CN116355941A - 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 - Google Patents
一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116355941A CN116355941A CN202310624658.9A CN202310624658A CN116355941A CN 116355941 A CN116355941 A CN 116355941A CN 202310624658 A CN202310624658 A CN 202310624658A CN 116355941 A CN116355941 A CN 116355941A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ptuf
- tth
- corynebacterium glutamicum
- heat
- template
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf‑TTH_RS07495及其构建方法和应用，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf‑TTH_RS07495由谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf和嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf基因序列如SEQ NO.1所示，所述嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495序列如SEQ NO.2所示。本发明中的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf‑TTH_RS07495，可以使谷氨酸棒杆菌的热稳定性大大提高，增强菌株的耐热性，应用于工业化生产菌株中可以大大降低发酵过程中冷却水的能耗，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）是一类能够在高温环境下生存和繁殖的微生物，其生长的温度通常在60℃到80℃之间，嗜热栖热菌广泛存在于地球上各种高温环境中，例如火山口、地下热泉、海底黑烟团、深海热泉和油藏中等。嗜热栖热菌具有各种各样的耐热基因，这些基因可以帮助它们在高温环境下生存，目前对这些耐热基因的研究和应用还比较有限。
谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种重要的工业微生物，被普遍应用于氨基酸、有机酸、维生素等物质的工业化生产，通常情况下谷氨酸棒杆菌的培养温度一般在26℃～37℃，在炎热的夏天需要耗用大量循环水、冷冻水进行冷却，给工业化生产增加大量成本。研究提高谷氨酸棒状杆菌耐热性将具有重要的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495由谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf和嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf基因序列如SEQ NO.1所示，所述嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495序列如SEQ NO.2所示。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的应用，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495在提高谷氨酸棒杆菌中的应用。
优选的技术方案为：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495通过谷氨酸棒杆菌结合转化的方法导入谷氨酸棒杆菌中。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：包括：
（1）耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增
提取嗜热栖热菌HB8的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物TTH_RS07495-1、下引物TTH_RS07495-2进行PCR扩增，获得TTH_RS07495模板；上引物TTH_RS07495-1基因序列如SEQ NO.3所示，下引物TTH_RS07495-2基因序列如SEQ NO.4所示；
（2）启动子Ptuf的PCR扩增
提取谷氨酸棒杆菌的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物Ptuf-1、下引物Ptuf-2进行PCR扩增，获得Ptuf模板；上引物Ptuf-1基因序列如SEQ NO.5所示，下引物Ptuf-2基因序列如SEQ NO.6所示；
（3）启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接
配制酶切反应体系，加入上引物up-1、下引物down-2，加入up模板、Ptuf模板、TTH_RS07495模板、down模板进行PCR扩增，获得谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495；上引物up-1的基因序列如SEQ NO.7所示，下引物down-2基因序列如SEQ NO.8所示，up模板的基因序列如SEQ NO.9所示，down模板的基因序列如SEQ NO.10所示。
优选的技术方案为：耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物TTH_RS07495-1溶液、下引物TTH_RS07495-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
优选的技术方案为：启动子Ptuf的PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物Ptuf-1溶液、下引物Ptuf-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
优选的技术方案为：启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接包括：首先向0.2mL 的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物up-1溶液、下引物down-2溶液各2μL；加入1μL的up模板、2.5μL的Ptuf模板、0.9μL 的TTH_RS07495模板、1.7μL的down模板；加入0.5μL PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸2 min；72℃延伸10 min。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明通过构建大量谷氨酸棒杆菌耐热元器件，筛选到一种耐热性效果较好的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，并通过在谷氨酸棒杆菌中应用提高菌种的培养温度，可以降低能源消耗和生产成本，具有明显的生产实际应用价值，同时也为谷氨酸棒杆菌的抗逆性研究和抗逆元器件的构建设计提供很好的科学参考价值。
