CN116354905A - 一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用，属于荧光探针技术领域，该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由通式(A)表示，本发明的荧光探针分子具有合成简单、原料价廉、产率高和光物理性质好的优点。相比于商业化脂滴探针BODIPY493/503和NileRed，本发明所制备的基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料克服了常规脂滴检测材料在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至淬灭，并且光稳定性较差，难以获得脂滴形态的超高分辨成像等技术问题，具有更好的光稳定性以及成像效果，进而实现了其在细胞内脂滴的超分辨成像，具有非常重要的生物学意义。

Description

一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于激发态质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其应用。
背景技术
具有可控光开关特性的荧光染料是单分子定位显微成像的关键。目前为数不多的超分辨闪烁荧光染料，例如Janelia Fluor(JF 549)，HMSiR(硅-罗丹明)等，严重依赖呫吨及其衍生物，尤其是罗丹明类结构。这些染料通过光激活或可逆热平衡保证其光开关特性。尽管这些已报道的染料有很好的光化学特性和闪烁性能，但是应用于单分子定位超分辨成像新的、结构简单、具有高效闪烁机制的透膜荧光染料十分缺陷。因此，发现新的闪烁机制，制备出生物相容性好、成像条件简单的染料，是拓展单分子定位显微成像技术发展的迫切需求。
在探索微观世界的过程中，光学显微技术已成为生物医学领域中必不可少的研究工具。然而，传统的光学显微成像技术的分辨率只能止步于200纳米，无法对更小的生物分子和结构进行观察。近年来，超分辨成像作为一种能够突破衍射极限的技术，尤其是单分子定位显微成像(Single Molecule Localization Microscopy,SMLM)技术，利用荧光团显著的闪烁能力来实现纳米级精度的超分辨率成像。目前，用于SMLM成像的染料十分有限。最早使用的Alexa Fluor系列或者花青素类的染料只能在固定细胞中成像，这局限了它们的应用。近年来，罗丹明类染料由于它良好的细胞通透性和优异的光物理性质得到了研究者的青睐，在活细胞的超分辨成像具有更高的时空分辨率。但是这类染料的合成过程十分复杂，并且通常需要额外引入短波长高能量的激光，还需要添加一些成像缓冲液来促进荧光团的闪烁能力。高性能的荧光染料是实现单分子定位超分辨成像的前提。因此，本课题旨在创新发明一类不同于罗丹明类染料结构和闪烁机制的新型自发闪烁的荧光染料，以扩大单分子定位超分辨成像染料的荧光团库，为微小尺寸的生物分子和结构的深入研究提供基础，这对于突破超分辨成像染料缺乏的瓶颈具有重要意义。
脂滴作为细胞内一种新兴的高度动态的细胞器，广泛存在于细菌、植物以及动物细胞中，由含甘油三酯和胆固醇酯的中性内核和表面分布有多种蛋白的磷脂单分子层组成。它们参与多种细胞活动过程，如膜形成、膜运输、脂质代谢与存储、信号转导和蛋白质-蛋白质相互作用，在保护细胞免受脂毒性、调节细胞能量稳态和脂凋亡过程中起着极其重要的作用。然而，有研究表明，脂质贮存的异常往往会引发多种代谢性疾病，如肥胖症、脂肪肝、心血管疾病和糖尿病等。因此，开发一种能有效检测脂滴形态的分子工具，在脂滴形态学研究和相关疾病的诊断方面皆具有极其重要的参考价值和应用前景。
因此，利用超分辨荧光成像技术的优异分辨率、灵敏度和选择性，这将被广泛应用于生物成像领域，为亚细胞器结构进一步在超高分辨率下的研究提供了可靠的方法。
随着强荧光发射、高光稳定性和良好生物相容性的聚集诱导发光(AIE)荧光分子的发展，越来越多的AIE荧光材料被应用于正常细胞和动物体内的脂滴成像。AIE荧光材料解决了传统的芳香共轭环荧光发色团聚集荧光猝灭问题，与生物背景中不发光或弱发光分子实现区分，而大多数AIE荧光分子聚集时容易发生荧光位移变化，导致此类结构很难对较复杂的生物体系和生命活动过程进行荧光动态监测。具备分子内激发态质子转移效应(ESIPT)的荧光分子往往具有斯托克斯位移大、光稳定性好的特点，并且与AIE效应相结合，进一步提高荧光探针检测的精确性，更有潜力被应用于脂滴的超分辨成像。
目前，有很多关于荧光材料用于脂滴生物成像的文献报道，商业化的脂滴检测探针主要有BODIPY493/503以及Nile Red等，但这一类传统的有机荧光分子存在一定的缺陷，在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至猝灭，并且光稳定性较差，从而很难实现对脂滴形态的超高分辨成像。
因此，亟需构建一种光物理性质优良和生物相容性好的荧光探针以满足脂滴超分辨荧光成像的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法及其在脂滴超分辨荧光生物成像方面的应用，此方法克服了常规脂滴检测材料在脂滴处聚集时易造成荧光强度的衰减甚至淬灭，并且光稳定性较差，难以获得脂滴形态的超高分辨成像等问题。
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种基于激发态质子转移的聚集诱导发光材料的制备方法，该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由下述通式(A)表示：
Figure BDA0004119749090000021
其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
本发明提供一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其合成该材料的合成路线如下：
Figure BDA0004119749090000031
具体合成步骤如下：
步骤(1)：中间体1-甲烷肼基萘-2-醇的合成：
以无水乙醇为溶剂，在惰性气氛中，将2-羟基-1-萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到通式(A)所示化合物，；
步骤(2)：以无水甲醇为溶剂，在惰性气氛中，将所述式(Ⅰ)所示化合物与式(Ⅱ)所示的对位取代苯甲醛在催化量的对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到所述式(Ⅲ)所示化合物，ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ，
其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，2-羟基-1-萘甲醛与水合肼的摩尔比为1:5～8。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，在每mmol的2-羟基-1-萘甲醛中加入无水乙醇10-20mL进行稀释。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(1)中，回流反应的时间为4-6小时。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，式(Ⅰ)所示化合物与式(Ⅱ)所示的对位取代苯甲醛的摩尔比为1:1.05～1.1。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，在每mmol的式(Ⅰ)所示化合物中加入的对甲苯磺酸摩尔量为所述式(Ⅰ)所示化合物的1～2％mmol。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，在每mmol的式(Ⅰ)所示化合物中加入无水乙醇5-15mL进行稀释。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，回流反应的时间为10-12小时。
本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，步骤(2)中，回流反应结束后，将得到的所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ冷却至室温，减压、旋转、蒸发、除去反应溶剂，干燥后，将所得固体经硅胶柱层析纯化，得到纯化后的所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ。
本发明提供一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，该种发光材料具有合成简单、原料廉价、产率高和光物理性质好的优点。相比于商业化脂滴探针BODIPY493/503和Nile Red，本发明的聚集诱导型荧光探针分子具有更好的光稳定性以及成像效果，进而实现了其在细胞内脂滴的超分辨成像，具有非常重要的生物学意义。
有益效果
相比现有技术，本发明的某一个实施例具有以下至少一种有益效果：
(1)本发明提供的基于激发态质子转移的聚集诱导发光材料荧光探针分子采用市面上易购得的较为廉价的原材料反应制得，例如2-羟基-1-萘甲醛、水合肼以及对位取代苯甲醛等，该方法通过将2-羟基-1-萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到式(Ⅰ)所示化合物，再将所述式(Ⅰ)所示化合物与对位取代苯甲醛在对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到荧光探针分子III，合成路线清晰，合成步骤简单，产率较高；
(2)所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ展示了明显的激发态质子转移效应，所谓激发态质子转移效应通常是指有机分子受到激发到达激发态之后，在激发态势能面上质子从质子供体基团转移到质子受体基团，进而形成含有分子内氢键的多元环的过程，ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ质子转移荧光效率高、斯托克斯位移大，具有聚集诱导发光性质，拥有良好的光稳定性；
(3)所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ具有良好的细胞膜通透性，能够特异性的靶向标记脂滴；实现了在细胞内的超分辨荧光成像；
(4)所述的合成方法全程在惰性气体气氛中，以及无水的条件下进行，防止了水分子可能会与能够发生质子转移的基团形成多羟基化合物，从而阻碍异构化反应的过程，使得ESIPT反应顺利进行，提高反应的产率。
附图说明
图1是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A的所示化合物的质谱图；
图2是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-B的所示化合物的质谱图；
图3是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A的所示化合物的核磁共振氢谱图；
图4是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-B的所示化合物的核磁共振氢谱图；
图5是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A的所示化合物的核磁共振碳谱图；
图6是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-B的所示化合物的核磁共振碳谱图；
图7是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A所示化合物在不同比例二甲基亚砜和水的混合溶液中的紫外-可见光吸收谱图；
图8是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-B所示化合物在不同比例二甲基亚砜和水的混合溶液中的紫外-可见光吸收谱图；
图9是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A所示化合物和Ⅲ-B所示化合物在不同比例二甲基亚砜和水的混合溶液中的荧光光谱图；
图10是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A所示化合物和Ⅲ-B所示化合物对HeLa细胞的细胞毒性实验图；
图11是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A所示化合物和Ⅲ-B所示化合物，JF 549和AF 647染料的单分子闪烁特性参数测试图(光子定位数Photons,光开关工作周期DC,光开关存活分数SF)；
图12是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-A所示化合物与商业化细胞器染料(脂滴：Nile Red；溶酶体：Lyso-Tracker Red；内质网：ER-Tracker Red；线粒体：Mito-Tracker Red CMXRos；)对HeLa细胞进行共定位成像图；
图13是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ的结构式为Ⅲ-B所示化合物与商业化细胞器染料(脂滴：Nile Red；溶酶体：Lyso-Tracker Red；内质网：ER-Tracker Red；线粒体：Mito-Tracker Red CMXRos；)对HeLa细胞进行共定位成像图；
图14是本发明中ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ所示化合物对HeLa细胞内脂滴的超分辨成像图。
术语说明
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明中，“ESIPT”的意思为：激发态分子内质子转移(Excited-StateIntramolecular Proton Transfer,ESIPT),通常是指有机分子受到激发到达激发态之后，在激发态势能面上质子从质子供体基团转移到质子受体基团，进而形成含有分子内氢键的五、六、甚至七元环的过程，“ESIPT分子”是指具有激发态分子内质子转移现象的分子。
本发明中，所述术语“AIE”是指聚集诱导发光现象，所述“AIE分子”是指具有聚集诱导发光现象的分子。
本发明中，所述术语“HeLa细胞”是指海拉细胞，是一种人工培养、具有无限增殖能力的细胞，海拉细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。
本发明中，stokes位移的中文名称为斯托克斯位移，是指荧光光谱与其相应吸收光谱位移差值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明中，类似“式(Ⅰ)化合物”、和“式(Ⅰ)所示的化合物”和“化合物(Ⅰ)”、化合物Ⅰ的表述，表示的是同一个含义，其他化合物的命名以此类推。
本发明中，类似“ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ”、和“荧光探针分子Ⅲ”、“所示荧光分子Ⅲ”、以及“化合物Ⅲ”的表述，表示的是同一个含义，其他化合物的命名以此类推。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明提供了一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，结构式Ⅲ所示的ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ，下面我门简称它为荧光探针分子Ⅲ，其中荧光探针分子III-A和III-B的制备过程如下：
实施例1：荧光探针分子III-A的制备，其结构通式如下：
Figure BDA0004119749090000061
在氩气气氛下，于100mL三口烧瓶中分别加入2-羟基-1-萘甲醛(862mg，5mmol)、水合肼(1.45mL，30mmol)以及50mL乙醇，加热回流反应4小时，反应结束冷却至室温，减压旋干后得淡黄色油状物粗品。所得粗品经硅胶柱柱层析(硅胶目数：200～300目；洗脱剂：石油醚/二氯甲烷＝1/1)制备得到化合物I，为791mg，产率为85％，用作下一步合成的原料。
在氩气气氛保护下，在100mL三口瓶中，将化合物I(372mg，2mmol)、4-吗啉基苯甲醛(420mg，2.2mmol)和对甲苯磺酸(6.88mg，2％mmol)溶于30mL无水甲醇，加热回流反应10小时，反应结束冷却至室温，旋干，得黄色固体粗产物。所得粗产品利用200～300目硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/二氯甲烷＝10/1)提纯旋干得到黄色固体粉末III-A，639mg，产率为89％。
如图1所示为本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，所制得的荧光探针分子Ⅲ-A的质谱图，图3为所制得的荧光探针分子Ⅲ-A的核磁共振氢谱图，图4为所制得的荧光探针分子Ⅲ-A的核磁共振碳谱图，所得荧光探针分子Ⅲ-A的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.76(s,1H),8.57(s,1H),8.18(d,J＝9.2Hz,1H),7.92-7.76(m,3H),7.56(t,J＝8.8Hz,1H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),7.23(d,J＝8.8Hz,2H),6.97(d,J＝9.6Hz,2H),3.96-3.79(m,4H),3.39-3.21(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.02,160.85,160.04,134.21,132.73,130.63,129.08,128.13,127.79,123.60,120.21,119.16,114.54,108.41,77.33,77.01,76.69,66.55,47.93.ESI-MS at m/z,360.23,[M+H]+。通过该方法获得的荧光探针分子Ⅲ-A具有原材料价格低廉、合成路线简单、合成步骤少、产率高等优点。
实施例2：荧光探针分子III-B的制备，其结构通式如下：
Figure BDA0004119749090000071
在氩气气氛下，于100mL三口烧瓶中分别加入2-羟基-1-萘甲醛(862mg，5mmol)、水合肼(1.45mL，30mmol)以及50mL乙醇，加热回流反应4小时，反应结束冷却至室温，减压旋干后得淡黄色油状物粗品。所得粗品经硅胶柱柱层析(硅胶目数：200～300目；洗脱剂：石油醚/二氯甲烷＝1/1)制备得到化合物I，为791mg，产率为85％，用作下一步合成的原料。
在氩气气氛保护下，在100mL三口瓶中，将化合物I(372mg，2mmol)、4-哌啶基苯甲醛(2.2mmol)和对甲苯磺酸(6.88mg，2％mmol)溶于30mL无水甲醇，加热回流反应10小时，反应结束冷却至室温，旋干，得黄色固体粗产物。所得粗产品利用200～300目硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/二氯甲烷＝10/1)提纯旋干得到黄色固体粉末III-B，650mg，产率为89％。
