CN116338210A - 用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒 - Google Patents
用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒；属于生物检测技术领域；该生物标志物包括丙氨酸、C4‑肉碱、C14‑肉碱中一种，或多种的组合；一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，该检测试剂用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物。一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒；生物标志物为从生物基质中筛选得到的标志代谢物，作为原发性中枢神经系统淋巴瘤标志物，具有高通量、取材简单、特异性高的优点，有效提高了诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的准确性，能够对原发性中枢神经系统淋巴瘤的进行特异性筛查。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒。
背景技术
原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）是一种罕见且高度恶性的非霍奇金淋巴瘤，主要在大脑、颅神经、软脑膜、脑脊液（CSF）、眼内结构和脊髓中侵袭性传播。PCNSL约占所有脑肿瘤的2%至3%，发病率为0.47/100000，近年来呈上升趋势，主要影响老年人和免疫功能低下人群。因为临床表现因涉及中枢神经系统的区域而异，PCNSL的诊断具有挑战性。
目前，PCNSL的诊断通常包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）以及活检或其他组织样本分析。但是，由于MRI表型不是特异性的，很难与神经胶质瘤、壁内感染和非感染性炎症区分开来。活检或其他组织样本的病理检查是诊断PCNSL的金标准，然而，活检有并发症的风险，如出血、感染或神经损伤，特别是在肿瘤位于大脑敏感区域的情况下，并且由于较少的组织或先前的激素使用，也可能导致假阴性结果。
发明内容
有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物，该生物标志物包括下述物质的一种，或多种的组合：
丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱。
另一方面，一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，该检测试剂用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物。
进一步，一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，检测试剂
包括：
萃取液，用于提取生物标志物；
分离液，用于分离提取的生物标志物。
再一方面，一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂的应用，用于制备诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒包含用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物的检测试剂；生物标志物为丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱中的任一种，或多种的组合。
又一方面，一些实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，包括用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂。
进一步，一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，该检测试剂盒的检测样本为脑脊液。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒对脑脊液样本的检测包括：
将设定量的脑脊液样本与检测试剂混合；
混合后进行连续涡旋，使蛋白质沉淀；
将涡旋样品进行离心分离，收集下清液，用于检测。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒对脑脊液样本的检测还包括：
将收集的下清液作为样本，进行质谱分析；具体包括：
采用高效液相色谱系统采用Vanquish UHPLC系统，三重四级杆质谱仪采用Altis质谱仪；
流动相为：含有甲酸、甲酸铵的甲醇-水溶液；
质谱仪条件为：
电离方式：电喷雾电离，ESI（+）；
离子喷雾电压：3.5kV；
鞘气（Arb）：20；
辅助气（Arb）：5；
吹扫气（Arb）：0；
离子传输毛细管温度（℃）： 300；
喷雾器温度（℃）：200；
检测方式：选择反应监测（SRM）；
循环时间（sec）：0.8；
Q1分辨率（FWHM）：0.7；
Q3分辨率（FWHM）：0.7；
碰撞气（mTorr）： 1.5；
源内裂解电压（v）：0。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，还包括质控品、内标液中的一种，或两种的组合。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒对脑脊液样本的检测还包括：
利用检测得到的生物标志物数据，构建原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断检测模型。
本发明实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒；生物标志物为从生物基质中筛选得到的标志代谢物，作为原发性中枢神经系统淋巴瘤标志物，具有高通量、取材简单、特异性高的优点，有效提高了诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的准确性；提供的检测试剂能够对生物标志物进行有效提取，提高了生物标志物的检出率；提供的检测试剂盒包含具有高灵敏度和特异性的新型低创伤生物标志物，能够对原发性中枢神经系统淋巴瘤的进行特异性筛查。
附图说明
图1 实施例1原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断中丙氨酸的信号强度值；
图2 实施例1原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断中C4-肉碱的信号强度值；
图3 实施例1原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断中C14-肉碱的信号强度值；
图4 实施例1正常组与原发性中枢神经系统淋巴瘤组ROC曲线图。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本发明实施例中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明实施例公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明实施例所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明实施例中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5%，如小于或等于±2%，如小于或等于±1%，如小于或等于±0.5%，如小于或等于±0.2%，如小于或等于±0.1%，如小于或等于±0.05%。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5%”的数值范围应被解释为不仅包括1%至5%的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2%、3.5%和4%，和子范围，如1%～3%、2%～4%和3%～5%等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
在不冲突的前提下，本发明实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本发明实施例公开的内容。
在一些实施方式中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物包括下述物质的一种，或多种的组合：
丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱。通常，生物标志物能够稳定存在于生物基质中，例如稳定存在于待测样本中。
通常，多种的组合是指丙氨酸和C4-肉碱，丙氨酸和C14-肉碱，C4-肉碱和C14-肉碱两种组合作为生物标志物；三种的组合是指丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱三种组合同时作为生物标志物。通常情况下 ，生物标志物包含的种类越多，检测准确性越高。一般地，两种物质组合的生物标志物，其检测结果比一种物质的生物标志物检测准确性高，三种物质组合的生物标志物，其检测结果准确性高于两种物质组合的生物标志物。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，能够用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂包括：
萃取液，用于提取生物标志物；
分离液，用于分离提取的生物标志物。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂中，萃取液为包含1‰盐酸、1% β-巯基乙醇的甲醇溶液，分离液为正己烷。
通常，利用检测试剂提取检测样本中的代谢产物，以提取作为诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物，检测试剂通常包括萃取试剂，例如包含1‰盐酸、1% β-巯基乙醇的甲醇溶液可以作为萃取试剂，提取代谢物，还包括分离试剂，例如正己烷作为分离试剂，以便将提取的生物标志物分离，进行有效检测。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，用于制备诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒包含有检测试剂，其中的检测试剂用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物，生物标志物为丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱中的任一种，或多种的组合。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，包括用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒的检测样本为脑脊液。
一些实施例中，用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，对脑脊液样本的检测包括：
将设定量的脑脊液样本与检测试剂混合；
混合后进行连续涡旋，使蛋白质沉淀；
将涡旋样品进行离心分离，收集下清液，用于检测。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒对脑脊液样本的检测还包括：
将收集的下清液作为样本，进行质谱分析；具体包括：
采用高效液相色谱系统采用Vanquish UHPLC系统，三重四级杆质谱仪采用Altis质谱仪；
流动相为：含有甲酸、甲酸铵的甲醇-水溶液；
质谱仪条件为：
电离方式：电喷雾电离，ESI（+）；
离子喷雾电压：3.5kV；
鞘气（Arb）：20；
辅助气（Arb）：5；
吹扫气（Arb）：0；
离子传输毛细管温度（℃）： 300；
喷雾器温度（℃）：200；
检测方式：选择反应监测（SRM）；
循环时间（sec）：0.8；
Q1分辨率（FWHM）：0.7；
Q3分辨率（FWHM）：0.7；
碰撞气（mTorr）： 1.5；
源内裂解电压（v）：0。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，检测试剂盒对脑脊液样本的检测进一步包括：利用检测得到的生物标志物数据，构建原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断检测模型。
通常构建原发性神经系统淋巴瘤肿瘤诊断模型后，利用检测试剂盒处理待测样本，然后检测待测样本中的生物标志物信息，进一步将得到的生物标志物及其含量数据信息带入原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型进行打分，确定与临界值的关系；若试验样本的结果或称分值小于临界值，表明结果为阴性，即为非原发性中枢神经系统淋巴瘤，或原发性中枢神经系统淋巴瘤病变低风险；若试验样本的结果或称分值等于或大于临界值，表明结果为阳性，即为原发性中枢神经系统淋巴瘤，或原发性中枢神经系统淋巴瘤病变高风险。
通常情况下 ，生物标志物包含的种类越多，原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型进行打分后，确定的临界值更为准确，检测准确性越高。一般地，两种物质组合的生物标志物，其检测结果比一种物质的生物标志物检测准确性高，三种物质组合的生物标志物，其检测结果准确性高于两种物质组合的生物标志物。
一些实施例公开的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，还包括质控品、内标液中的一种，或两种的组合。通常地，质控品为已知待测物浓度的样品，用于试剂盒检测过程中的质量控制，内标液用于对待测物进行定量分析。以下结合实施例对技术细节做进一步示例性说明。
实施例1
生物标志物的筛选
方法设计：根据临床诊断确认结果，收集正常对照组与原发性中枢神经系统淋巴瘤患者组的脑脊液样品。经预处理后，通过质谱靶向分析脑脊液中的代谢提取物，并使用单变量分析比较正常对照组和原发性中枢神经系统淋巴瘤患者组脑脊液样本，旨在筛选出具有特异性的代谢物，作为生物标记物。
质谱分析：将5～15 µL脑脊液，添加5-15 µL内标液和50～200 µL萃取液及100～300 µL分离液进行提取，其中萃取液为含1‰盐酸和1% β-巯基乙醇的甲醇溶液，分离液为正己烷；将提取的样品连续涡旋20～120秒，使蛋白质沉淀；将涡旋样品以12,000g转速离心3～10分钟，进行分离；进行MS分析之前，收集75～85μL下清液，作为脑脊液提取物样品，在-20°C下保存或直接检测。
实施例1中，内标液包括下表1所列的标准品：
表1 标准品列表
质谱分析使用高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS），使用Security GuardUltracartridge–UPLC C18 2.1 mm ID色谱柱注射(phenomenex，Torrance , CA, US)。在正离子模式以及30°C下运行。
使用高效液相色谱系统和三重四级杆质谱仪，高效液相色谱系统采用VanquishUPLC系统，三重四级杆质谱仪采用Altis质谱仪（Thermo Scientific，San Jose，CA）。
流动相为：含有甲酸、甲酸铵的甲醇-水溶液。
Altis质谱仪参数设置如下：
电离方式：电喷雾电离，ESI（+）；
离子喷雾电压：3.5kV；
鞘气（Arb）：20；
辅助气（Arb）：5；
吹扫气（Arb）：0；
离子传输毛细管温度（℃）： 300；
喷雾器温度（℃）：200；
检测方式：选择反应监测（SRM）；
循环时间（sec）：0.8；
Q1分辨率（FWHM）：0.7；
Q3分辨率（FWHM）：0.7；
碰撞气（mTorr）： 1.5；
源内裂解电压（v）：0。
将2 µL脑脊液提取物注入UHPLC系统进行检测实验。通过检测获得扫描后的碎片离子丰度，根据相对定量计算方法，使用目标代谢物的定量检测结果作为预测指标，基于所选代谢物的重要权重，进行模型分析，将原发性中枢神经系统淋巴瘤患者与正常对照区分开。
实验受试者队列共邀请69名，其中正常受试者36名，原发性中枢神经系统淋巴瘤患者33名，每个受试者均采集了脑脊液样本，其临床特征和人口学特见表2；
表2、队列临床特征和人口学特征
在45种代谢物的靶向定量质谱分析中，筛选出三种代谢物：丙氨酸、C4-肉碱和C14-肉碱用于原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断。图1～图3分别列出了原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断中各生物标志物丙氨酸（Alanine）、C4-肉碱(C4-Carnitine)和C14-肉碱(C14-Carnitine)在发现组合测试组的信号强度值。
表3列出了原发性中枢神经系统淋巴瘤受试者与正常受试者的三种代谢标志物的单变量分析结果。
表3 原发性中枢神经系统淋巴瘤与正常受试者单变量分析表
检测模型的构建
用包含至少一种代谢标志的生物标志物，进行原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断检测模型的构建。
本实施例1使用RF算法构建包含本发明所述的三种代谢标志物的原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断算法，即原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型，然后对该模型性能进行评估，通过特异性、敏感性及AUC值，确定原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断临界值；AUC（AreaUnder Curve）值，用于评价检测方法或预测方法的优劣性，AUC最优值对应的点即为临界值。
RF算法是“随机森林”（Random Forest）的简称，随机森林模型由多个决策树组成，每棵树都独立地对输入样本的分类进行预测。最终的分类结果是通过对所有树的预测结果进行投票来得到的。该算法相较于其他分类模型算法的优点在于，通过增加参数随机性以防止过拟合，计算过程易于并行化，模型参数可解释等多个方面。
将实施例1得到的三种代谢标志物代入RF算法中，得出含有100棵决策树的原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型。从0到1依次设定设置点作为为阈值，并计算该设置点的特异性和敏感性，以得到AUC值最优的点，将其作为临界值。
若试验样本的结果或称分值小于临界值，表明结果为阴性，即为非原发性中枢神经系统淋巴瘤，或原发性中枢神经系统淋巴瘤病变低风险；
若试验样本的结果或称分值等于或大于临界值，表明结果为阳性，即为原发性中枢神经系统淋巴瘤，或原发性中枢神经系统淋巴瘤病变高风险。
使用五折交叉法验证原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型的性能水平如表4所示。
表4 原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型的性能水平
如图4为正常组与原发性中枢神经系统淋巴瘤组ROC曲线图。对于原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型总的ROC（Receiver Operating Characteristic）的AUC（Area UnderCurve）为0.86，表明实施例1的检测方法效果良好。并将区分值对应的阈值设为检测方法的临界值，本实施例1原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型获得的临界值为0.51，低于0.51判断为阴性，为非原发性中枢神经系统淋巴瘤；等于或大于0.51判断为阳性，为原发性中枢神经系统淋巴瘤，或原发性中枢神经系统淋巴瘤病变高风险。
实施例2
试剂盒及试剂盒对检测样本的检测方法
试剂盒包含有萃取液、内标液、分离液，以脑脊液为检测样本；萃取液为含1‰盐酸和1% β-巯基乙醇的甲醇溶液，分离液为正己烷；
取10 µL脑脊液，其中添加10 µL内标工作液和90 µL萃取液及200 µL分离液进行提取。将提取的样品连续涡旋60秒，使蛋白质沉淀；
将涡旋样品以12 ,000 g转速，离心5分钟，进行分离；
进行MS分析之前，收集80 μL下清液，作为脑脊液提取物样品用于检测；
使用高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS），使用Vanquish UHPLC系统和TSQ AltisTM三重四级杆质谱仪（Thermo Scientific，San Jose，CA）。流动相为：含有甲酸、甲酸铵的甲醇-水溶液。
将2 µL脑脊液提取物样品注入UHPLC系统，样品通过30℃ Security GuardUltracartridge–UPLC C18 2.1 mm ID色谱柱，在ESI正离子模式注入；
通过质谱法得到丙氨酸、C4-肉碱和C14-肉碱三种代谢物的含量，代入原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断模型进行打分，得分值小于临界值0.51，结果为阴性即原发性中枢神经系统淋巴瘤低风险。
本发明实施例公开了用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物及检测试剂盒；生物标志物为从生物基质中筛选得到的标志代谢物，作为原发性中枢神经系统淋巴瘤标志物，具有高通量、取材简单、特异性高的优点，有效提高了诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的准确性；提供的检测试剂能够对生物标志物进行有效提取，提高了生物标志物的检出率；提供的检测试剂盒包含具有高灵敏度和特异性的新型低创伤生物标志物，能够对原发性中枢神经系统淋巴瘤的进行特异性筛查。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括下述物质的一种，或多种的组合：
丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱。
2.用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂用于提取权利要求1所述的生物标志物。
3.根据权利要求2所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括：
萃取液，用于提取生物标志物；
分离液，用于分离提取的生物标志物。
4.用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂的应用，其特征在于，用于制备诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于提取诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的生物标志物的检测试剂，所述生物标志物为丙氨酸、C4-肉碱、C14-肉碱中的任一种，或多种的组合。
5.用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的检测样本为脑脊液。
7.根据权利要求6所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，所述检测试剂盒对脑脊液样本的检测包括：
将设定量的脑脊液样本与检测试剂混合；
混合后进行连续涡旋，使蛋白质沉淀；
将涡旋样品进行离心分离，收集下清液，用于检测。
8.根据权利要求7所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，所述检测试剂盒对脑脊液样本的检测还包括：
将收集的下清液作为样本，进行质谱分析；具体包括：
采用高效液相色谱系统采用Vanquish UHPLC系统，三重四级杆质谱仪采用Altis质谱仪；
流动相为：含有甲酸、甲酸铵的甲醇-水溶液；
质谱仪条件为：
电离方式：电喷雾电离，ESI（+）；
离子喷雾电压：3.5kV；
鞘气（Arb）：20；
辅助气（Arb）：5；
吹扫气（Arb）：0；
离子传输毛细管温度（℃）： 300；
喷雾器温度（℃）：200；
检测方式：选择反应监测（SRM）；
循环时间（sec）：0.8；
Q1分辨率（FWHM）：0.7；
Q3分辨率（FWHM）：0.7；
碰撞气（mTorr）： 1.5；
源内裂解电压（v）：0。
9.根据权利要求8所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒对脑脊液样本的检测还包括：
利用检测得到的生物标志物数据，构建原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断检测模型。
10.根据权利要求5～9任一项所述的用于诊断原发性中枢神经系统淋巴瘤的检测试剂盒，其特征在于，还包括质控品、内标液的一种，或两种的组合。
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