2、本发明中的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，可以使谷氨酸棒杆菌的热稳定性大大提高，增强菌株的耐热性，应用于工业化生产菌株中可以大大降低发酵过程中冷却水的能耗，降低生产成本，具有较好的工业应用前景。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用
一、谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建
将Thermus thermophilusHB8活化接种于液体LB培养基中置于75℃摇床中培养24h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组，基因组提取方法为使用细菌基因组DNA提取试剂盒Wizard® Genomic DNAPurification Kit A1120提取基因组。
耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增：配制50 μL酶切反应体系，首先向0.2 mLPCR管中加入20 μL ddw；加入10 μL 5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4 μL dNTP溶液；加入上引物TTH_RS07495-1、下引物TTH_RS07495-2溶液各2 μL；加入总DNA不超过200 ng的模板；加入0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddw将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032活化接种于液体LB培养基中置于32℃摇床中培养24h，得到种子培养液；将种子培养液接种于液体培养基中，取处于对数生长期的菌液提取基因组。基因组提取方法为使用细菌基因组DNA提取试剂盒Wizard® Genomic DNAPurification Kit A1120提取基因组。
启动子Ptuf的PCR扩增：配制50 μL酶切反应体系，首先向0.2 mL PCR管中加入20μL ddw；加入10 μL 5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4 μL dNTP溶液；加入上引物Ptuf-1、下引物Ptuf-2溶液各2 μL；加入总DNA不超过200 ng的模板；加入0.5 μL PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddw将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接：配制50 μL酶切反应体系，首先向0.2 mL PCR管中加入20 μL ddw；加入10 μL 5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL dNTP溶液；加入上引物up-1、下引物down-2溶液各2 μL；加入1 μL的up模板、2.5μL的Ptuf模板、0.9 μL 的TTH_RS07495模板、1.7 μL的down模板；加入0.5 μL PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddw将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸2 min；72℃延伸10 min。
二、谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495导入谷氨酸棒杆菌中
谷氨酸棒杆菌结合转化：配制20 μL体外连接体系，首先向0.2 mL PCR管中加入5μL ddw；加入4 μL的5×CE butter溶液；加入pk18mobrpsL质粒 50~200 ng；加入上述连接好的目的DNA片段20~200 ng；加入ExnaseTMII 2μL；用ddw将反应体系补足20 μL；37℃水浴30min；加入E. coliDH5α感受态细胞，冰浴20 min；置于42℃ 水浴锅，热激60 s，冰浴2min；在无菌EP管中加入900 μL预热的SOC复苏液，37 ℃、220 r/min，培养1 h；取100 μL菌液，涂布于卡那霉素抗性平板，37 ℃培养12 h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落PCR反应体系中，将反应体系进行菌落PCR扩增，通过PCR鉴定结果筛选正确目的菌株，将平板置于37 ℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的LB液体培养基中，培养10 h，离心菌体提取质粒；将2 mm电转杯在冰上预冷约20 min，待冷冻的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞融化和质粒加入其中，都加入电转杯，冰浴20min。电转后，用900μL预热的BHIS复苏液重悬电转杯中的菌体，转入EP管内，46 ℃热击6 min，在32 ℃、220 r/min条件下复苏2 h，涂布含有卡那霉素抗性的BHI平板，32 ℃培养24 h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落PCR反应体系中，将反应体系进行菌落PCR扩增，通过PCR鉴定结果筛选正确目的菌株，将平板置于32 ℃培养过夜；将鉴定正确的菌株接种于带卡那霉素的BHI液体培养基中，培养10 ~12 h；吸3~5μL菌液至900 μL BHI复苏液中，吸取100 μL上述复苏液至链霉素抗性平板涂布，32 ℃培养24 h；用牙签随机挑选平板中的单菌落，先划于固体培养基平板中，再将该牙签上的菌落溶于配制好的菌落PCR反应体系中，将反应体系进行菌落PCR扩增，通过PCR鉴定结果筛选正确目的菌株，将鉴定正确的菌株保存，命名为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495。
三、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495耐热性能验证
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495为谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495整合到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组上的菌株。
将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032从甘油管划线至平板，32℃培养24 h，从平板中挑取单菌落接种于15 mL液体培养基，32 ℃培养16 h，检测OD600，按OD600=10，接种500 μL体积的接种量接种于装有30 mL液体培养基中，置于120 rpm往复式摇床42 ℃培养24 h，测定其OD600值。经过高温培养结束后，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495的菌体OD600比谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 的菌体OD600提高了21.4%，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032-Ptuf-TTH_RS07495菌体在高温下（42℃）的生长情况明显优于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
本发明所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，在谷氨酸棒杆菌中的应用，可以显著提高谷氨酸棒杆菌的耐热性。在高温培养条件下，具有耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的谷氨酸棒杆菌生长要明显优于对照谷氨酸棒杆菌，具有该耐热元器件的菌株在高温条件下具有更好的稳定性和生长能力，该特性有利于以谷氨酸棒杆菌为生物技术平台的工业化生产应用，可以大大提高工业化菌株的培养温度、降低发酵冷却成本，具有较好的实际应用前景。
实施例2：一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用
一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495由谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf和嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf基因序列如SEQ NO.1所示，所述嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495序列如SEQ NO.2所示。
一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的应用，所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495在提高谷氨酸棒杆菌中的应用。
优选的实施方式为：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495通过谷氨酸棒杆菌结合转化的方法导入谷氨酸棒杆菌中。
、一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：包括：
（1）耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增
提取嗜热栖热菌HB8的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物TTH_RS07495-1、下引物TTH_RS07495-2进行PCR扩增，获得TTH_RS07495模板；上引物TTH_RS07495-1基因序列如SEQ NO.3所示，下引物TTH_RS07495-2基因序列如SEQ NO.4所示；
（2）启动子Ptuf的PCR扩增
提取谷氨酸棒杆菌的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物Ptuf-1、下引物Ptuf-2进行PCR扩增，获得Ptuf模板；上引物Ptuf-1基因序列如SEQ NO.5所示，下引物Ptuf-2基因序列如SEQ NO.6所示；
（3）启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接
配制酶切反应体系，加入上引物up-1、下引物down-2，加入up模板、Ptuf模板、TTH_RS07495模板、down模板进行PCR扩增，获得谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495；上引物up-1的基因序列如SEQ NO.7所示，下引物down-2基因序列如SEQ NO.8所示，up模板的基因序列如SEQ NO.9所示，down模板的基因序列如SEQ NO.10所示。
优选的实施方式为：耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物TTH_RS07495-1溶液、下引物TTH_RS07495-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
优选的实施方式为：启动子Ptuf的PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物Ptuf-1溶液、下引物Ptuf-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
优选的实施方式为：启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接包括：首先向0.2mL 的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物up-1溶液、下引物down-2溶液各2μL；加入1μL的up模板、2.5μL的Ptuf模板、0.9μL 的TTH_RS07495模板、1.7μL的down模板；加入0.5μL PrimeSTAR HSDNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸2 min；72℃延伸10 min。
SEQ NO.1
启动子Ptuf基因序列
GTTAACAGATCGTTTAGATCCGAAGGAAAACGTCGAAAAGCAATTTGCTTTTCGACGCCCCACCCCGCGCGTTTTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAGGAGGAAAGCTT
SEQ NO.2
TTH_RS07495基因序列
ATGTTGGAGAAGCTTTGGCCTTTTGGCCGCTCCCGCGTGCGCAAGGCGGTGGAGGAAGCCCTGGAGAAGGCTTTCCAGGACGTAGGCGAGGTTTTGGAACCCCTTTCCGAGCTTTCCGAGCACGAGGACCACTACCTCCTTAGGGTGGAGGTGCCGGGGCTTGGCCCGGAGAACCTGGAGGTGCGCCTCGAGGGGGACCAGCTGGTCATTGAGGGGGAGAAGCGGGAGGAGAAGCGCGCCAAGCACCTCGCCGAGATCGTCTACGGCCGGATCTACCGGGCCTACCTCCTCCCCAAGGACGCCAAGAAGGAGGGGATTGAGGCGAGGCTCGCCAAGGGGGTGCTGGAGGTGCGGATCCCCCGGGAGAAGCGGCCCGAGGAACCTCCCGTGCGGATACCCATTCAGGAAAGCTAA
SEQ NO.3
上引物TTH_RS07495-1基因序列
CGAAGTCCAGGAGGAAAGCTTATGTTGGAGAAGCTTTGGCCT
SEQ NO.4
下引物TTH_RS07495-2基因序列
TATCATCACAGAGTGCAACCAGATC TTAGCTTTCCTGAATGGGTATCCG
SEQ NO.5
上引物Ptuf-1基因序列
TGTTGACCTCAAATATCGGAAGTACAAGCGCGTGCCCTCTTTGCTGCAG
SEQ NO.6
下引物Ptuf-2基因序列
AGGCCAAAGCTTCTCCAACAT AAGCTTTCCTCCTGGACTTCG
SEQ NO.7
上引物up-1基因序列
ACCACGTCGATGTCTTTTACCTG
SEQ NO.8
下引物down-2基因序列
GAGAAGTTAGCAAAGCCACGAGTAG
SEQ NO.9
up模板基因序列
ACCACGTCGATGTCTTTTACCTGCTCGATCACACAACCAGCCCTCAGATCACGGTGCTGCCGCACTCAATGGATTATTTCGATCAAACGCGCAGCGATGCTGTTATGGCTGCCATCATTGAGCAAAACCCTGCGTTCGCAGAAATTAAAGGCTCACCCATTACAACCGCAGATGTAGCCCTCCACAATCTCGGTGACACCAACGCCAACCGACGCTGGCAGTCTAACGTGCTGCTTGCCCGGCTACTCGGGGGTATTAGTGTGCGCGGAGAGGTACCTGAGCACCAGAGCCACAACCATCTCGCCAAGCAGTTTGCCGAGGCAACCTTGGTCACCAGGGACTTCGATGTGAATTATGATCCAACAAGCGCTCACCCTTTTACTGCTGGCTTCAACTCGATCAACTATGACACCACCTTGCTCAGCCTGTACTTCGCAATGTTGACCTCAAATATCGGAAGTAC
SEQ NO.10
down模板基因序列
GATCTGGTTGCACTCTGTGATGATATTCGCGGTGTACTTGATCGAGGTTTAGAGATCTCATCTCCGAATCATCATGAGATGGTGGATGCTATGCGCAAGCAGCTGCACTATATTCAGGCATTTTACCGTGCCTGGGGACCCATTCAACGCCGCTTCAATGACGCTGACCCAGCGGTGACCCATCCGCATCTCACAGTGATCTACCCACCGCTCACCCCTGCATCCGCAGAGAAATTCAACAAGATCACCTCAGTCGCTGCTGTGAGCAAGCGCCCAACCACCCTGCCGTATTTCCGTGCAGATGGTTCACCTACTCGTGGCTTTGCTAACTTCTC。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (7)
1.一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495由谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf和嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495组成，所述谷氨酸棒杆菌启动子Ptuf基因序列如SEQ NO.1所示，所述嗜热栖热菌HB8中的耐热功能基因TTH_RS07495序列如SEQ NO.2所示。
2.一种权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的应用，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495在提高谷氨酸棒杆菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的应用，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495通过谷氨酸棒杆菌结合转化的方法导入谷氨酸棒杆菌中。
4.一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：包括：
（1）耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增
提取嗜热栖热菌HB8的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物TTH_RS07495-1、下引物TTH_RS07495-2进行PCR扩增，获得TTH_RS07495模板；上引物TTH_RS07495-1基因序列如SEQ NO.3所示，下引物TTH_RS07495-2基因序列如SEQ NO.4所示；
（2）启动子Ptuf的PCR扩增
提取谷氨酸棒杆菌的基因组，以该基因组为DNA模板，使用上引物Ptuf-1、下引物Ptuf-2进行PCR扩增，获得Ptuf模板；上引物Ptuf-1基因序列如SEQ NO.5所示，下引物Ptuf-2基因序列如SEQ NO.6所示；
（3）启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接
配制酶切反应体系，加入上引物up-1、下引物down-2，加入up模板、Ptuf模板、TTH_RS07495模板、down模板进行PCR扩增，获得谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495；上引物up-1的基因序列如SEQ NO.7所示，下引物down-2基因序列如SEQ NO.8所示，up模板的基因序列如SEQ NO.9所示，down模板的基因序列如SEQ NO.10所示。
5.根据权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：耐热功能基因TTH_RS07495的 PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物TTH_RS07495-1溶液、下引物TTH_RS07495-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
6.根据权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：启动子Ptuf的PCR扩增包括：首先向0.2mL的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物Ptuf-1溶液、下引物Ptuf-2溶液各2μL；加入总DNA不超过200ng的模板；加入0.5μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5 min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸30 s；72℃延伸10 min。