如图2所示为本发明提供的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，所制得的荧光探针分子Ⅲ-B的质谱图，图4为所制得的荧光探针分子Ⅲ-B的核磁共振氢谱图，图6为所制得的荧光探针分子Ⅲ-B的核磁共振碳谱图，所得荧光探针分子Ⅲ-B的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.53(s,1H),9.66(s,1H),8.56(s,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,1H),7.83-7.71(m,4H),7.54(ddd,J＝8.4,6.8,1.3Hz,1H),7.39-7.33(m,1H),7.23(d,J＝8.8Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,2H),3.36-3.32(m,4H),1.72-1.63(m,6H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ161.71,160.86,159.56,133.94,132.83,130.42,129.19,128.24,127.76,123.60,120.31,119.33,114.73,108.69,77.48,77.16,76.84,49.08,25.56,24.47.ESI-MS at m/z,358.23,[M+H]+。通过该方法获得的荧光探针分子Ⅲ-B具有原材料价格低廉、合成路线简单、合成步骤少、产率高等优点。
实施例3：本发明所制备的荧光探针分子Ⅲ在不同溶剂中的光谱测试：
分别将荧光探针分子III-A(3.59mg)和III-B(3.57mg)溶于1mL二甲基亚砜中配制成浓度为10mM的荧光探针母液。测试之前，将荧光探针分子的工作浓度稀释至10μM，测试体系体积为3mL，测试温度为室温。通过紫外-可见发光光度计分别测得荧光探针分子III-A和III-B在二甲基亚砜和水体系中的最大吸收波长为405nm左右，如图7、8所示。
紧接着，测试前，荧光探针分子III-A和III-B在不同比例的二甲基亚砜/水中的终浓度为10μM，不同比例的二甲基亚砜/水混合溶液体系中水的比例分别为0、10％、20％、50％、70％、90％和99％，测试体系的体积为3mL，以405nm为激发波长，测得荧光光谱。从荧光光谱可看出，荧光探针分子III-A和III-B的最大发射波长在550nm左右，对于ESIPT分子而言，这属于酮式发射特征峰(600nm附近)，而醇式发射特征峰一般在450nm左右，因此本发明人检测了在550nm处荧光探针分子的聚集发光现象。如图9所示，向荧光探针III-A和III-B的二甲基亚砜溶剂中(溶解单分子态)不断加入一定比例的水，III-A和III-B由于溶解度问题慢慢形成聚集体，荧光强度也先减弱(III-A：0-70％；III-B：0-50％)再增强(III-A：70％-99％；III-B：50％-99％)，且在水占比例为99％时达到最大值，对应于AIE性质。总的来说，荧光探针分子III-A和III-B均具有明显的ESIPT性质和AIE性质，从根本上解决了有机荧光分子的聚集荧光淬灭问题，拓展了荧光探针的适用范围。
实施例4：本发明所制备的荧光探针分子Ⅲ的单分子闪烁特性的测试：
进一步的，本发明进行荧光探针分子III的单分子闪烁特性的测定。在超分辨成像溶液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L NaCl，10％(W/V)葡萄糖，0.5mg/mL葡萄糖氧化酶，40μg/mL过氧化氢酶和35mmol/Lβ-巯基乙胺)中进行成像。用561nm激光(1kW/cm2)激发荧光探针分子III，对575-625nm波段范围的发射光进行收集。所有数据的采集曝光时间30ms，帧数6万帧。采用SMAP软件对每一帧中不同染料的荧光信号进行检测和定位。通过设置点扩散函数(PSF)宽度的上界为160nm，光子计数的下界为800来避免过宽或过暗的定位。然后，我们以100nm为截断距离，将定位簇划分为单个簇，并将全宽在半高宽(FWHM)低于30nm的定位簇视为单个染料信号。只从单一染料中选择成簇的信号用于提取荧光时间痕迹。占空比(DC)测量为在100s滑动窗口内处于开启状态的时间百分比，平衡DC计算为400～600s之间的平均DC值。存活分数(SF)为700s内未光漂白的染料，平衡SF为400s时的平均SF值。
实施例5：本发明所制备的荧光探针分子Ⅲ对于HeLa细胞的毒性测试：
我们进一步用HeLa细胞测试了两种荧光探针Ⅲ-A和Ⅲ-B的细胞毒性，采用CCK-8法测定不同浓度的III-A和III-B的暗毒性。HeLa细胞在长到80％的密度下，可用于细胞毒性试验的测试。使用血球计数板对细胞悬液进行计数，按照每孔100μl的量(细胞数目5000个/孔)加入96孔板中，每组设置6个平行组，之后将细胞置于培养箱(37℃，5％CO2)中贴壁培养24小时。去除培养基，用新鲜培养基配制不同浓度的荧光探针(0、1、2、5、10、20μM)，继续培养24小时(37℃，5％CO2)。之后，去除含探针的培养基，贴壁加入PBS清洗，每孔再加入100μl(培养基：CCK8＝9:1)，同时设置只加培养基的空白孔，在培养箱中再孵育1-4小时，使用酶标仪测定450nm处的吸光度，并将细胞活力(％)表示为(加材料-空白)/(对照-空白)×100％。如图10所示，在黑暗的环境下，HeLa细胞的细胞活力随着荧光探针III-A或III-B浓度的增加，细胞的存活率仍保持在90％以上，各个浓度间未出现显著性差异，说明荧光探针III-A或III-B的浓度在20μM的范围内对HeLa细胞几乎没有毒性，因此该方法获得的荧光探针分子Ⅲ可用于共聚焦的共定位成像和细胞内脂滴的超分辨成像，具备良好的生物相容性。
实施例6：本发明所制备的荧光探针分子在HeLa细胞内的共定位实验：
将HeLa细胞重悬稀释至铺在共聚焦培养皿中，密度为每毫升为1×105个细胞，在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时之后，配制含荧光探针III-A或III-B的完全培养基，使得探针最终浓度为10μM，标记染色1小时；商染的探针按说明书孵育相应的时间。之后去除培养基，用PBS贴壁冲洗培养皿3次，以去除游离的探针。共聚焦图像使用蔡司LSM 980激光扫描共聚焦显微镜在63倍油镜下获得共定位图像，标尺为：10μM。其中，荧光探针III-A或III-B的激发波长为405nm，发射滤波片的波长范围为410-560nm。商染探针Nile Red，Lyso-Tracker Red、ER-Tracker Red、Mito-Tracker Red CMXRos均使用543nm的激发波长，发射滤波片范围分别为610-660nm，590-630nm，600-650nm，580-620nm。如图11、12所示，图11为本发明荧光探针分子III-A在HeLa细胞内共定位图像(标尺为：10μM)，图12为本发明荧光探针分子III-B在HeLa细胞内共定位图像(标尺为：10μM)。荧光探针分子III对脂滴具有优异的靶向性，其共定位系数达到93.1％，90.9％，在脂滴成像和脂滴相关生理方面具有很大应用前景，可被广泛应用于脂滴成像检测及脂滴相关理化实验的研究。
实施例7：本发明所制备的荧光探针分子Ⅲ在细胞内脂滴的超分辨成像应用：
将用于超分辨成像的玻片置于6孔板中，每孔铺入密度为每毫升为1×105个HeLa细胞2mL，放在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时。之后，配制浓度为10μM荧光探针III-A或III-B的培养基，标记染色1小时，去除培养基后用PBS贴壁冲洗3次，再用4％多聚甲醛固定10min得到超分辨成像的样品。超分辨成像所使用的单分子定位显微镜是自搭建装置，该显微镜是基于宽场照明的结构装置，配有数值孔径为1.5的100倍油浸物镜、四种激光器(405nm、488nm、561nm和640nm)、sCMOS相机、相应的二向色镜(用于激发光和发射光的分离)、滤光片(抑制非信号发射光)和柱面镜(用于三维成像)。对于III-A或III-B标记的HeLa细胞，在超分辨成像溶液(50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，10mmol/LNaCl，10％(W/V)葡萄糖，0.5mg/mL葡萄糖氧化酶，40μg/mL过氧化氢酶和35mmol/Lβ-巯基乙胺)中进行成像，采集参数为20ms的曝光时间和50000帧的采集帧数。在成像过程中，我们用561nm激光(2kW/cm2)进行激发，同时用405nm激光(0.1W/cm2)对荧光基团进行激活，并对575-625nm波段范围的发射光进行收集。对于获得的原始数据，我们用SMAP软件进行定位点信息(如坐标、光子数和定位精度等)的提取及超分辨图像的重构。如图13所示，图(A)和图(B)分别为荧光探针分子III-A和III-B在单个HeLa细胞中特异性标记脂滴的超分辨图像，区域1，2，3和4分别清晰地显示出单个脂滴的三维构象分布。其中左图标尺为1μM，右侧放大图标尺均为200nm，颜色标尺代表z轴位置。中间图像为对应白框区域的放大图，显示出单个脂滴在xy方向的形态分布，标尺为200nm；右侧图像为对应虚线区域的z轴剖面图，显示出单个脂滴在z方向的形态分布，标尺为200nm。超分辨图像可以清晰地显示出荧光探针分子III在HeLa细胞中对脂滴的特异性标记，同时清晰的得到脂滴的空间三维分布及结构形态。本发明人认为该荧光探针分子Ⅲ在脂滴成像领域具备优良的光物理稳定性。
综上所述，相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的基于激发态质子转移的聚集诱导发光材料荧光探针分子采用市面上易购得的较为廉价的原材料反应制得，例如2-羟基-1-萘甲醛、水合肼以及对位取代苯甲醛等，该方法通过将2-羟基-1-萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到式(Ⅰ)所示化合物，再将所述式(Ⅰ)所示化合物与对位取代苯甲醛在对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到荧光探针分子III，此方法所用到的原材料价格低廉，容易获得，并且合成路线清晰，合成步骤简单，以及产物的产量达到90％左右，产率较高，该方法获得的荧光探针分子Ⅲ具备广泛应用的潜质。
(2)所述荧光探针分子Ⅲ展示了明显的激发态质子转移效应(ESIPT)，荧光探针分子Ⅲ质子转移荧光效率高、stokes位移大，具有(AIE)聚集诱导发光性质，拥有良好的光稳定性；
(3)所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ具有良好的细胞膜通透性，能够特异性的靶向标记脂滴；说明荧光探针III在一定范围内对HeLa细胞几乎没有毒性，可用于共聚焦的共定位成像和细胞内脂滴的超分辨成像；超分辨图像可以清晰地显示出荧光探针分子III在HeLa细胞中对脂滴的特异性标记，同时清晰的得到脂滴的空间三维分布及结构形态。
(4)所述的合成方法全程在惰性气体气氛中，以及无水的条件下进行，防止了水分子可能会与能够发生质子转移的基团形成多羟基化合物，从而阻碍异构化反应的过程，使得ESIPT反应顺利进行，提高反应的产率。
通过上述实施例以及检测实验的结果可知：本发明方法具有合成简单、产率较高和原料价廉的特点；荧光探针分子III展示了明显的激发态质子转移效应和聚集诱导发光性质，拥有良好的光稳定性和生物相容性，对细胞内的脂滴具有优异的靶向性，实现了在细胞内对脂滴的超分辨荧光成像。因此，本发明对于脂滴生理行为与相关疾病的深入研究具有非常重要的生物学意义。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (10)

1.一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于该材料对于标记脂滴具有更好的光稳定性以及成像效果，其结构由下述通式(A)表示：
Figure FDA0004119749080000011
其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
2.如权利要求1所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：以无水乙醇为溶剂，在惰性气氛中，将2-羟基-1-萘甲醛和水合肼回流反应至完全，分离纯化产物，得到化合物Ⅰ；
Figure FDA0004119749080000012
步骤(2)：以无水甲醇为溶剂，在惰性气氛中，将所述化合物Ⅰ与对位取代苯甲醛Ⅱ在催化量的对甲苯磺酸催化作用下，加热回流反应至完全，分离纯化产物，得到所述式(A)所示化合物，ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ，
Figure FDA0004119749080000013
其中，R选自吗啉基或者哌啶基。
3.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，2-羟基-1-萘甲醛与水合肼的摩尔比为1:5～8。
4.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在每mmol的所述2-羟基-1-萘甲醛中加入无水乙醇10-20mL进行稀释。
5.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，回流反应的时间为4-6小时。
6.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述化合物Ⅰ与化合物Ⅱ对位取代苯甲醛的摩尔比为1:1.05～1.1。
7.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在每mmol的所述化合物Ⅰ中加入的对甲苯磺酸摩尔量为所述化合物Ⅰ的1～2％mmol。
8.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在每mmol的所述化合物Ⅰ中加入无水乙醇5-15mL进行稀释。
9.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，回流反应的时间为10-12小时。
10.如权利要求2所述的一种基于质子转移的单分子定位超分辨成像染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中回流反应结束后，将得到的所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ冷却至室温，减压、旋转、蒸发、除去反应溶剂，干燥后，将所得固体经硅胶柱层析纯化，得到纯化后的所述ESIPT聚集诱导发光型荧光分子Ⅲ。
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