CN116333156A - 一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 - Google Patents
一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116333156A CN116333156A CN202210811738.0A CN202210811738A CN116333156A CN 116333156 A CN116333156 A CN 116333156A CN 202210811738 A CN202210811738 A CN 202210811738A CN 116333156 A CN116333156 A CN 116333156A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ccl14
- recombinant protein
- tumor
- binding domain
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 101000978381 Homo sapiens C-C motif chemokine 14 Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102100023705 C-C motif chemokine 14 Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title abstract description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 101150088027 CCL14 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胶原结合域融合CCL14重组蛋白及其应用。所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明创新性的将趋化因子CCL14应用于肿瘤免疫治疗中。比起单纯的CCL14蛋白，小鼠经过重组蛋白治疗后，肿瘤重量更轻，肿瘤体积更小。因此，使用胶原结合域融合CCL14重组蛋白对肿瘤进行免疫治疗是一种可行的，创新的，科学的方案。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胶原结合域融合CCL14重组蛋白及其应用。
背景技术
肿瘤是目前人类健康的首要威胁，2021年全球新发癌症病例1929万例，其中男性1006万例，女性923万例；2021年全球癌症死亡病例996万例，其中男性553万例，女性443万例。由于对肿瘤的机制了解尚不充分，肿瘤患者的生存率不容乐观，因此肿瘤的治疗是当今科学界关注的重点问题之一。
相较于传统治疗方法，肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的针对肿瘤的有效治疗手段，比如通过靶向免疫检查点PD-1(programmed cell death protein-1，程序性细胞死亡蛋白-1)作为治疗策略对肿瘤进行治疗，取得了显著的进展。但是由于不同患者的肿瘤表型不同，肿瘤免疫治疗不能对所有患者都有作用，因此寻找新的免疫治疗靶点是非常重要的。
趋化因子是可以引起肿瘤微环境改变的一类重要细胞因子，同时也是细胞因子中最庞大的亚族，因为其具备的定向趋化细胞的能力，所以成为了调节肿瘤微环境的关键因子。肿瘤微环境是肿瘤细胞和宿主免疫系统相互作用的主要场所，多种免疫细胞通过趋化因子和趋化因子受体之间的相互作用迁移到肿瘤微环境中，这些免疫细胞和趋化因子在肿瘤微环境中发挥的作用对肿瘤的发生发展和治疗结果有重要的影响。针对趋化因子展开的肿瘤免疫治疗已经取得较大进展，具有光明的发展前景。
CCL14是一种CC型趋化因子，在多种肿瘤数据库中它的高表达与肿瘤患者预后良好有关，这提示了CCL14可能具有抑癌功能。虽然CCL14被认为具有抑癌功能，但关于CCL14通过免疫系统发挥抑癌作用的研究尚不深入，只有寥寥几篇论文初步提及，如何将CCL14应该于肿瘤免疫治疗尚没有有效的技术。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种胶原结合域融合CCL14重组蛋白及其应用。
第一方面，本发明提供一种胶原结合域融合CCL14重组蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
第二方面，本发明提供所述重组蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本发明提供含有所述基因的重组表达载体。
第四方面，本发明提供所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：
将SEQ ID NO.2所示基因序列用无缝克隆方法插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点EcoR I和Xho I之间。
第五方面，本发明提供所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将所述的重组表达载体转染至293F细胞，并进行培养；
S2、将培养七天的细胞离心，收集上清；将上清与His标签蛋白纯化试剂盒中的镍离子珠在4℃摇床共孵育3h，孵育后将上清加入层析柱，进行洗涤和洗脱，洗脱的蛋白用5KDa孔径的透析袋透析，所得液体即胶原结合域融合CCL14重组蛋白。
第六方面，本发明提供所述重组蛋白、所述基因或所述重组表达载体在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
进一步的，所述所述肿瘤包括黑色素瘤。
本发明具有如下有益效果：
本发明创新性的将胶原结合域与趋化因子CCL14融合，使用重组蛋白对肿瘤进行治疗，取得了比单纯CCL14蛋白治疗更为显著的效果。因此，本发明为肿瘤免疫治疗提供了一种可行的，创新的，科学的方案。
附图说明
图1为pCDNA3.1-CCL14-his-CON重组质粒和pCDNA3.1-CCL14-CBD-his的示意图。
图2为纯化前的CCL14-his-CON和CCL14-CBD-his的western blot鉴定结果。
图3为纯化后的CCL14-his-CON和CCL14-CBD-his的western blot鉴定结果。
图4为CCL14-his-CON和CCL14-CBD-his对肿瘤的治疗作用，图A为肿瘤图像分析结果，图B为肿瘤体积的定量统计图，图C为肿瘤的质量的统计图。
图5为肿瘤切片的免疫荧光染色图，上三图标尺为80μm，下三图标尺为20μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：胶原结合域融合CCL14重组蛋白的获得
1实验方法
1.1载体设计、构建与鉴定
1.1.1载体构建
通过常规的分子克隆手段或人工合成如SEQ ID NO.2所示的胶原结合域融合CCL14基因(CCL14-CBD)和SEQ ID NO.3所示的对照基因(CCL14-CON)，使用EcoR1和Xho1进行酶切，电泳和胶回收；接着使用T4连接酶将酶切回收的目的片段和以及酶切好的pCDNA3.1载体连接，即得到过表达质粒pCDNA3.1-CCL14-his-CON以及含有胶原结合域的pCDNA3.1-CCL14-CBD-his。
1.1.2载体鉴定
在293T细胞中转染了过表达质粒pCDNA3.1-CCL14-his-CON以及含有胶原结合域的pCDNA3.1-CCL14-CBD-his。转染后48h收集蛋白并进行Western blot检测，使用His标签的抗体以及CCL14抗体在10KDa处附近均检测条带。
1.2重组蛋白的表达
1.2.1悬浮细胞293F的培养
我们使用悬浮细胞293F表达所需的重组蛋白。293F细胞使用Gibco公司的FreeStyleTM293无血清培养液进行培养，每2-3天传代一次。传代时使用800rpm转速离心5min，弃去上清。培养条件为37℃，125rpm，8％CO2的细胞培养摇床。
1.2.2质粒转染
转染293F时浓度应为1×106，转染体系为每毫升细胞4.5μL李记EZTrans转染试剂，1.5μg质粒以及60μL无血清培养液，将转染体系混匀后静置20min，加入到293F的培养瓶中。培养瓶放入摇床继续培养七天。
1.3重组蛋白纯化与鉴定
1.3.1重组蛋白纯化
使用碧云天公司的His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。将转染后培养七天的细胞1200rpm离心5min，收集上清；将培养的上清与His标签蛋白纯化试剂盒中的镍离子珠在4℃摇床共孵育3h，作为参考，每50mL培养液上清使用500μL镍离子珠。孵育后将上清加入层析柱，使用传统的NI-NTA buffer进行洗涤和洗脱。作为参考，洗脱液中咪唑浓度为250mM。
1.3.2重组蛋白透析
咪唑洗脱的蛋白不能直接用于小鼠肿瘤治疗，我们使用优博公司的5KDa孔径的透析袋，在过量的PBS中透析24h。透析后收集透析袋中的液体，该液体即为我们需要的重组蛋白。
1.3.3重组蛋白鉴定
得到重组蛋白后使用BCA定量法进行定量，定量后使用蛋白凝胶电泳以及考马斯亮蓝染色的方法进行鉴定。使用30mL考马斯亮蓝染色液将电泳后的凝胶染色3h，之后使用考染洗脱液过夜洗脱，并成像。
2实验结果
2.1根据实验目的，设计并得到了CCL14的过表达质粒pCDNA3.1-CCL14-his-CON以及含有胶原结合域的pCDNA3.1-CCL14-CBD-his。示意图为图1。
2.2成功在293F细胞中表达pCDNA3.1-CCL14-his-CON以及含有胶原结合域的pCDNA3.1-CCL14-CBD-his(图2，使用抗体为His tag)。
2.3成功在293F细胞中表达CCL14-his-CON(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)以及含有胶原结合域的CCL14-CBD-his(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并进行纯化和透析，透析后的蛋白进行western blot以及考染(图3)。
实施例2：胶原结合域融合CCL14重组蛋白对肿瘤的治疗作用
1实验方法
1.1 C57BL/c小鼠皮下荷瘤
使用小鼠黑色素瘤细胞B16/F10对6-8周的雄性C57BL/c小鼠进行皮下荷瘤。将汇合率达到80％～90％的肿瘤细胞使用胰蛋白酶消化到离心管中，离心弃去上清，离心管置于冰上。使用无菌PBS洗涤两次。吸取部分细胞悬液与血球计数板上，光学显微镜下计数，根据算出的浓度，使用PBS调整细胞悬液浓度为2.5×106个/mL。用1mL的一次性注射器，在小鼠背部-臀部之间的表皮下注射200μL混匀的细胞悬液，荷瘤细胞数为每只小鼠5×105个，共21只小鼠。7天后给小鼠剃毛，根据皮下肿瘤的相对大小编号，然后按每三个编号随机分组的方式将21只小鼠分为3组。
1.2尾静脉注射重组蛋白
在荷瘤后7天和14天，通过尾静脉注射的方式将300μL PBS，25μg的对照重组蛋白CCL14-his-CON，以及等摩尔的胶原结合重组蛋白CBD-CCL14-his。此后每2天使用游标卡尺测量皮下肿瘤体积。18天时将每组肿瘤体积最大和最小的两只排除，收集剩下5只小鼠的肿瘤，并称重。
1.3检测重组蛋白对肿瘤的浸润
在皮下荷瘤B16/F10 10天后的C57BL/c小鼠尾静脉注射300μL PBS，25μg的对照重组蛋白CCL14-his-CON，以及等摩尔的胶原结合重组蛋白CBD-CCL14-his。48h后收集肿瘤，多聚甲醛固定6h，并用质量体积比15％的蔗糖PBS溶液在4℃中过夜脱水。次日使用OCT包埋剂包埋，在-80℃冰冻后切成12μm的切片，并进行免疫荧光染色。使用3％BSA溶液封闭半小时，使用proteintech公司His标签抗体进行染色(稀释比1：1000，1％BSA，以及0.3％Triton)，二抗染色(1：500，1％BSA)，Hoechst染细胞核(1：4000，1％BSA)染色7-10min，封片，在共聚焦显微镜观察。
2实验结果
2.1重组蛋白CBD-CCL14-his在小鼠皮下荷瘤模型中发挥了抑癌作用。与对照组相比，经过CBD-CCL14-his重组蛋白治疗的荷瘤小鼠肿瘤体积和重量均明显下降。而注射对照组蛋白CCL14-his-CON的小鼠肿瘤体积与重量与PBS组无显著差异(图4)。
2.2免疫荧光显示，与注射了CCL14-his-CON蛋白的小鼠肿瘤相比，注射了CBD-CCL14-his蛋白的小鼠肿瘤中可以检测到明显的his标签(方框所示)，说明在注射后，CBD-CCL14-his可以更好的靶向肿瘤微环境(图5)。
综上结果说明，使用胶原结合域融合CCL14重组蛋白对肿瘤进行免疫治疗是一种可行的，创新的，科学的方案。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种胶原结合域融合CCL14重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述重组蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.权利要求3所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将SEQ ID NO.2所示基因序列用无缝克隆方法插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点EcoRI和Xho I之间。
5.权利要求1所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将权利要求3所述的重组表达载体转染至293F细胞，并进行培养；
S2、将培养七天的细胞离心，收集上清；将上清与His标签蛋白纯化试剂盒中的镍离子珠在4℃摇床共孵育3h，孵育后将上清加入层析柱，进行洗涤和洗脱，洗脱的蛋白用5KDa孔径的透析袋透析，所得液体即胶原结合域融合CCL14重组蛋白。
6.权利要求1所述重组蛋白、权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210811738.0A CN116333156A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210811738.0A CN116333156A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116333156A true CN116333156A (zh) | 2023-06-27 |
Family
ID=86893492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210811738.0A Pending CN116333156A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116333156A (zh) |
-
2022
- 2022-07-12 CN CN202210811738.0A patent/CN116333156A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110684739B (zh) | 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用 | |
| Wu et al. | Reduction of cytosolic p27Kip1 inhibits cancer cell motility, survival, and tumorigenicity | |
| CN106220736B (zh) | 一种嵌合抗原受体、表达其的细胞及其制备方法和用途 | |
| JP5936129B2 (ja) | ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質の部分領域ポリペプチド | |
| CN105031618A (zh) | 用于细胞因子递送的穹窿体复合物 | |
| CN112048018B (zh) | 一种嵌合t细胞生长因子及其应用 | |
| CN105802909A (zh) | 具有her2特异性tcr的t细胞制备物及其用途 | |
| CN111205361B (zh) | 白介素21蛋白(il21)突变体及其应用 | |
| CN105111315A (zh) | MIP3α-Fc融合蛋白及其用途 | |
| CN116333156A (zh) | 一种胶原结合域融合ccl14重组蛋白及其应用 | |
| CN108624607A (zh) | 靶向mesothelin的嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法和用途 | |
| Shin et al. | DNA-binding cell-penetrating peptide-based TRAIL over-expression in Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells inhibits glioma U251MG growth | |
| CN104434973A (zh) | 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法 | |
| CN107502596A (zh) | 表达ny‑eso‑1特异性tcr的t细胞及其应用 | |
| CN109111527B (zh) | 靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的gip34-vp3融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN111763264A (zh) | 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN116621946B (zh) | 多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用 | |
| CN112080510A (zh) | 靶向人源化gd2的嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN116496417B (zh) | 含有膜型il7的融合蛋白及t细胞 | |
| CN107557338A (zh) | 特异性识别ny‑eso‑1的t细胞及其与细胞因子的联合的应用 | |
| CN106943588A (zh) | 热休克蛋白gp96在治疗银屑病中的应用 | |
| CN111358959B (zh) | Roquin1蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤的药物中的应用 | |
| CN111184865B (zh) | Stat1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途 | |
| CN112080527A (zh) | 重组表达载体、耗竭减少的嵌合抗原受体t细胞及其应用 | |
| CN114075541A (zh) | 诱导肌肉干细胞扩增 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |