CN110684791A - 一种利用dna在体内存储信息的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物信息学领域，公开了一种利用DNA在体内存储信息的方法，所述方法利用PCR的方法从具有编码信息的基因文库中扩增出具有不同的同源臂的目的片段，将这些片段利用Gibson组装到质粒载体上，转化微生物、保存。本发明所述方法在体内利用DNA编码存储信息，在载体上通过Gibson组装可成功组装不同的DNA片段用于编码信息，在体内实现数字信息的存储，具体成本低廉、易于保存和保存时间长等优点。另外由于要存储的信息通过gibson组装克隆到了质粒上，在有抗性存在的条件下，质粒是可以稳定的进行遗传，因此信息不会丢失，会稳定的存在于细胞内，待需要时进行信息提取。
Description
技术领域
本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种利用DNA在体内存储信息的方法。
背景技术
数字信息顾名思义就是信息数字化，它不是由纸张或其他形式做载体，而是由数字编码组成，以INTERNET或其他各种传输途径为载体的一种高科技信息手段。2016年，人类共计产生了16.1万亿GB的数字信息；到2025年，这一数字预计将增加十倍以上。目前放置数据的地方主要是外部硬盘和云服务器机房但大部分都称不上完美的解决方案。因为它们占用大量的空间，而且每隔十年左右就需要升级一次。
与传统的电子介质相比，DNA具有容量大、体积小、可编码、性质稳定、寿命长和易保存等特点，是一种新兴的最具竞争力的大容量数据存储介质。最近的研究表明，数字信息可以用DNA编写、储存并能准确地翻译出来。使用合成的DNA进行数据的存储，需要先将信息编码成核苷酸序列，并合成相应的核苷酸将其储存在适当的环境中。在提取存储的信息时，需要对DNA进行排序，并将其解码回数据中。
Church等利用下一代DNA合成和测序技术来编码数字信息，将包含53,426个单词、11张图片和一个JAVA程序的书编写到54,898个159nt的寡核苷酸片段中(短的DNA片段)构建成一个DNA文库。在读取过程中，通过有限循环的聚合酶链反应对文库进行扩增，并使用下一代DNA测序技术阅读了这本书。该方法的主要缺点一个是合成的成本较高，还有一个是编写和读取都比较慢。比如编写这本书，科学家就用了好几天。Catalog公司的研究人员提出一种新策略，先制作20-30个碱基对的DNA片段库，然后将这些片段用酶缝合起来，通过不同的顺序排列，实现数据存储。DNA script公司的研究人员提出了一种无模板酶促合成方案，这种无模板酶促反应可以在一段寡核苷酸3’端后任意添加核苷酸，反应过程是不受控制的，会产生长度不均一的DNA片段，为了解决这个问题，研究人员将核苷酸的3’端保护起来，当其添加到寡核苷酸后可以终止反应，然后当想继续添加核苷酸时，需要去掉核苷酸3’端的保护，如此循环就可以合成确定的序列，这种策略确实可以合成较长的确定序列的DNA，但在去保护时可能不完全，无法继续进行下一轮添加，且酶可能不易识别被保护起来的核苷酸。所以这个策略还不能准确合成太长的序列，目前，其公司宣布可以合成长度为200nt的DNA序列。近几年，无模板合成DNA受到科学家们热切的关注，在信息存储应用上也极具潜力，Church等基于无模板合成DNA的策略开发了一种更简单的信息存储方法，利用碱基间的转换进行编码，只要确保每一轮至少添加一个确定的碱基即可，不需要严格控制添加一个，这克服了修饰碱基保护3’端的缺点，成功在合成DNA上编码了“hello”这个单词，并通过全自动系统将这个单词转换成数字数据。
然而，现阶段合成DNA存储信息的方法主要在体外进行，存储信息成本较大，不利于商业化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的在体外用酶催化合成并存放成本较高、存储相对困难、保存时间较短的问题，提供一种利用DNA在体内存储信息的方法。本发明通过将数字信息转化为DNA序列，将其克隆于高拷贝质粒上，在微生物体内进行复制和存储，有效降低存储成本，使数字信息得到长久的保存
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用DNA在体内存储信息的方法，其特征在于，利用PCR的方法从具有编码信息的基因文库中扩增出具有不同的同源臂的目的片段，将这些片段利用Gibson组装到质粒载体上，转化微生物、保存。
在一些实施方案中，所述基因文库含有11776条序列不同的小片段DNA。在一些实施例中，所述基因文库含有509条序列不同的小片段DNA。
本发明中，所述小片段DNA长度为150-500bp。
所述小片段DNA为预先编码转化后的需要存储的部分数字信息。所述编码可以采用现有的任意一种编码系统。
在一些实施方案中，所述小片段DNA包含标签序列，便于译码后进行数字信息的顺序读取。
在一些实施方案中，本发明所述的方法中所述质粒载体为pUC19。
本发明所述方法中，所述PCR所用的酶为Q5高保真酶，所述转化为电转化。
本发明所述方法所述重组的质粒载体转化微生物用于长久保存。所述微生物可以为原核生物或真核生物。
其中，所述原核生物包括但不限于大肠杆菌或芽孢杆菌；所述真核生物包括但不限于酵母菌。
在一些实施方案中，本发明所述的方法，还包括微生物扩增繁殖及传代培养的步骤。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述的方法，还包括信息读取的步骤。
所述信息读取的步骤具体为提取微生物质粒，NotI内切核酸酶酶切后测序，将测得DNA序列转化为二进制序列，经译码获得存储的信息。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种利用DNA在体内存储信息的方法，所述方法利用PCR的方法从具有编码信息的基因文库中扩增出具有不同的同源臂的目的片段，将这些片段利用Gibson组装到质粒载体上，转化到微生物体内进行保存。本发明所述方法在体内利用DNA编码存储信息，在载体上通过Gibson组装可成功组装不同的DNA片段用于编码信息，在体内实现数字信息的存储，具体成本低廉、易于保存和保存时间长等优点。另外由于要存储的信息通过gibson组装克隆到了质粒上，在有抗性存在的条件下，质粒是可以稳定的进行遗传，因此信息不会丢失，会稳定的存在于细胞内，待需要时进行信息提取。而且本发明所述方法合成DNA文库的成本远低于合成长的DNA序列，存储容量也提高了几个数量级。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明DNA信息存储的主要过程的示意图；
图2示1个片段自组装插入片段制备，其中Lane M:Marker；Lane I:1个片段自组装插入片段；Lane V:pUC19载体片段；
图3示3个片段自组装插入片段制备，其中Lane M:Marker；Lane I1:3个片段自组装插入片段1；Lane I2:3个片段自组装插入片段2；Lane I3:3个片段自组装插入片段3；Lane V:pUC19载体片段；
图4示5个片段自组装插入片段制备，其中Lane M:Marker；Lane I1:5个片段自组装插入片段1；Lane I2:5个片段自组装插入片段2；Lane I3:5个片段自组装插入片段3；Lane I4:5个片段自组装插入片段4；Lane I5:5个片段自组装插入片段5；Lane V:pUC19载体片段；
图5示1个片段自组装质粒酶切后片段验证，其中Lane M:Marker；Lane C:1个片段自组装菌落培养回收后NotI酶切产物；Lane L:1个片段自组装菌液培养回收后NotI酶切产物；Lane control:20ng酶切pUC19质粒对照；
图6示3个片段自组装质粒酶切后片段验证，其中Lane M:Marker；Lane C:3个片段自组装菌落培养回收后NotI酶切产物；Lane L:3个片段自组装菌液培养回收后NotI酶切产物；Lane control:20ng酶切pUC19质粒对照；
图7示5个片段自组装质粒酶切后片段验证，其中Lane M:Marker；Lane C:5个片段自组装菌落培养回收后NotI酶切产物；Lane L:5个片段自组装菌液培养回收后NotI酶切产物；Lane control:20ng酶切pUC19质粒对照；
箭头所示为测序目的条带，即体内完成存储后，提取回收的数据。
具体实施方式
本发明公开了一种利用DNA在体内存储信息的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中将芯片合成的基因文库(含有11776条序列，存储着编码的数字信息)，将这些序列用带有同源臂的引物进行PCR后，利用Gibson组装的方法(分别组装1、3和5个片段)将文库中的序列克隆到pUC19上，在大肠杆菌中进行复制培养，以混菌培养的方式实现在细菌体内的信息储存。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1、PCR制备插入片段和载体
1、插入片段的制备
Q5 Master pool浓度：14.024ng/μl
表1插入片段
| 分子数 | 每分子copy数 | Copy数对应质量 |
| 12000条 | 10<sup>5</sup> | 0.233ng |
将master pool稀释200倍浓度为:0.07ng/μl。
其中利用Q5热启动超保真DNA聚合酶进行PCR扩增的反应体系如表2所示。
表2反应体系
正、反向引物的序列见表6。
PCR扩增的反应程序如表3所示。
表3反应程序
PCR产物纯化回收后，用30μl ddH2O溶解，灰度分析得到插入片段浓度。
2、载体片段的制备
pUC19-PCR扩增反应体系如表4所示。
表4 pUC19-PCR扩增反应体系
PCR扩增的反应程序如表5所示。
表5反应程序
PCR产物切胶回收后，用50μl ddH2O溶解，灰度分析得到载体浓度。
上述各步涉及的引物序列如表6所示。表6PCR引物序列
实施例2、重组质粒构建
分别将带有对应同源臂的1、3或5个插入片段利用Gibson组装试剂盒与pUC19载体连接，50℃反应60min。具体反应体系如下表7-9。
表7将一个插入片段与pUC19载体连接的反应体系(pUC19-assembly-1)
| 组分 | 用量(μl) |
| pUC19线性化载体 | 2μl(200ng) |
| 插入片段1 | 1μl(13ng) |
| Gibson Assembly Master Mix(2×) | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 7μl |
表8将三个插入片段与pUC19载体连接的反应体系(pUC19-assembly-3)
| 组分 | 用量(μl) |
| pUC19线性化载体 | 2μl(200ng) |
| 插入片段1 | 1μl(13ng) |
| 插入片段2 | 1μl(13ng) |
| 插入片段3 | 1μl(13ng) |
| Gibson Assembly Master Mix(2×) | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 5μl |
表9将五个插入片段与pUC19载体连接的反应体系(pUC19-assembly-5)
| 组分 | 用量(μl) |
| pUC19线性化载体 | 2μl(200ng) |
| 插入片段1 | 1μl(13ng) |
| 插入片段2 | 1μl(13ng) |
| 插入片段3 | 1μl(13ng) |
| 插入片段4 | 1.4μl(13ng) |
| 插入片段5 | 1.3μl(13ng) |
| Gibson Assembly Master Mix(2×) | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 2.3μl |
实施例3、重组质粒转化及培养
将Gibson组装后的质粒电转化大肠杆菌感受态细胞，具体操作如下：
1.电极间距为0.1cm的电转杯插入碎冰中，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。
2.取-70℃保存的电转感受态细胞(大肠杆菌DH10β，转化效率大于1010cfu/μgDNA)插入冰中，待细胞刚化冻后，加入5μl连接后的重组质粒，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将细胞/DNA混合物快速转移到电击杯中，避免产生气泡，确保细胞沉到杯底，盖上杯盖，空管保留待用。
3.启动电转仪，设置电击参数：1.8kV。将电转杯放入电转槽中进行电击。完成后，将电转杯插入冰中，加入950μl SOB培养基，并将液体转移到原来保留的感受态空管中，37℃，220rpm振荡培养1h。
4、取500μl涂布固体LB平板培养基，另取500μl接入LB液体培养基，培养8h，至OD1.2左右；
检测重组质粒转化感受态细胞的。
实施例4、存储信息的验证及测序分析
培养后分别提取固体平板培养基和液体培养基培养的细胞中的质粒，NotI酶37℃酶切。酶切后，送Illumina MiSeq测序。其中酶切体系如表10和11所示。测序结果见表12-15。
表10液体培养基培养的细胞中重组质粒酶切体系
| 组成 | 体积 | 终浓度 |
| 菌液-DNA | Xμl | 4μg |
| Buffer | 5μl | 1× |
| NotI(20U/μl) | 2μl | 0.04U/μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至50μl |
酶切在37℃条件下，酶切3h。其中X为保证终浓度为4μg的实际用量。
表11固体平板培养基培养的细胞中重组质粒酶切体系
| 组成 | 体积 | 终浓度 |
| 菌落-DNA | Xμl | 3μg |
| Buffer | 5μl | 1× |
| NotI | 1.5μl | 0.04U/μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至50μl |
酶切在37℃条件下，酶切5h。其中X为保证终浓度为3μg的实际用量。
表12含有一个插入片段的重组质粒的固体平板培养基培养的菌落测序结果
表13含有三个插入片段的重组质粒的固体平板培养基培养的菌落测序结果
表14含有三个插入片段的重组质粒的液体培养基培养的菌落测序结果
表15含有五个插入片段的重组质粒的固体平板培养基培养的菌落测序结果
上述测序结果证明，数字信息可以稳定存在于细胞中，随着质粒的复制，信息可以不断扩增，在回收质粒并测序后，可以完全还原存储前的信息。
Claims (10)
1.一种利用DNA在体内存储信息的方法，其特征在于，利用PCR的方法从具有编码信息的基因文库中扩增出具有不同的同源臂的目的片段，将这些片段利用Gibson组装到质粒载体上，转化微生物、保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因文库含有11776条序列不同的小片段DNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA长度为150-500bp。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述小片段DNA包含标签序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC19。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR所用的酶为Q5高保真酶，所述转化为电转化。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为原核生物或真核生物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述原核生物为大肠杆菌或芽孢杆菌；所述真核生物为酵母菌。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，还包括微生物扩增繁殖及传代培养的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括信息读取的步骤；具体为提取微生物质粒，NotI内切核酸酶酶切后测序，将测得DNA序列转化为二进制序列，经译码获得存储的信息。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200114 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |