)，0.96(d，J＝6.7Hz，6H)。

实例1-06：

2-甲氧基-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.06)

在0℃下，向含有1.03(70mg，0.16mmol)和DMF(1.5mL)的混合物的烧瓶中装入K₂CO₃(64mg)和甲基2-溴乙酸酯(48mg)。将混合物在80℃下搅拌2h。冷却至室温后，将混合物用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min 10％-20％B，经7min 20％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.06(16mg，0.030mmol，12％)。LC-MS(m/z)：521.0[M+H]⁺，RT＝0.768min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.43(dd，J＝7.3，1.0Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.98(d，J＝2.7Hz，1H)，7.95-7.88(m，2H)，7.59-7.54(m，1H)，7.41(d，J＝8.5Hz，1H)，7.29-7.26(m，2H)，7.11(dd，J＝8.6，2.7Hz，1H)，7.05-6.99(m，1H)，6.62(bs，1H)，5.89(bs，1H)。4.90(s，2H)，3.81(s，3H)，3.57(s，3H)。

实例1-07：

噻唑-5-基甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.07)

向烧瓶中装入1.03(0.1g，0.222mmol)、DMF(2mL)、DIPEA(0.037mL)、噻唑-5-基甲醇(7mg)和HATU(33mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Gemini NX，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经2min20％-30％B，经7min 30％-45％B)纯化，以提供呈固体的1.07(20mg，0.036mmol，17％)。LC-MS(m/z)：549.9[M+H]⁺，RT＝0.66min。¹HNMR(400MHz，氯仿-d)δ8.86(s，1H)，8.37(dd，J＝7.3，0.9Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.97(s，1H)，7.93-7.87(m，2H)，7.71(d，J＝2.7Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.42(d，J＝8.5Hz，1H)，7.38-7.31(m，2H)，7.15(dd，J＝8.6，2.7Hz，1H)，6.88(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，5.57(s，2H)，3.53(s，3H)。

实例1-08：

2-吗啉代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.08)

在0℃下，向烧瓶中装入1.03(160mg，0.36mmol)、DMF(2mL)、DIPEA(0.130mg)和HATU(270mg)。在20min后，添加4-(2-羟基乙基)吗啉(140mg)。将混合物在室温下搅拌4h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Waters Xbridge，150mm×21.2mm，14mL/min，A＝在水中的0.02％NH₄OH，B＝MeCN，经2min 10％-20％B，经7min20％-40％B)纯化，以提供呈固体的1.08(35mg，0.0062mmol，17％)。LC-MS(m/z)：562.3[M+H]⁺，RT＝1.28min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)68.37(d，J＝7.6，1.0Hz，1H)，8.15(s，1H)，7.90(d，J＝8.4Hz，2H)7.73(d，J＝2.4Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.40(d，J＝8.8Hz，1H)，7.31(d，J＝8.4Hz，1H)，7.25-7.10(m，1H)，7.95-7.91(m，1H)，4.46(t，J＝6.0Hz，2H)，3.65(t，J＝4.84Hz，4H)，3.53(s，3H)，2.71(t，J＝6.0Hz，2H)，2.50(t，J＝4.4Hz，4H)。

实例1-09：

乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.09)

在0℃下，向含有1.03(50mg，0.111mmol)和DMF(1.5mL)的混合物的烧瓶中装入K₂CO₃(46mg)和碘乙烷(34mg)。将混合物搅拌12h，然后用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min 10％-20％B，经7min 20％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.09(12mg，0.025mmol，23％)。LC-MS(m/z)：476.9[M+H]⁺，RT＝1.1min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.39(dd，J＝7.3，1.0Hz，1H)，8.16(s，1H)，7.96-7.89(m，2H)，7.77(d，J＝2.7Hz，1H)，7.64-7.58(m，1H)，7.41(d，J＝8.6Hz，1H)，7.30(d，J＝8.4Hz，2H)，7.12(dd，J＝8.5，2.8Hz，1H)，6.95(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.45(bs，1H)，5.62(bs，1H)，4.41(q，J＝7.2Hz，2H)，3.56(s，3H)，1.39(t，J＝7.1Hz，3H)。

实例1-10：

2，2，2-三氟乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.10)

向烧瓶中装入1.03(100mg，0.222mmol)、DMF(1mL)、DIPEA(0.037mL)、2，2，2-三氟乙烷-1-醇(7mg)和HATU(33mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Waters Xbridge，150mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.05％TFA，B＝MeCN，经2min 25％-35％B，经6min 35％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.10(20mg，0.037mmol，18％)。LC-MS(m/z)：530.9[M+H]⁺，RT＝1.394min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.39(dd，J＝7.2，0.9Hz，1H)，8.18(s，1H)，7.92-7.86(m，2H)，7.77(d，J＝2.7Hz，1H)，7.68(s，1H)，7.45(d，J＝8.6Hz，1H)，7.42-7.35(m，2H)，7.22(dd，J＝8.6，2.8Hz，1H)，6.86(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.39(bs，2H)，4.70(q，J＝8.2Hz，2H)，3.55(d，J＝1.3Hz，3H)。

实例1-11：

2-甲氧基乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.11)

向烧瓶中装入1.03(50mg，0.111mmol)、DMF(1mL)、DIPEA(0.10mL)、2-甲氧基乙烷-1-醇(16mg)和HATU(84mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min20％-30％B，经8min 30％-45％B)纯化，以提供呈固体的1.11(20mg，0.039mmol，40％)。LC-MS(m/z)：506.9[M+H]⁺，RT＝0.653min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.41(d，J＝7.3Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.96-7.88(m，2H)，7.83(d，J＝2.7Hz，1H)，7.57(d，J＝1.5Hz，1H)，7.40(d，J＝8.5Hz，1H)，7.29(s，2H)，7.09(dd，J＝8.6，2.7Hz，1H)，6.99(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.58(bs，1H)，5.61(bs，1H)，4.62-4.46(m，2H)，3.82-3.70(m，2H)，3.56(s，3H)，3.40(s，3H)。

实例1-12：

2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.12)

在0℃下，向含有1.03(100mg，0.22mmol)和DMF(1.5mL)的混合物的烧瓶中装入K₂CO₃(92mg)和甲基2-溴-N，N-二甲基乙酰胺(74mg)。将混合物在80℃下搅拌2h。冷却至室温后，将混合物用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，18mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min 10％-20％B，经8min 20％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.12(16mg，0.030mmol，14％)。LC-MS(m/z)：533.9[M+H]⁺，RT＝0.380min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.45(dd，J＝7.3，1.0Hz，1H)，8.17(s，1H)，8.12(d，J＝2.7Hz，1H)，8.01-7.94(m，2H)，7.50-7.46(m，1H)，7.35(d，J＝8.5Hz，1H)，7.23-7.16(m，2H)，7.10(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，7.05-6.97(m，1H)，5.03(s，2H)，3.57(s，3H)，3.09(s，3H)，3.02(s，3H)。

实例1-13：

异丙基5-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氯苯甲酸酯(1.13a)

向异丙基5-氨基-2-氯苯甲酸酯(1.0g，4.7mmol)在THF(30mL)和水(7mL)中的溶液中添加Boc₂O(3.1g)和K₂CO₃(1.9g)。将混合物搅拌16h，然后将挥发物在真空下去除。将所得水溶液用EtOAc萃取，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化以提供1.13a(1.4g，4.46mmol，95％产率)。LC-MS(m/z)：331.7.1[M+NH₄]⁺，RT＝0.98min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ10.19(s，1H)，8.42(d，J＝9.1Hz，1H)，7.96(d，J＝2.6Hz，1H)，7.44(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，3.92(s，3H)，1.52(s，10H)。

异丙基5-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-2-氯苯甲酸酯(1.13b)

向烧瓶中装入1.13a(1.4g，4.5mmol)和DMF(22mL)并且在冰浴中冷却。分批添加60％NaH(0.25g)并且将混合物搅拌30min。添加碘甲烷(0.7mL)并且将烧瓶温热过夜。将混合物用EtOAc稀释，用水、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，并浓缩以给出1.13b(1.463g，4.46mmol，100％产率)。LC-MS(m/z)：230.1[M+H]⁺，RT＝1.17min。

异丙基2-氯-5-(甲基氨基)苯甲酸酯(1.13c)

将装有1.13b(90mg，0.28mmol)和DCM(212μL)的小瓶在冰浴中冷却。添加TFA(212μL)并将混合物搅拌30min。将挥发物在真空下去除，并将所得残余物1.13c(0.275mmol，假定的定量产率)不经纯化使用。LC-MS(m/z)：228.2[M+H]⁺，RT＝0.85min。

异丙基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.13d)

将3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(67mg，0.275mmol)在DCM(0.917mL)中的溶液用草酰氯(26μL)处理，然后用DMF(3.19μL)处理。将所得溶液搅拌20min。添加NEt₃(0.096ml)，随后添加在1mL DCM中的1.13c(63mg)。在3h后，将混合物在EtOAc与水之间分配。分离层，并且将水层用EtOAc萃取。将合并的有机物经Na₂SO₄干燥、过滤并浓缩以提供1.13d(0.28mmol，假定的定量)，将其不经纯化使用。LC-MS(m/z)：258.1[M+H]⁺，RT＝0.62min。

异丙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.13)

向5mL微波小瓶中装入在二噁烷(3.5mL)/水(0.692mL)中的1.13d(187mg，0.415mmol)、(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(103mg)、PdCl₂(dppf)(61mg)和K₃PO₄(264mg)。将氛围用N₂吹扫10min。然后将小瓶在100℃微波中加热10min。将混合物过滤并浓缩。将所得残余物通过HPLC(Sunfire Prep C18，30×100mm，60mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经4min 30％B，经20min 30％-70％B，经1min 70％-95％B)纯化，以提供呈固体的1.13(7.3mg，0.015mmol，3.5％)。LC-MS(m/z)：491.2[M+H]⁺，RT＝0.84min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)68.69(d，J＝1.8Hz，1H)，8.51(d，J＝7.2Hz，1H)，8.27(s，1H)，8.12(d，J＝8.2Hz，2H)，8.02(s，1H)，7.84(dd，J＝8.6，2.1Hz，1H)，7.56(d，J＝8.2Hz，2H)，7.38(s，1H)，6.78(d，J＝7.2Hz，1H)，3.96(s，3H)，3.64(s，3H)。

实例1-14：

外消旋-1-((乙氧基羰基)氧基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.14)

向含有1.03(50mg，0.111mmol)和DMF(2.0mL)的混合物的烧瓶中装入K₂CO₃(30mg)、NaI(2mg)和1-氯乙基乙基碳酸酯(35mg)。将混合物在80℃下搅拌2h。冷却后，将混合物用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Kinetex EVO C18，155mm×19mm，20mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经3min 20％-40％B，经7min40％-70％B)纯化，以提供呈固体的1.14(13mg，0.023mmol，20％)。LC-MS(m/z)：565.3[M+H]⁺，RT＝1.358min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.63(d，J＝7.2Hz，1H)，8.44(s，1H)，8.00(s，1H)，7.95(t，J＝1.9，1.9Hz，1H)，7.93-7.88(m，2H)，7.85(s，1H)，7.82-7.77(m，1H)，7.69-7.64(m，1H)，7.54-7.48(m，2H)，7.37(s，1H)，6.89-6.84(m，1H)，6.80(q，J＝5.4Hz，1H)，4.09(qd，J＝7.1，1.8Hz，2H)，3.43(s，3H)，1.50(d，J＝5.4Hz，3H)，1.15(t，J＝7.1Hz，3H)。

实例1-15：

外消旋-(四氢呋喃-2-基)甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.15)

向烧瓶中装入1.03(50mg，0.111mmol)、DMF(1mL)、DIPEA(0.10mL)、(四氢呋喃-2-基)甲醇(25mg)和HATU(84mg)。将混合物搅拌12h，用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Zorbax C18，150mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经2min 30％-40％B，经8min 40％-60％B)纯化，以提供呈固体的1.15(20mg，0.037mmol，39％)。LC-MS(m/z)：533.0[M+H]⁺，RT＝0.906min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.43(dd，J＝7.3，0.9Hz，1H)，8.17(s，1H)，7.98-7.90(m，2H)，7.86(d，J＝2.7Hz，1H)，7.53(t，J＝1.4Hz，1H)，7.40(d，J＝8.5Hz，1H)，7.27(s，2H)，7.09(dd，J＝8.5，2.7Hz，1H)，7.03(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.90(bs，1H)，6.52(bs，1H)，4.47(dd，J＝11.2，2.8Hz，1H)，4.36-4.22(m，2H)，3.92-3.77(m，2H)，2.22-2.20(m，3H)，1.80-1.66(m，1H)。

实例1-16：

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.16)

向化合物1.01d(14.4g，34.1mmol)在THF(360mL)中的悬浮液中添加(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(8.6g)、Et₃N(14.3mL)和H₂O(67mL)，将混合物脱气并用N₂吹扫三次。添加PdCl₂(dtbpf)(222mg)，将混合物在53℃下搅拌3h。将反应混合物用EtOAc和水稀释并过滤。分离层，将有机层经Na₂SO₄干燥、过滤，并去除部分挥发物。将所得浆料过滤以收集固体。将固体溶解于EtOH和EtOAc中，用Pd清除树脂搅拌，过滤并完全浓缩。将固体溶解于热EtOAc(150mL)中并缓慢冷却。收集固体以提供呈黄色固体的1.16(10.g，21.mmol，61％产率)。LC-MS(m/z)：477.0[M+H]⁺，RT＝0.691min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.33-8.25(m，1H)，8.06(s，1H)，7.80-7.75(m，2H)，7.71(d，J＝2.80Hz，1H)，7.52(d，J＝0.80Hz，1H)，7.32(d，J＝8.80Hz，1H)，7.24-7.17(m，3H)，7.04(dd，J＝2.80，8.40Hz，1H)，6.83(dd，J＝2.00，7.20Hz，1H)，6.39(br s，1H)，3.92-3.82(m，3H)，3.51-3.40(m，3H)，3.00(d，J＝5.20Hz，3H)。

实例1-17：

叔丁基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.17)

在氩气下，向(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(170mg)和1.02c(300mg，0.645mmol)在9∶1二噁烷∶水(10mL)中的溶液中添加Cs₂CO₃(0.628)。添加PdCl₂(dppf)(52mg)。将混合物在80℃下搅拌3h。将反应混合物倾倒入水中并用EtOAc萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(12g SiO₂，在DCM中的2％-3％MeOH)纯化以提供获得呈固体的化合物1.17(240mg，0.463mmol，72％产率)。LC-MS(m/z)：519.0[M+H]⁺，RT＝1.523min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.68(d，J＝7.2Hz，1H)，8.47(d，J＝8.8Hz，2H)，7.95-7.87(m，3H)，7.70-7.65(m，1H)，7.59(d，J＝8.1Hz，2H)，7.53(d，J＝1.9Hz，2H)，6.88-6.77(m，1H)，3.43(s，3H)，2.81(d，J＝4.5Hz，3H)，1.39(s，9H)。

实例1-18：

2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸(1.18)

将1.17(130mg，0.25mmol)吸收于DCM(5.0mL)中。将溶液冷却至0℃并添加TFA(5.0mL)。将混合物在室温下搅拌6h，并将挥发物在真空中去除。将所得固体用Et₂O洗涤并通过HPLC(Kinetex EVO，150mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.1％TFA，B＝MeCN，经2min 20％-30％B，经7min 30％-44％B)纯化，以提供呈固体的1.18(25mg，0.055mmol，22％)。LC-MS(m/z)：463.15[M+H]⁺，RT＝1.41min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.68(d，J＝7.2Hz，1H)，8.52-8.40(m，2H)，7.95-7.82(m，4H)，7.57(d，J＝8.0Hz，2H)，7.49(d，J＝3.2Hz，2H)，6.87(d，J＝7.2Hz，1H)，3.42(s，3H)，2.81(d，J＝4.4Hz，3H)。

实例1-19：

2-吗啉代乙基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.19)

向烧瓶中装入1.18(110mg，0.24mmol)和DMF(2mL)并冷却至0℃。添加DIPEA(92mg)和HATU(181mg)。20min后，添加4-(2-羟基乙基)吗啉(94mg)并将混合物经4h加温至室温。将混合物用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过HPLC(Gemini，150mm×21.2mm，2μ，18mL/min，A＝在水中的0.02％NH₄OH，B＝MeCN，经2min 10％-20％B，经7min 20％-50％B)纯化，以提供呈固体的1.18(1.4mg，0.024mmol，11％)。LC-MS(m/z)：576.3[M+H]⁺，RT＝1.48min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δδ8.68(d，J＝3.6Hz，1H)，8.50-8.48(m，2H)，7.92-7.88(m，2H)，7.79(s，1H)，7.58-7.57(m，3H)，6.85-6.83(m，1H)，4.30(t，J＝5.6Hz，2H)，3.48-3.46(m，2H)，3.43(s，3H)，2.81(d，J＝4.4Hz，3H)，2.33-2.32(m，4H)。

实例1-20：

(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.20)

向烧瓶中装入1.18(100mg，0.2mmol)和DMF(2mL)并冷却至0℃。添加DIPEA(80mg)和HATU(160mg)。20min后，添加4-(羟基甲基)-5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮(80mg)并将混合物经16h加温至室温。将混合物用冰水稀释并用EtOAc萃取。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩。将残余物通过HPLC(Gemini，150mm×21.2mm，2μ，20mL/min，A＝水，B＝MeCN，经2min 35％-45％B，经6min 45％-55％B)纯化，以提供呈固体的1.20(15mg，0.002mmol，12％)。LC-MS(m/z)：575.05[M+H]⁺，RT＝1.47min。

实例1.21：甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(2-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.21)

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(2-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.21)

向2打兰小瓶中添加1.01d(0.025g，0.059mmol)，随后添加(4-氨基甲酰基-2-甲基苯基)硼酸(13mg)、PdCl₂(dtbpf)(1.9mg)、2-MeTHF(0.5mL)、水(0.084mL)和NEt₃(0.025mL)。将小瓶密封并加热至65℃过夜。冷却后，将混合物在EtOAc与水之间分配。分离层，并且将水层用EtOAc萃取两次。将合并的有机物经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将所得油状物通过HPLC(Sunfire B-9m-1050，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化以提供呈黄色固体的1.21(6.9mg，0.1mmil，19％)。LC-MS(m/z)：477.3[M+H]⁺，RT＝0.75min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ8.72(dd，J＝7.2，0.9Hz，1H)，8.23(s，1H)，7.98(s，1H)，7.84(dd，J＝11.3，2.3Hz，2H)，7.75(dd，J＝7.9，1.9Hz，1H)，7.55(d，J＝8.5Hz，1H)，7.47(dd，J＝8.6，2.7Hz，1H)，7.36(d，J＝11.1Hz，2H)，7.06(d，J＝7.9Hz，1H)，6.93(dd，J＝7.2，1.9Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.40(s，4H)，2.19(s，3H)。

实例1.22：甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(3-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.22)

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(3-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.22)

向烧瓶中添加1.01d(80mg，0.189mmol)、N-2-二甲基-4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基)苯甲酰胺(62.5mg)、THF(2mL)、水(1mL)、NEt₃(0.079mL)和PdCl₂(dtbpf)(24.mg)。将混合物用氮气吹扫，将小瓶密封然后加热至100℃持续1h。将混合物过滤、浓缩、并通过HPLC(Sunfire B-9m-1050，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化以提供呈固体的1.22(12mg，0.019mmol，10％)。HPLC-MS(m/z)：491.1[M+H]⁺，RT＝5.69min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.67(d，J＝7.3Hz，1H)，8.42(s，1H)，8.17(d，J＝4.7Hz，1H)，7.92-7.84(m，2H)，7.53(d，J＝2.3Hz，2H)，7.43-7.33(m，2H)，7.33-7.26(m，1H)，6.86(dd，J＝7.2，1.7Hz，1H)，3.81(s，3H)，2.78(d，J＝4.6Hz，3H)，2.41(s，3H)。

实例1.23：甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.23)

甲基5-(3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.23a)

向3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(500mg，2.1mmol)在DCM(8mL)中的溶液中逐滴添加草酰氯(290mg)，随后逐滴添加DMF(3滴)。将混合物搅拌1h，然后冷却至0℃。添加DIPEA(804mg)，随后添加甲基5-氨基-2-氯苯甲酸酯(501mg)，并且将混合物搅拌30min。浓缩反应混合物以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO₂，0％至80％庚烷/EtOAc)纯化以提供1.23a(703mg，1.72mmol，83％产率)。LC-MS(m/z)：408.2[M+H]⁺，RT＝1.06min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ10.82(s，1H)，8.89(d，J＝7.1Hz，1H)，8.37-8.31(m，3H)，8.07-8.01(m，1H)，7.62(d，J＝9.0Hz，1H)，7.46(d，J＝7.2Hz，1H)，3.91(d，J＝4.5Hz，3H)。

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(1.23)

向小瓶中装入在THF(0.82ml)/水(0.41ml)中的1.23a(50mg，0.122mmol)、(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(28mg)、PdCl₂(dtbpf)(8mg)和NEt₃(37mg)。将氛围用N₂吹扫。将小瓶在65℃下加热15min。将混合物冷却，并且用EtOAc洗涤固体，随后溶解于DMF中并经硅藻土过滤。将溶液用EtOAc稀释，用盐水洗涤两次，经MgSO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Sunfire B-9m-3070，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化以产生呈固体的1.23(2.7mg，0.047mmol，4％)。LC-MS(m/z)：449.3[M+H]+，RT＝0.81min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ10.82(s，1H)，8.92(d，J＝7.2Hz，1H)，8.67(d，J＝1.5Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.33(d，J＝2.7Hz，1H)，8.09-8.02(m，3H)，7.91(d，J＝8.3Hz，2H)，7.63(d，J＝8.7Hz，1H)，7.46(dd，J＝7.2，1.9Hz，1H)，7.40(s，1H)，3.91(s，3H)，3.31(s，1H)，2.56(s，1H)。

实例1.24：甲基2-氯-5-(3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯

甲基2-氯-5-(3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(1.24)

在惰性气氛下，向小瓶中装入1.23a(50mg，0.122mmol)、P(t-Bu)₃Pd G2(1.567mg)和(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(35.1mg)。添加叔戊醇(1mL)、水(173μl)和NEt₃(51.2μl)。将混合物加热至60℃持续1h，然后浓缩。将残余物通过HPLC(Sunfire B-9m-2060，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化以产生呈固体的1.24(16.5mg，0.028mmol，23％)。LC-MS(m/z)：463.3[M+H]⁺，RT＝0.83min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ10.80(s，1H)，8.91(dd，J＝7.3，0.9Hz，1H)，8.65(dd，J＝2.0，1.0Hz，1H)，8.60(s，1H)，8.48(d，J＝4.8Hz，1H)，8.32(d，J＝2.6Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.8，2.7Hz，1H)，8.02-7.96(m，2H)，7.94-7.87(m，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，1H)，7.45(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，3.90(s，3H)，2.83(d，J＝4.5Hz，3H)。

实例1.25：甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.25)

甲基5-(甲基氨基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.25a)

在烘箱干燥的小瓶中，将甲基5-氨基-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(500mg，2.1mmol)溶解于DMF(5mL)中并冷却至0℃。以单份添加在油中的60％NaH(100mg)。10min后，逐滴添加碘甲烷(360mg)并将反应加温至室温。2h后，用EtOAc和NH₄Cl(饱和水溶液)稀释混合物。分离层，并且将水层用EtOAc萃取一次。将合并的有机物经MgSO₄干燥，过滤，浓缩。将所得残余物通过柱色谱法(SiO₂，0％至60％庚烷/EtOAc)纯化以提供1.25a(85mg，0.34mmol，16％)。LC-MS(m/z)：250.3[M+H]⁺，RT＝0.97min。

甲基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.25b)

向3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(82mg，0.341mmol)在DCM(3mL)中的溶液中添加草酰氯(45mg)，随后逐滴添加DMF(1滴)。将混合物搅拌1h，然后冷却至0℃。添加DIPEA(132mg)，随后添加1.25a(85mg)并且将混合物搅拌30min并浓缩以给出残余物。将残余物通过柱色谱法(SiO₂，0％至100％庚烷/EtOAc)纯化以提供1.25b(130mg，0.28mmol，83％产率)。LC-MS(m/z)：350.3[M+H]⁺，RT＝1.06min。¹H NMR(500MHz，氯仿-d)δ8.25(d，J＝7.3Hz，1H)，7.95(d，J＝2.4Hz，1H)，7.83(d，J＝2.8Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.28(q，J＝8.8，7.7Hz，3H)，6.67(d，J＝7.2Hz，1H)，3.94(d，J＝2.4Hz，3H)，3.56(d，J＝2.5Hz，3H)。

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.25)

向小瓶中装入在THF(0.9ml)/水(0.45ml)中的1.25b(65mg，0.138mmol)、(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(39mg)、PdCl₂(dtbpf)(9mg)和NEt₃(42mg)。将氛围用N₂吹扫。将小瓶在60℃下加热25min。将混合物用水稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机物过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Sunfire B-9m-1050，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化，以产生呈固体的1.25(42mg，0.066mmol，48％)。LC-MS(m/z)：513.3[M+H]⁺，RT＝0.95min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ8.70(d，J＝7.2Hz，1H)，8.48(s，1H)，8.04(d，J＝2.8Hz，1H)，8.00(s，1H)，7.97-7.92(m，2H)，7.88(s，1H)，7.67(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，7.55(d，J＝8.0Hz，2H)，7.48(d，J＝8.7Hz，1H)，7.36(s，1H)，6.92(d，J＝7.1Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.45(s，3H)。

实例1.26：甲基5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.26)

甲基5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯(1.26)

向小瓶中装入在THF(0.9ml)/水(0.45ml)中的1.25b(65mg，0.138mmol)、(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(42mg)、PdCl₂(dtbpf)(9mg)和NEt₃(42mg)。将氛围用N₂吹扫。将小瓶在60℃下加热25min。将混合物用水稀释并用EtOAc萃取3次。将合并的有机物过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Sunfire B-9m-2060，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化，以产生呈固体的1.26(48mg，0.075mmol，55％)。LC-MS(m/z)：527.3[M+H]⁺，RT＝0.99min。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.70(dd，J＝7.2，0.9Hz，1H)，8.46(d，J＝12.4Hz，2H)，8.04(d，J＝2.7Hz，1H)，7.90(dd，J＝10.3，3.6Hz，3H)，7.66(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，7.55(d，J＝8.1Hz，2H)，7.48(dd，J＝8.7，1.3Hz，1H)，6.92(dd，J＝7.2，1.8Hz，1H)，3.85(s，4H)，3.45(s，3H)，2.82(d，J＝4.4Hz，3H)。

实例1.27：甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氰基苯甲酸酯(1.27)

甲基2-氰基-5-(甲基氨基)苯甲酸酯(1.27a)

向微波小瓶中装入甲基2-氰基-5-氟苯甲酸酯(200mg，1.1mmol)、在THF(1.7mL)中的2.0M甲胺和DMA(1.1mL)。在130℃下，在微波中将混合物搅拌30min。将挥发物去除，并将残余物通过柱色谱法纯化以提供1.27a(160mg，0.84mmol，75％)。LC-MS(m/z)：191.1[M+H]⁺，RT＝0.65min。

甲基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氰基苯甲酸酯(1.27b)

将3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(60mg，0.25mmol)在DCM(2.5mL)中的溶液用草酰氯(95mg)和一滴DMF处理。在室温下将所得溶液搅拌一小时，然后浓缩并在高真空下短暂干燥。将残余物溶解于DCM(2.5mL)中。添加DIPEA(0.131mL)和1.27a(65mg)。将混合物搅拌3hr并且在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化以提供1.27b(62mg，0.150mmol，60％产率)。LC-MS(m/z)：413.0[M+H]⁺，RT＝0.83min。

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氰基苯甲酸酯(1.27)

向微波小瓶中装入1.27b(62.0mg，0.15mmol)、(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(37mg)、PdCl₂(dppf)(22mg)和K₃PO₄(96mg)、二噁烷(1.2mL)和水(250μl)。将小瓶密封，用N₂吹扫10min，然后置于100℃微波中20min。将混合物过滤并浓缩。将残余物通过HPLC(Sunfire B-9m-1050，75mL/min，在水中的0.1％TFA)纯化，以产生呈固体的1.27(27mg，0.06mmol，40％)。LC-MS(m/z)：454.5[M+H]⁺，RT＝0.68min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.37(dd，J＝7.3，0.9Hz，1H)，8.18(s，1H)，8.03(d，J＝2.3Hz，1H)，7.92-7.84(m，2H)，7.75-7.68(m，2H)，7.43-7.30(m，3H)，6.79(dd，J＝7.3，1.9Hz，1H)，6.24(s，1H)，5.74(s，1H)，4.01(s，3H)，3.59(s，3H)。

实例2.1：甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酰胺基)苯甲酸酯

甲基5-(3-溴-N-甲基咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(2.1a)

向烧瓶中装入3-溴咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酸(300mg，1.24mmol)、1.01c(240mg)和吡啶(10mL)。将烧瓶冷却至0℃并缓慢添加POCl₃(570mg)。去除冰浴。在30min处，将混合物倒入冰水中并将水层用DCM萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩，以提供足够干净以用于下一反应的2.1a(400mg，0.94mmol，76％)。LC-MS(m/z)：425.0[M+3]⁺，RT＝0.87min。

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酰胺基)苯甲酸酯(2.1)

向密封管中装入2.1a(200mg，0.472mmol)、(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(84mg)、二噁烷(4mL)和水(1mL)。添加CsF(143mg)，随后添加Pd(amphos)Cl₂(16mg)。将混合物在90℃下加热1.5h。将反应混合物冷却，用水淬灭并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。将残余物通过HPLC(LUNA Phenomenex，250mm×21.2mm，20mL/min，A＝在水中的0.02％TFA，B＝MeCN，经2min 20％-30％B，经6min30％-60％B)纯化，以提供呈固体的2.1(40mg，0.083mmol，17％)。LC-MS(m/z)：478.1[M+1]⁺，RT＝0.52min。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.88(s，2H)，8.69-8.50(m，1H)，8.21(s，1H)，8.05(d，J＝7.9Hz，2H)，7.89-7.72(m，3H)，7.45(s，2H)，3.80(s，3H)，3.44(s，3H)，2.84(d，J＝4.9Hz，3H)。

实例3.1：甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯

乙基吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酸酯(3.1a)

将1H-吡唑-5-甲醛(14.4g，150mmol)吸收于THF(150mL)中。添加DBU(5.71g)和乙基2-异氰基乙酸乙酯(17g)。将混合物在55℃下加热过夜，然后冷却至室温并去除挥发物。将粗材料通过快速柱色谱法(在庚烷中0至100％EtOAc)纯化以提供3.1a(13.5g，70.6mmol，47％)。LC-MS(m/z)：192.2[M+H]⁺，RT＝0.49min。¹H NMR(500MHz，氯仿-d)δ9.33(s，1H)，8.38(s，1H)，8.19(s，1H)，6.80(s，1H)，4.49(q，J＝7.5Hz，2H)，1.46(t，J＝7.2Hz，2H)。

乙基3-溴吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酸酯(3.1b)

将3.1a(6.8g，36mmol)溶解于DCM(178mL)中。添加NBS(8.2g)。搅拌2h后，添加另外的NBS(4g)。2h后，用饱和硫代硫酸酯水溶液淬灭反应。分离层，并将有机层用饱和碳酸氢盐水溶液洗涤、经Na₂SO₄干燥、过滤并浓缩以提供3.1b(9.5g，35mmol，98％)。LC-MS(m/z)：272.1[M+H]⁺，RT＝0.67min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ9.25(d，J＝1.4Hz，1H)，8.32(d，J＝1.4Hz，1H)，8.15(s，1H)，4.50(q，J＝7.1Hz，3H)，1.46(t，J＝7.1Hz，4H)。

3-溴吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酸(3.1c)

将3.1b(9.45g，35.0mmol)溶解于甲醇(175mL)中。缓慢添加2.0M NaOH(87mL)并将混合物搅拌45min。用10％HCl水溶液将反应酸化至约2的pH，然后用EtOAc分配。将混合物通过布氏(Buechener)漏斗过滤以收集沉淀。分离滤液并浓缩有机层。将合并的固体在真空烘箱中干燥以提供3.1c(7.26g，30.0mmol，86％)。LC-MS(m/z)：242.1[M+H]⁺，RT＝0.47min。¹HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ9.62(d，J＝1.4Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.15(d，J＝1.4Hz，1H)。

甲基5-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯(3.1d)

将3.1c(632mg，2.61mmol)在DCM(2.6mL)中的溶液用草酰氯(251μl)和DMF(10μl，0.131mmol)处理。将所得溶液搅拌30min。添加NEt₃(909μL)，随后添加在1mL DCM中的1.01c(616mg)。将混合物搅拌3h，然后用水和EtOAc分配。将水层用EtOAc萃取。将合并的有机物经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩并通过快速柱色谱法纯化以提供3.1a(630mg，1.5mmol，57.0％产率)，将其无需进一步纯化用于下一步骤。LC-MS(m/z)：423.2[M+1]⁺，RT＝0.88min。

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯(3.1)

向小瓶中装入(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(202mg)、3.1d(342mg，0.807mmol)、THF(8.5mL)、水(1.6mL)和NEt₃(338μl)，然后用N₂吹扫。添加PdCl₂(dtbpf)(10.52mg)。将混合物在53℃下搅拌8h。添加另外的(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)硼酸(100mg)和PdCl₂(dtbpf)(30mg)并将混合物再加热10min。将混合物用EtOAc稀释，用水、盐水洗涤，并浓缩。将残余物通过快速柱色谱法然后通过HPLC(氨基柱C3_20-25，CO₂/MeOH，80mL/min)纯化，以给出呈固体的3.1(230mg，0.476mmol，59.0％产率)。LC-MS(m/z)：478.4[M+1]⁺，RT＝0.86min。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ9.43(s，1H)，8.79(s，1H)，8.52(q，J＝4.4Hz，1H)，8.31(d，J＝1.5Hz，1H)，8.00-7.94(m，2H)，7.86-7.79(m，3H)，7.50(d，J＝10.8Hz，2H)，3.80(s，3H)，3.46(s，3H)，2.84(d，J＝4.5Hz，3H)。

实例4.1：甲基2-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-5-氯苯甲酸酯(4.1)

甲基2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-氯苯甲酸酯(4.1a)

将甲基2-氨基-5-氯苯甲酸酯(2.0g，11mmol)吸收于DCM(72mL)中。依次添加Boc₂O(3.53g)和DMAP(0.1g)。将混合物搅拌过夜，浓缩并通过快速柱色谱法纯化以给出4.1a(1.2g，4.3mmol，40％产率)。LC-MS(m/z)：186.1[M+H]⁺，RT＝1.11min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ10.19(s，1H)，8.42(d，J＝9.1Hz，1H)，7.96(d，J＝2.6Hz，1H)，7.44(dd，J＝9.1，2.6Hz，1H)，3.92(s，3H)，1.52(s，10H)。

甲基2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-5-氯苯甲酸酯(4.1b)

将4.1a(1.2g，4.2mmol)吸收于DMF(28.0ml)中并将烧瓶在冰浴中冷却。添加60％NaH(0.25g)。搅拌30min后，添加碘甲烷(0.39mL)并将烧瓶加温至室温过夜。将混合物用EtOAc稀释，用水、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，并浓缩以给出4.1b(1.3g，4.2mmol，99％产率)。LC-MS(m/z)：200.1[M+H-(t-BuO₂C)]⁺，RT＝0.92min。

甲基5-氯-2-(甲基氨基)苯甲酸酯(4.1c)

将4.1b(1.2g，4.0mmol)吸收于DCM(4.0mL)中并将烧瓶在冰浴中冷却。添加TFA(3.1mL)。30min后，在真空下去除挥发物以提供呈TFA盐的4.1c(0.80g，4.0mmol，100％)，将其不经纯化使用。LC-MS(m/z)：200.1[M+H]⁺，RT＝0.86min。

甲基2-(3-溴-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-5-氯苯甲酸酯(4.1d)

将3-溴吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酸(0.96g，4.0mmol)在DCM(40.0mL)中的溶液用草酰氯(1.5g)和若干滴DMF处理。将所得溶液搅拌1h，然后浓缩并在高真空下短暂干燥。将所得酰基氯用DCM(40mL)稀释，并向此溶液中添加4.1c(0.80g)和DIPEA(2.6g)。将所得混合物搅拌12h。将溶剂在减压下去除，并将残余物通过硅胶色谱法纯化以提供4.1d(1.2g，2.8mmol，71％)。LC-MS(m/z)：422.l[M+1]⁺，RT＝0.87min。

甲基2-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-5-氯苯甲酸酯(4.1)

在微波小瓶中，4.1d(0.79g，1.9mmol)、(4-氨基甲酰基苯基)硼酸(0.46g)、PdCl₂(dtbPf)(0.27g)和K₃PO₄(1.2g)吸收于二噁烷(15mL)和水(3.1mL)中。将小瓶用N₂吹扫10min，然后在100℃微波中加热10min。将混合物过滤，浓缩，并通过HPLC(氨基柱C3_20-25，CO₂/MeOH，80mL/min)纯化以产生呈黄色固体的4.1(650mg，1.4mmol，75％产率)。LC-MS(m/z)：463.2[M+1]⁺，RT＝0.76min。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.69(d，J＝1.8Hz，1H)，8.51(d，J＝7.2Hz，1H)，8.27(s，1H)，8.12(d，J＝8.2Hz，2H)，8.02(s，1H)，7.84(dd，J＝8.6，2.1Hz，1H)，7.56(d，J＝8.2Hz，2H)，7.38(s，1H)，6.78(d，J＝7.2Hz，1H)，3.96(s，3H)，3.64(s，3H)。

生物学测定

本发明的用于抑制宿主细胞中的寄生虫血症的方法中使用的化合物的活性可以通过以下的测定来评估。应当理解的是这些测定法说明了本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。

培养并维持宿主细胞和隐孢子虫寄生虫

在37℃和5％CO₂下在潮湿培养箱中，将人类回盲肠结肠直肠腺癌细胞(HCT-8[HRT-18]ATCC，CCL-34)维持在完全生长培养基(RPMI-1640培养基(吉布科公司(Gibco))，11875)，补充有10％热灭活的马血清(吉布科公司)，26050)、1X MEM非必需氨基酸(吉布科公司)，11140)、10mM HEPES(吉布科公司)，15630)、100单位/mL青霉素、和100单位/mL链霉素)中的T-175烧瓶(康宁公司(Corning)，431080)中。将培养物每周传代两次，使用10mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)(吉布科公司，20012)进行洗涤，并将3-5mL/T-175烧瓶的TrypLE Express酶(吉布科公司(Gibco)，12604)解离黏附细胞。

将从亚利桑那大学斯特林实验室(Sterling Laboratory，UniversityofArizona)购买的小球隐孢子虫卵囊(Iowa分离株)用不连续蔗糖和氯化铯离心梯度从被感染的小牛粪便中纯化，并储存在含有0.01％吐温20、100单位/mL青霉素和100单位/mL庆大霉素的PBS溶液中。

人隐孢子虫卵囊从塔夫茨大学卡明斯兽医学院(Tuffs University CummingsSchool of Veterinary Medicine(由Dr.Saul Tzipori赞助))购买。人隐孢子虫卵囊从被感染的限菌小猪粪便中纯化，并储存在含有0.01％吐温-20、100单位/mL青霉素和100单位/mL庆大霉素的PBS溶液中。在感染实验中使用从脱落日起少于三月龄的小球隐孢子虫和人隐孢子虫卵囊。

脱囊和感染：脱囊和感染方案是按照既定的方法并进行了一些修改而制定的(Gut和Nelson，1999，Upton等人，1995，Bessoff等人，2013)。简言之，将卵囊在1X Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(吉布科公司，14025)中1mL的10mM盐酸中引发10分钟，伴随在37℃下在Eppendorf热混合仪中以1000rpm搅拌，然后通过在25℃下以13,000rpm离心3分钟用1mL室温非酸性1X HBSS洗涤两次。将引发的卵囊进一步在1x10⁶卵囊/μL的浓度下、在25℃下、在由以下组成的寄生虫感染培养基中脱囊10分钟：Leibovitz’s L-15培养基的预热和预充气的1∶1配制品(吉布科公司，11415)和UltraCULTURE培养基(龙沙公司(Lonza)，12-725F)，补充有2mM牛磺胆酸钠(西格玛公司(Sigma)，86339-1)、10％热灭活的马血清、和200μM L-抗坏血酸(西格玛公司，95210)。将HCT-8单层细胞按指定的感染复数(MOI)用脱囊的隐孢子虫感染。所有用于随后测定的稀释都在不含牛磺胆酸钠的寄生虫感染培养基中进行。使用C-Chip一次性血细胞计数器(纳恩泰公司(NanoEnTek)，DHC-N01)在显微镜下计数预脱囊的卵囊。

化合物和测定板制备：在稀释进源板之前，将化合物粉末溶解于净DMSO(飞世尔公司(Fisher)，D4121)至10mM并储存在4℃下。使用Microlab STAR液体处理器(汉密尔顿公司(Hamilton))来进行稀释以获得一式两份的含有从10mM起十点或八点三倍稀释液的化合物源板。在点样进测定板之前，将源板储存在4℃下。在施用前，将所有化合物源板平衡至室温。使用Echo声学液体处理器(LABCYTE公司，550)将来自源板的指定体积的化合物点样到测定板中，使得最终DMSO浓度小于0.5％。每个测定板指定数量的DMSO处理的阴性对照孔和研究充分的有效活性化合物在100nM下作为阳性对照。作为质量控制，所有阳性和阴性对照孔都用来计算每个板的Z’-值和信噪比(S∶N)。

通过基于致细胞病变效应(CPE)测定进行IC₅₀确定：

隐孢子虫属物种是感染肠上皮细胞的专性细胞内寄生虫，并且在寄生虫排出(parasite egress)时杀死宿主细胞。在患者中，已经证明隐孢子虫感染诱发由绒毛肠上皮细胞损失引起的严重绒毛萎缩。上皮细胞的损失是由快速的寄生虫侵袭/增殖/排出和促炎性的免疫应答两者造成的(Adams等人，1994，Griffiths等人，1994)。我们已经使用CellTiter-Glo试剂在C.spp感染的宿主细胞的生存力损失的HCT-8细胞中观察到连续的致细胞病变效应(CPE)。

按对小球隐孢子虫1∶2和对人隐孢子虫1∶4的MOI(宿主与寄生虫)，将在T-175烧瓶中汇合的HCT-8细胞直接感染脱囊的卵囊。在对照烧瓶中使用NucleoCounter(Chemometec公司，NC-100)来确定宿主细胞数。将感染的单层在37℃下孵育3小时，随后用10mL 1X PBS轻轻洗涤一次，之后用3-5mL的TrypLE解离。将感染的细胞沉淀重新悬浮在90％完全生长培养基和10％寄生虫感染培养基(不含牛磺胆酸钠)中。使用MultiDrop液体处理器(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，5840300)将2.5×10⁴批感染的HCT-8细胞以30μL的总孔体积接种在384孔板(格瑞那公司(Greiner)，789091)的每个孔中。在化合物施用前，将所有板在37℃下孵育24小时。使用Echo声学液体处理器(LABCYTE公司，550)将化合物从源板以各种浓度按每孔60nL点样，并且将处理进行48小时。化合物处理之后，在生物安全柜中将测定板平衡至室温一小时以最小化温度梯度效应。将细胞溶解并通过使用Multidrop添加20μL/孔的Cell-Titer Glo 2.0(普洛麦格公司(Promega)，G9243)来测量宿主细胞生存力。按0.1秒/孔的速率通过Clarity光度计(拜尔泰克公司(BioTek))测量发光读数。将原始数据文件输出并将结果表示为百分比刺激，其中100％刺激相当于活性对照孔的平均值，且0％刺激相当于DMSO处理的阴性对照孔的平均值。使用诺华股份有限公司软件来分析细胞生存力曲线。

测量选定的化合物在最小化人隐孢子虫和小球隐孢子虫两者的致细胞病变效应方面的有效性。结果报告在表II中，小球隐孢子虫在第一栏中[(Cp CPE EC₅₀(μM)]且人隐孢子虫在第四栏[(Ch CPE EC₅₀(μM)]。有效性范围为从无效到纳摩尔浓度。

通过高含量成像(HCI)测定进行IC₅₀确定：

感染和化合物处理：成像测定是按照既定的隐孢子虫属物种标记和体外感染模型并进行了一些修改而制定的(Bessoff等人，2013，Gut和Nelson，1999)。简言之，使用Multidrop Combi液体处理器(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，5840300)和标准管分注用容器(standard tube dispensing cassette)(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，24072670)，将2×10⁴HCT-8细胞/孔按20μL/孔接种进384孔平坦黑色透明底的OPERA测定板(格瑞那公司(Greiner)，789071-G)的完全生长培养基中，并且在37℃下孵育24小时。在寄生虫感染培养基中使用Multidrop将HCT-8细胞感染10μL/孔1×10⁴脱囊的小球隐孢子虫卵囊(宿主与寄生虫MOI为1∶0.5)或10μL/孔4×10⁴脱囊的人隐孢子虫卵囊(MOI1∶2)，并在37℃下孵育。感染后24小时，使用如上所述的Echo声学液体处理器(LABCYTE公司，550)将60nL化合物点样进每个孔，并将板在37℃下孵育48小时。

固定和标记：在化合物处理后，将细胞用PBS洗涤两次，在25℃下用40μL的4％多聚甲醛(电子显微镜科学公司(Electron Microscopy Sciences)，15710)固定在PBS中20分钟，并用PBS、随后用PBS-FT(PBS中含有1％胎牛血清和0.05％吐温-20的PBS)洗涤。为保证单层不被破坏，所有抽吸步骤的进行都允许15μL的剩余孔体积。将固定的细胞在25℃下透化并阻断PBS-FT持续30分钟。为了染色，将4μg/mL链霉亲和素缀合的Alexa Fluor 568(生命技术公司(Life Technologies)，S11226)与2μg/mL生物素化的毛苕子(Vicia villosa)凝集素(载体实验室公司(Vector Laboratories)，B-1235)在PBS-FT中混合，并在25℃下孵育1小时。将结合标记通过预平衡的注射器式过滤器(赛多利斯斯泰帝公司(SartoriusStedim)，16534-K)过滤。为标记细胞内寄生虫的生活期，将透化的细胞用20μL Alexa568-VVL在25℃下孵育1小时。将标记的细胞用PBS-FT洗涤，随后用PBS洗涤。最后，在检测前将HCT-8宿主细胞核用在PBS中稀释的5μM Draq-5(艾博抗公司(Abcam)，ab108410)复染色并储存。

检测：标记后，使用Opera QEHS(PerkinElmer^TM)将板成像。使用Nikon UPlan Apo物镜以10x成像。在每个孔中收集九个图像，覆盖超过80％的孔表面。将样品曝光于561nm和635nm激光线下以分别激发Alexa

598缀合的凝集素和DRAQ5^TM。激光功率选定为2250μW，曝光时间设置在800毫秒且焦点高度设置在5μm。在冷却的CCD照相机上收集荧光信号，这之前使发射光通过四频主二向色镜(405/488/561/635)和检测二向色镜(510)，随后通过发射光滤器600/40和690/50，以收集分别由标记的寄生虫和细胞核发射的光。

分析：使用写入

(PerkinElmer^TM)的定制分析脚本来分析图像。简言之，检测到细胞核，然后将获得的掩膜扩张以包含细胞质。下文中将这些对象称为细胞体。针对每个细胞体，测量了寄生虫通道收集的图像的平均信号。然后通过施加强度分界值将细胞分类为感染的细胞与未感染的细胞，且对每个孔计算细胞数和感染的细胞的百分比。使用阳性和阴性对照、使用‘R’来自动优化用于将细胞分类为感染的细胞与未感染的细胞的分界值(Team，2015)。简言之，将分界值设置成作为将Z’因子最大化的强度阈值(Zhang等人，1999)。将结果表示为百分比抑制，其中100％抑制相当于活性对照孔的平均值，且0％抑制相当于DMSO处理的阴性对照孔的平均值。用诺华股份有限公司内部软件(Helios软件应用程序，诺华生物医学研究所，未出版)，使用在以下参考文献中描述的方法来分析数据(Fomenko等人，2006，Kelly和Rice，1990，Normolle，1993，Sebaugh，2011)(Kahm等人，2010)。在手动处理以解决任何潜在的筛选模型或伪影，使用对照孔将每个孔的数据点归一化，使得无效被设置为0％且完全抑制被设置为-100％。然后将数据曲线拟合进Helios软件以计算导致只有50％细胞被感染的活性浓度。

将选定的化合物在小球隐孢子虫上的测定结果报告于表II，第二栏[Cp HCI IC₅₀(μM)]。选定的化合物展示出在预防宿主细胞感染中的亚微摩尔活性。

细胞毒性的确定

如前所述，确定针对人肝癌细胞系HepG2(ATCC#HB-8065)的细胞毒性(Manjunatha等人，2015)。简言之，将细胞按10⁵个细胞/孔的浓度接种，在37℃下孵育24h并暴露于两倍连续稀释的化合物5天。使用细胞增殖试剂盒II(英杰公司(Invitrogen))来监测细胞生存力。

将选定化合物的细胞毒性值报告在表II的第五栏中[HepG2 CC₅₀(μM)]。结果显示该化合物通常是安全的。

PI(4)K酶法测定

小球隐孢子虫磷脂酰肌醇4-激酶的杆状病毒表达和纯化：将小球隐孢子虫PI(4)K(cgd8_4500，1114氨基酸)的全长编码序列针对杆状病毒表达进行密码子优化、合成并使用BamHI和HindIII限制位点在具有氨基末端聚组氨酸标签的框内克隆进pFastBac-HTb(英杰公司10584-027)中。重组pFastBacHTb-CpPI(4)K杆粒克隆是通过在大肠杆菌DH10Bac(英杰公司10361-012)中的位点特异性转座来产生的。通过直接DNA测序来确认杆粒序列，以确认整个基因没有突变。杆粒分离、转染和选择重组病毒的后续步骤是根据制造商的方案进行的(Bac-to-Bac系统#10359，英杰公司)。

将培养在SF-900III无血清培养基中的SF9细胞在1/200(v/v)下用重组杆状病毒转染并在27℃下孵育72h。在离心后收集沉淀并将其重新悬浮在细胞裂解缓冲液(20mMTris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl，1mM DTT，20mM咪唑，0.01％Triton X-100和1×不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)04693116001))中。将细胞悬浮物通过超声处理裂解，并将澄清的上清液装载到1ml HisTrap亲和柱(GE医疗集团(GEHealthcare))上，该柱用缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH 7.5，300mM NaCl，1mM DTT，20mM咪唑，和1×不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物)预平衡。将该柱用缓冲液B(含有45mM咪唑的缓冲液A)洗涤并且将目的结合蛋白用缓冲液C(具有90mM咪唑的缓冲液A)洗脱。将含有CpPI(4)K的级分合并，用Amicon Ultra-15浓缩并通过凝胶过滤柱(Hi-Load 26/60Superdex 200，GE医疗集团)纯化，该柱用20mM Tris、pH 7.5、300mM NaCl、1mM DTT和1×不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物平衡。通过使用蛋白摩尔消光系数(ε_280nm＝133，810M^-1cm^-1)来确定经纯化的蛋白的浓度(Mw 132.39kda)。将等分试样快速冷冻在液氮中并立即储存在-80℃下。

PI(4)K酶法测定：CpPI(4)K酶法测定是如前所述并进行了一些修改而进行的(McNamara等人，2013)。简言之，将溶解在3％正辛基葡糖苷(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)10634425001)中的L-α-磷脂酰肌醇(阿凡提极地脂质公司(Avanti PolarLipids)840046)用作PI(4)K活性测定的脂质底物。使用Transcreener ADP₂ FP检测试剂盒(贝尔布鲁克实验室(BellBrook)3010)，在黑色固体384孔板(康宁公司(Corning)3575)中测定CpPI(4)K。最终测定体积是10μl且含有3nM分别构建在10mM Tris、pH 7.5、1mM DTT、3μM ATP、5mM Mn2+、0.05％Triton X-100和10μM磷脂酰肌醇/辛基葡糖苷中的CpPI(4)K。在室温下将酶反应进行50分钟，并通过添加10μl含有1×终止缓冲液(50mM HEPES、pH7.5、400mMNaCl、20mM EDTA、和0.02％Brij-35)的检测混合物、2nM AMP Alexa Fluor 633示踪剂、和20μg ml^-1ADP抗体来停止反应。将荧光偏振测量在Infinite M1000读板机(帝肯公司(Tecan))上进行，其中λex＝635nm且λem＝680nm(20-nm带宽)。使用Graphpad Prism软件来计算IC₅₀值。

这些化合物展示出亚微摩尔抑制值，因此是小球隐孢子虫PI(4)K酶的有效抑制剂。

将所得IC₅₀值总结于下表2中：+≥1μM；1μM＞++≥0.1μM；0.1μM＞+++

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应理解，本文描述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利、和专利申请都通过引用特此并入。

Claims (17)

1.一种根据式I的化合物，

或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中

P是0、1、2、或3；

Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、或Y⁶中的每一个独立地是C或N；

R¹、R²、R³或R⁴中的每一个独立地是氢或C_1-6烷基；

每个R⁵独立地选自由以下组成的组：氢、C_1-6烷基、氰基、-C(O)C_1-6烷基；卤代、卤代C_1-6烷基、和-S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶选自由以下组成的组：

a)氢，和

b)未经取代的或被独立地选自由以下组成的组的1-3个取代基取代的C_1-6烷基：

i)C_1-6烷氧基，

ii)卤代，

iii)硫代C_1-6烷基，

iv)未经取代的或被独立地选自由氧代和C_1-6烷基组成的组的1-3个取代基取代的C_4-6杂环烷基；

v)未经取代的或被1-3个C_1-6烷基取代基取代的C_5-6杂芳基；

vi)-C(O)R⁷，和

vii)-C(O)NR⁷R⁷，其中每个R⁷独立地是氢或C_1-6烷基。

2.如权利要求1所述的化合物，其中：

Y²和Y⁵是N，且Y¹、Y³、Y⁴、和Y⁶是C。

3.如权利要求1所述的化合物，其中：

Y³和Y⁵是N，且Y¹、Y²、Y⁴、和Y⁶是C。

4.如权利要求1所述的化合物，其中：

Y³是N，且Y¹、Y²、Y⁴、Y⁵、和Y⁶是C。

5.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式Ia：

6.如权利要求5所述的化合物，其中

R¹、R²和R³是氢，且R⁴是C_1-6烷基；。

7.如权利要求5所述的化合物，其中

R⁴是甲基。

8.如权利要求5所述的化合物，其中

R⁵是卤代。

9.如权利要求5所述的化合物，其中

R⁵是氯。

10.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：

甲基5-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-氯苯甲酸酯；

叔丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸；

2-(甲硫基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

异丁基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-甲氧基-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

噻唑-5-基甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-吗啉代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2，2，2-三氟乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-甲氧基乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯

异丙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

外消旋-1-((乙氧基羰基)氧基)乙基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

外消旋-(四氢呋喃-2-基)甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

叔丁基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸；

2-吗啉代乙基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

(5-甲基-2-氧代-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(2-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(3-甲基-4-(氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氯苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯；

甲基5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酸酯；

甲基5-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-2-氰基苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-6-甲酰胺基)苯甲酸酯；

甲基2-氯-5-(N-甲基-3-(4-(甲基氨基甲酰基)苯基)吡唑并[1，5-c]嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酸酯；和

甲基2-(3-(4-氨基甲酰基苯基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]吡啶-5-甲酰胺基)-5-氯苯甲酸酯。

11.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物能够抑制或调节隐孢子虫原生动物的活性。

12.如权利要求11所述的化合物，其中所述隐孢子虫原生动物是人隐孢子虫或小球隐孢子虫。

13.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

14.如权利要求13所述的所述药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。

15.一种用于治疗、抑制、改善或根除由隐孢子虫原生动物引起的隐孢子虫病的病理和/或症状的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的化合物或如权利要求13所述的组合物，其中所述施用可与第二药剂组合。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述隐孢子虫原生动物是人隐孢子虫或小球隐孢子虫。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述药剂是如权利要求1至12中任一项所述的化合物。