7.根据权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495的构建方法，其特征在于：启动子Ptuf与耐热功能基因TTH_RS07495的DNA片段连接包括：首先向0.2mL 的PCR管中加入20μL的ddH2O；加入10μL的5×PrimeSTAR Buffer溶液；加入4μL的dNTP溶液；加入上引物up-1溶液、下引物down-2溶液各2μL；加入1μL的up模板、2.5μL的Ptuf模板、0.9μL的TTH_RS07495模板、1.7μL的down模板；加入0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase溶液；用ddH2O将反应体系补足50 μL并用移液器反复吹吸混匀；PCR仪参数设置为：95℃预变性5min；30个循环包括98℃变性10 s、55℃退火5 s和72℃延伸2 min；72℃延伸10 min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310624658.9A CN116355941A (zh) | 2023-05-30 | 2023-05-30 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310624658.9A CN116355941A (zh) | 2023-05-30 | 2023-05-30 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116355941A true CN116355941A (zh) | 2023-06-30 |
Family
ID=86905301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310624658.9A Pending CN116355941A (zh) | 2023-05-30 | 2023-05-30 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116355941A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317538A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTHA0571及其应用 |
-
2023
- 2023-05-30 CN CN202310624658.9A patent/CN116355941A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317538A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-12 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTHA0571及其应用 |
| CN114317538B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-02-13 | 江苏澳创生物科技有限公司 | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTHA0571及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kristjansson | Thermophilic organisms as sources of thermostable enzymes | |
| Cheng et al. | Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts | |
| CN112725309B (zh) | 一种中温下稳定的低温外切菊粉酶突变体MutP126R | |
| CN116355941A (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTH_RS07495及其构建方法和应用 | |
| CN110684791A (zh) | 一种利用dna在体内存储信息的方法 | |
| CN104789586B (zh) | 大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用 | |
| CN112899210A (zh) | 增强正调控蛋白基因表达以提高井冈霉素发酵水平的方法 | |
| CN104673819A (zh) | 一种用于敲除l-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法 | |
| CN103992992A (zh) | 硫磺矿硫化叶菌中（+）γ-内酰胺酶的编码基因及应用 | |
| CN111996185A (zh) | 一种接合转移增强液及其在提高细菌接合转移效率中的应用 | |
| CN107299074B (zh) | 甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用 | |
| CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 | |
| CN111440737B (zh) | 一种交替单胞菌属菌株 | |
| CN104498516B (zh) | 高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用 | |
| CN101892228B (zh) | 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用 | |
| CN114317538B (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌耐热元器件Ptuf-TTHA0571及其应用 | |
| CN104962574B (zh) | 一种节杆菌表达质粒与应用 | |
| CN115976058B (zh) | 毒素基因及其在重组和/或基因编辑的工程菌构建中的应用 | |
| CN102021191A (zh) | 一种体外进化β-葡聚糖酶的方法 | |
| CN114438052B (zh) | 一种烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体及其应用 | |
| CN117363552B (zh) | 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法 | |
| CN103436511A (zh) | 一种高温碱性蛋白酶及其制备方法 | |
| CN103509725B (zh) | 一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用 | |
| CN107815461A (zh) | 瘤胃真菌木糖异构酶基因及其应用 | |
| CN104212826A (zh) | 一种维生素b12核糖体开关载体的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |