CN116333046A - 八肽、环八肽及衍生物、制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

八肽、环八肽及衍生物、制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种八肽、环八肽及衍生物、制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述的八肽S3的氨基酸残基序列如下所示：Asp‑Ser‑Phe‑Gly‑Leu‑Ser‑Trp‑Leu；环八肽S4为S3环化产物，其氨基酸残基序列：Cyclo(Ser‑Phe‑Gly‑Leu‑Ser‑Trp‑Leu‑Asp)。实验结果显示该八肽及其衍生物能能够显著增强TIMP‑1和TIMP‑2两种蛋白的表达，抑制MMP‑2与MMP‑9的活性，从而削弱非小细胞肺癌A549细胞转移和侵袭的能力，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径。

Description

八肽、环八肽及衍生物、制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种八肽、该八肽的环化物、两种肽的制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
癌症及恶性肿瘤是细胞恶性增殖的一类疾病，具有侵袭，扩散和远处转移的潜力。近年来，虽然在癌症化疗、放疗和免疫治疗方面取得巨大进展，但目前癌症仍然是全世界最主要的死亡原因。非小细胞肺癌(NSCLC)在全世界的患病率逐年上升，约75％支气管癌是非小细胞肺癌。肺癌患者由于早期转移以及缺乏有效的早期转移治疗，其五年生存率仅为8％-14％，因此抑制肺癌细胞转移是肺癌治疗的关键之一。
肿瘤细胞的转移和侵袭行为是癌细胞内多基因改变和突变共同调控的结果，主要涉及MMPs，c-Met，CD44，EGFR家族以及PAK家族等。癌细胞转移和侵袭行为与细胞外基质(ECM)的降解密切相关，而基质金属蛋白酶家族(MMPs)通过对细胞外基质成分的降解，在细胞外基质降解过程中起着至关重要的作用。
Ⅳ型胶原是ECM的基底膜屏障的主要成分，Ⅳ型胶原酶(MMP-2/MMP-9)是被研究得最多一类基质金属蛋白酶，在许多肿瘤中MMP-2与MMP-9均过表达。金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是一类一种能够调节MMP活性的小蛋白质，通常以1:1的化学计量与MMP的活性位点结合，两者表达水平的动态平衡决定了细胞外基质的降解程度，继而决定了肿瘤细胞的侵袭与转移。研究表明，TIMP-1、TIMP-2与MMP-2、MMP-9相互作用的结果与肿瘤细胞侵袭与转移具有相关性，其比值可以作为一些肿瘤恶性程度及判断预后的一项指标。
本发明构建了针对TIMP-1/TIMP-2转录水平的一种八肽、环八肽及其衍生物，该多肽能够增强TIMP-1和TIMP-2两种蛋白的表达，进而抑制MMP-2与MMP-9的活性，从而削弱非小细胞肺癌A549细胞转移和侵袭的能力，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径。
发明内容
本发明依托上述研究进行，提供了一种八肽、环八肽及衍生物、制备方法，同时还提供了其在制备抗肿瘤药物中的应用。该八肽和环八肽能有效抑制A549细胞的侵袭和转移，提高金属蛋白酶1(TIMP-1)和金属蛋白酶2(TIMP-2)的mRNA水平及蛋白表达水平，有效抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性，解决了肺癌细胞迁移和侵袭的问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种八肽S3，其特征在于，该八肽的氨基酸序列如下：Asp-Ser-Phe-Gly-Leu-Ser-Trp-Leu(SEQ ID NO.1)所示，结构如下式I所示：
Figure BDA0003926768530000021
本发明的第二方面，提供了一种环八肽S4，为上述八肽的环状物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：Cyclo(Ser-Phe-Gly-Leu-Ser-Trp-Leu-Asp)，结构如下式II所示：
Figure BDA0003926768530000022
本发明的第三方面，还提供了上述八肽和环八肽的衍生物。所述八肽的衍生物为在八肽氨基酸侧链基团上、氨基端、羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为八肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；环八肽的衍生物为在环八肽氨基酸侧链基团上进行常规修饰得到的产物，或者为环八肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物。
其中，常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、胆固醇化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇化修饰和固定化修饰中的任意一种。
本发明的第四方面，提供了八肽S3以及环八肽S4的制备方法，具体如下：
一、八肽合成：
(1)首个氨基酸偶联：固相载体树脂溶胀后，在缩合剂作用下使首个氨基酸的1-位羧酸与固相载体偶联，采用的缩合剂为HOBt-DMAP缩合体系，活化剂为DIC，溶剂为DMF；氨基酸、HOBt、DIC、DMAP间的摩尔比为3:3:3:1；
(2)封闭：加入吡啶和乙酸酐混合液，在25℃下振荡后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂多次后，抽真空干燥树脂；
(3)脱Fmoc保护：向步骤(1)中加入Oxyma、哌啶及DMF的混合溶液至树脂完全浸没，振荡后脱去树脂上的Fmoc基团，然后依次采用DCM、DMF洗涤；
(4)连接第二个氨基酸：根据步骤(1)中的条件，在缩合剂作用下连接下一个氨基酸，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸、Oxyma和DIC混溶于NMP中，加入到树脂中，于60℃下振荡一定时间后，依次用DCM、DMF多次洗涤树脂；
(5)重复进行脱保护-耦合-脱保护操作，直至所有氨基酸连接完成；
(6)八肽粗品制备及纯化：使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得到所述八肽，其中，所述切割剂为TIPS、H2O和TFA的混合溶液，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法。
上述各步骤的优选条件如下：
步骤(1)中，树脂采用DCM进行溶胀，树脂的载样量为0.57mmol/g；偶联反应的温度为50～60℃(优选55℃)，偶联反应的时间为20-30min，优选20min；
步骤(2)中，吡啶和乙酸酐的体积比为1:1，反应时的振荡时间为20min，而后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂3次后，抽真空干燥树脂；
步骤(3)中，Oxyma与哌啶及DMF溶液的质量体积比为0.71:1:4(mg/ml/ml)，进行脱保护时，在20～30℃连续振荡两次5min后，脱去树脂上的Fmoc基团，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次；
步骤(4)中，进行氨基酸连接时，在60℃下的振荡时间为20min，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次；
步骤(6)中，切割试剂中TIPS、H2O、PhOH和TFA的体积比为2.5:5:5:87.5，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg，切割的温度为20～30℃(优选25℃)，切割的时间为4h；
纯化条件如下：色谱柱：CST Daiso C18柱，10μm，30*250mm；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：25％B洗脱0～5min，25％B～65％B、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
二、环八肽制备：
(1)固相载体树脂溶胀后，在缩合剂作用下使首个氨基酸的1-位羧酸与固相载体偶联，采用的缩合剂为HOBt-DMAP缩合体系，活化剂为DIC，溶剂为DMF；氨基酸、HOBt、DIC、DMAP间的摩尔比为3:3:3:1；
(2)封闭：加入吡啶和乙酸酐混合液，在25℃下振荡后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂多次后，抽真空干燥树脂；
(3)脱Fmoc保护：向步骤(2)中加入Oxyma、哌啶及DMF的混合溶液至树脂完全浸没，两次振荡后脱去树脂上的Fmoc，然后依次采用DCM、DMF洗涤；
(4)连接第二个氨基酸：依次将Fmoc氨基酸、Oxyma和DIC混溶于NMP中，加入到树脂中，于60℃下振荡一定时间后，依次用DCM、DMF多次洗涤树脂；
(5)重复进行脱Fmoc保护-耦合-脱Fmoc保护操作，直至所有氨基酸连接完成；
(6)脱保护及固相环合：采用四三苯基膦钯、苯硅烷及DCM混合溶液作为反应剂，避光反应脱OAllyl保护后，采用哌啶及DMF的混合溶液脱Fmoc保护，而后加入PyAOP、HOAt、NMM及无水DMF混合溶液进行固相环合，该过程重复1次；
(7)八肽粗品制备及纯化：使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得到所述八肽，其中，所述切割剂为TIPS、H2O和TFA的混合溶液，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法。
其中，步骤(1)中，树脂选用Wang树脂，采用DCM进行溶胀，树脂的载样量为0.59mmol/g；偶联反应的温度为25～28℃(优选28℃)，偶联反应的时间为10-15h(优选15h)。
步骤(2)中，吡啶和乙酸酐的体积比为1:1，反应时的振荡时间为20min，而后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂3次后，抽真空干燥树脂。
步骤(3)中，Oxyma与哌啶及DMF溶液的质量体积比为0.71:2:4(mg/ml/ml)，进行脱保护时，在20～30℃连续振荡两次5min后，脱去树脂上的Fmoc基团，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
步骤(4)和步骤(5)中，氨基酸、Oxyma、DIC、NMP间的摩尔比为1:1:1:10；进行氨基酸连接时，在60℃下的振荡时间为20min，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
步骤(6)中，直链肽、四三苯基膦钯与苯硅烷的摩尔比为5:1:100；直链肽、PyAOP、HOAt、NMM间的摩尔比例为1:5:5:10，混合溶液浓度为0.02M。
步骤(7)中，切割试剂中TIPS、PhOH、H2O和TFA的体积比为2.5:5:5:87.5，切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg，切割的温度为20～30℃，切割的时间为4h；
纯化条件如下：色谱柱：CST Daiso C18柱，10μm，30*250mm；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：25％B洗脱0～5min，25％B～65％B、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
本发明的第五方面，提供了八肽、环八肽及其衍生物的用途，具体在制备抗肿瘤药物中的用途。优选的，该抗肿瘤药物为增强肿瘤细胞内TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达或蛋白表达的药物。
实现结果显示，该八肽和环八肽能有效抑制A549细胞的侵袭和转移，提高金属蛋白酶1(TIMP-1)和金属蛋白酶2(TIMP-2)的mRNA水平及蛋白表达水平，进而有效抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性，解决了肺癌细胞迁移和侵袭的问题。因此，肿瘤优选为肺癌。
本发明的第六方面，提供了八肽及环八肽的衍生物，如包含八肽或环八肽的重组表达载体、包含该重组表达载体的细胞以及抗肿瘤药物组合物。该药物组合物包括活性组分以及药学上可接受的辅料，所述活性组分以八肽或环八肽及其衍生物为唯一活性组分，也可以和其他抗肿瘤药物联用。
本发明的药物组合物可以和药学上常用的辅料制成多种剂型，例如其可以是为汤剂、散剂、丸剂、注射剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂等。给药方式不限于口服、注射等。
附图说明
图1为直链八肽S3的合成流程图；
图2为环八肽S4的合成流程图；
图3为纯化后的八肽S3与环八肽S4的高效液相色谱图；
图4为纯化后的八肽S3与环八肽S4的质谱图；
图5为使用CCK8试剂分析八肽S3与环八肽S4对A549细胞的增殖抑制作用结果；
图6为多肽抑制A549细胞侵袭作用的分析结果；
图7为多肽对A549细胞中TIMP-1、TIMP-2、MMP-2及MMP-9蛋白水平的影响结果；
图8为多肽作用于A549细胞后，肿瘤细胞中TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平的变化结果。
图9为Sungsanpin类似物Sun A的结构。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1直链肽S3的制备
1、八肽S3的合成
合成流程如图1所示，具体合成步骤如下：
(1)化合物1的制备
①溶胀：取0.1mmol王树脂(载样量为0.59mmol/g)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20min使树脂充分溶胀，抽干待用。
②连接第一个氨基酸：将序列中第一个氨基酸0.3mmol Fmoc-Leu-OH、0.3mmolHOBt、0.1mmol DMAP、0.3mmol DIC、混溶于10ml DMF中，加入到树脂中常温下振荡，过夜，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
③封闭：加入吡啶:乙酸酐(1:1)混合液10ml在25℃下震荡20min，依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次后，抽真空干燥树脂。
④脱Fmoc保护：加20％哌啶-DMF溶液、0.1M Oxyma至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次③连接第二个氨基酸：将序列中第二个氨基酸1.0mmol Fmoc-Trp(Boc)-OH、1.0mmol Oxyma和1.0mmol DIC混溶于10ml NMP中，加入到树脂中60℃下振荡20min，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(2)直链肽树脂2的制备
重复②③步骤的做法，根据多肽序列依次将1.0mmol Fmoc氨基酸、1.0mmol Oxyma和1.0mmol DIC混溶于10ml NMP，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。
脱Fmoc保护：加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyma)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次，得直链肽树脂2。
(3)目标八肽S3的制备
将树脂洗净抽干，加入TIPS:PhOH:H2O:TFA＝2.5:5:5:87.5(V/V/V/V)15mL，常温下振荡4h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓吹30min，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，继续用冰乙醚反复洗涤离心三次，得八肽粗品。
2、目标八肽S3的纯化
将粗肽用乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。分离条件如下：
仪器：Pre-HPLC，Agilent 1100高效液相色谱仪；
色谱柱：CST Daiso C18柱，10μm，30*250mm；
流动相：流动相A为0.1％TFA的水溶液，流动相B为0.1％TFA的乙腈溶液；
步骤与参数：25％B洗脱0～5min，25％B～65％B、5～60min；流速为10ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
实施例2本发明环肽S4的制备
1、环八肽S4的合成
合成流程如图2所示，具体合成步骤如下：
(1)化合物3的制备
①溶胀：取0.1mmol王树脂(载样量为0.59mmol/g)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20min使树脂充分溶胀，抽干待用。
②连接第一个氨基酸：将序列中第一个氨基酸0.3mmol Fmoc-Asp(OAllyl)-OH、0.3mmol HOBt(、0.1mmol DMAP、0.3mmol DIC、混溶于10ml DMF中，加入到树脂中常温下振荡，过夜，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
③封闭：加入吡啶:乙酸酐(1:1)混合液10ml在25℃下震荡20min，依次用DCM、DMF、无水乙醚洗涤树脂各3次后，抽真空干燥树脂。
(2)化合物4的制备
①脱Fmoc保护：加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyma)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
②连接第二个氨基酸：将序列中第二个氨基酸1.0mmol Fmoc-Leu-OH、1.0mmolOxyma和1.0mmol DIC混溶于10ml NMP中，加入到树脂中60℃下振荡20min，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(3)化合物5的制备
重复(2)中①②步骤的做法，根据多肽序列依次将1.0mmol Fmoc氨基酸、1.0mmolOxyma和1.0mmol DIC混溶于10ml NMP，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成，得到直链肽树脂5。
(4)化合物6的制备
①脱OAllyl保护：将线性八肽-树脂复合物从固相合肽管取出到玻璃管中，向玻璃管中加入无水DCM没过树脂，使树脂溶胀，加入0.02mmol四三苯基膦钯，2mmol苯硅烷及DCM(2ml)混合溶液。避光反应4h，待反应完成后依次用DCM、DMF洗涤树脂各10次，抽真空干燥树脂。
②脱Fmoc保护：加20％哌啶-DMF溶液(0.1M Oxyma)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
③固相环合：加2.5mmol PyAOP、2.5mmol HOAt、2.5mmol NMM及无水DMF(15ml)混合溶液，反应4h。抽去反应液，重新加入2.5mmol PyAOP、2.5mmol HOAt、2.5mmol NMM及无水DMF(15ml)混合溶液，过夜，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。
(5)目标环八肽S4的制备
将树脂洗净抽干，加入TIPS:PhOH:H2O:TFA＝2.5:5:5:87.5(V/V/V/V)15mL，常温下振荡4h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，继续用冰乙醚反复洗涤离心三次，吹干得环八肽粗品。
2、目标S4环八肽的纯化
将环八肽粗品用乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。分离条件如下：
仪器：Pre-HPLCAgilent 1100高效液相色谱仪；
色谱柱：CST Daiso C18柱，10μm，30*250mm；
流动相：流动相A为0.1％TFA的水溶液，流动相B为0.1％TFA的乙腈溶液；
步骤与参数：25％B洗脱0～5min，25％B～65％B、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
八肽S3与环八肽S4的高效液相色谱图参见图3，质谱图参见图4。分析型高效液相色谱HPLC确定目标多肽的纯度达到90％，质谱法确定结构正确。
实施例3CCK8实验测定肿瘤细胞A549存活率
本实施例系统研究了八肽S3与环八肽S4对A549肿瘤细胞的增殖抑制作用。将A549以5000个/孔的密度种于96孔板中，并在37℃和5％CO2的加湿无菌培养箱中培养过夜，然后用指定浓度(12.5μM，25μM，50μM，100μM)的多肽稀释液处理细胞72h，而后轻轻吸出培养液。CCK-8试剂溶液按体积比1：10溶于无血清培养基中，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用酶标仪在450nm处记录吸光值。
CCK-8实验结果参见图5，不同浓度八肽S3与环八肽S4下细胞的存活率基本无差异，表明八肽S3与环八肽S4不能有效杀伤A549细胞，对A549细胞增殖没有明显的抑制作用。
实施例4抑制肿瘤细胞侵袭实验
本实施例研究了八肽S3与环八肽S4对A549肿瘤细胞的迁徙及侵袭能力的抑制作用：以DMSO作为空白对照。100μM S3、S4稀释液分别处理细胞24小时后，吸弃培养基并用PBS清洗2遍后，用DMEM无血清培养基饥饿处理细胞6h，常规消化离心后用无血清培养基调整细胞浓度为3×105，备用。在24孔转移板中预先加入600μL含10％FBS的培养基(含1％双抗)，并放入Transwell小室。使用Biozellen3D类器官培养基质胶套装将基质胶按照使用步骤种于上室底部，待基质胶成胶状后在Transwell上室分别接入200μL各组细胞悬液，37℃，5％CO2培养箱培养48h。取出Transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用无菌棉签将上室一侧未迁移的细胞轻轻擦掉，用10％甲醛溶液固定细胞30min。将小室用PBS浸泡清洗3遍，5min/遍，用5％结晶紫染色液室温下染色20min，PBS清洗干净后显微镜下观察拍照。计算穿过基质胶并转移至小室下的细胞数目，并计算细胞侵袭抑制率：侵袭抑制率(％)＝1-(给药组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100％。
结果如图6所示，与空白对照组相比，S3与S4对A549肺癌细胞的侵袭与迁徙能力均具有不同程度的抑制作用。
实施例5通过western blot法从蛋白质水平检测迁徙与侵袭相关蛋白表达的影响
对数生长期的A549细胞常规消化离心，重悬计数后，按7×105/well的密度种于6孔板中，37℃，5％CO2培养箱过夜培养。用指定浓度的SunA(结构参见图9)，S3、S4稀释液处理细胞24h，随后用无血清培养基取代原有培养液饥饿处理细胞6h。加入细胞裂解液120μL，并用BCA法测定蛋白浓度。取40μg蛋白样品，经电泳分离后转移至NC转移滤膜上，用50mg/mL脱脂奶粉/PBS封闭2h。加入一抗(1：1000兔抗人单克隆抗体)，4℃孵育过夜，次日用PBST洗膜5次，加入二抗(1:5000HRP标记的养抗兔抗体)，室温孵育1h，用PBST洗膜5次，加入ECL化学发光底物，在Odyssey红外激光成像系统下扫描，并拍摄戴白条带。
结果如图7所示，与空白对照组相比，给药组的基质蛋白酶组织性抑制因子TIMP-1和TIMP-2蛋白表达均升高，对MMP-2和MMP-9蛋白表达没有明显影响。
实施例6通过qPCR法从RNA水平检测迁徙与侵袭相关mRNA表达的影响。
用100μM S3、S4及阳性药物Sungsanpin稀释液处理A549肺癌细胞24h，按照Beyotime动物RNA抽提试剂盒说明提取总RNA，使用RevertAidTM cDNA synthesis反转录试剂盒逆转录成cDNA。随后使用Applied Biosystems对等量的cDNA制备物进行PCR分析。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，40次循环，60℃变性30s。
扩增过程中使用的引物序列如下：
(1)TIMP-1：正向引物5′-ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG-3′(SEQ ID NO.3)；反向引物5′-TGCTGGGTGGTAACTCTT TATTTCA-3′(SEQ ID NO.4)。
(2)TIMP-2：正向引物5′-AAACGACATTTATGGCAACCCTATC-3′(SEQ ID NO.5)；反向引物5′-ACAGGAGCCGTCACTTCTCTTGATG-3′(SEQ ID NO.6)；
(3)GAPDH：正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′(SEQ ID NO.7)；反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′(SEQ ID NO.8)。
结果如图8所示，S3能够显著提高肿瘤细胞内TIMP-2的mRNA水平，S4能够同时增强TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种八肽，其特征在于，该八肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种环八肽，其特征在于，为权利要求1所述的八肽的环状物，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示：Cyclo(Ser-Phe-Gly-Leu-Ser-Trp-Leu-Asp)，结构如下所示：
Figure FDA0003926768520000011
3.权利要求1所述的八肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)溶胀后，在缩合剂作用下使首个氨基酸的1-位羧酸与固相载体偶联，采用的缩合剂为HOBt-DMAP缩合体系，活化剂为DIC，溶剂为DMF；氨基酸、HOBt、DIC、DMAP间的摩尔比为3:3:3:1；
(2)封闭：加入吡啶和乙酸酐混合液，在25℃下振荡后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂多次后，抽真空干燥树脂；
(3)脱Fmoc保护：向步骤(1)中加入Oxyma、哌啶及DMF的混合溶液至树脂完全浸没，振荡后脱去树脂上的Fmoc，然后依次采用DCM、DMF洗涤；
(4)连接第二个氨基酸：根据步骤(1)中的条件，在缩合剂作用下连接下一个氨基酸，根据多肽序列依次将Fmoc氨基酸、Oxyma和DIC混溶于NMP中，加入到树脂中，于60℃下振荡一定时间后，依次用DCM、DMF多次洗涤树脂；
(5)重复进行脱保护-偶联-脱保护操作，直至所有氨基酸连接完成；
(6)八肽粗品制备及纯化：使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得到所述八肽，其中，所述切割剂为TIPS、H2O、苯酚和TFA的混合溶液，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法。
4.根据权利要求3所述的八肽的制备方法，其特征在于：
其中，步骤(1)中，树脂选用Wang树脂，载样量为0.57mmol/g，用DCM进行溶胀；偶联反应的温度为50～60℃，偶联反应的时间为20-30min，
步骤(2)中，吡啶和乙酸酐的体积比为1:1，反应时的振荡时间为20min，而后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂3次后，抽真空干燥树脂，
步骤(3)中，Oxyma与哌啶及DMF溶液的质量体积比为0.71:1:4(mg/ml/ml)，进行脱保护时，在20～30℃连续振荡两次5min后，脱去树脂上的Fmoc基团，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次，
步骤(4)中，进行氨基酸连接时，在60℃下的振荡时间为20min，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次，
步骤(6)中，切割试剂中TIPS、H2O、PhOH和TFA的体积比为2.5:5:5:87.5，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg，切割的温度为20～30℃，切割的时间为4h；
纯化条件如下：色谱柱：CST Daiso C18柱,10μm，30*250mm；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：25％B洗脱0～5min，25％B～45％B、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
5.权利要求2所述的环八肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固相载体树脂溶胀后，在缩合剂作用下使首个氨基酸的1-位羧酸与固相载体偶联，采用的缩合剂为HOBt-DMAP缩合体系，活化剂为DIC，溶剂为DMF；氨基酸、HOBt、DIC、DMAP间的摩尔比为3:3:3:1；
(2)封闭：加入吡啶和乙酸酐混合液，在25℃下振荡后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂多次后，抽真空干燥树脂；
(3)脱Fmoc保护：向步骤(2)中加入Oxyma、哌啶及DMF的混合溶液至树脂完全浸没，两次振荡后脱去树脂上的Fmoc，然后依次采用DCM、DMF洗涤；
(4)连接第二个氨基酸：依次将Fmoc氨基酸、Oxyma和DIC混溶于NMP中，加入到树脂中，于60℃下振荡一定时间后，依次用DCM、DMF多次洗涤树脂；
(5)重复进行脱Fmoc保护-耦合-脱Fmoc保护操作，直至所有氨基酸连接完成；
(6)脱保护及固相环合：采用四三苯基膦钯、苯硅烷及DCM混合溶液作为反应剂，避光反应脱OAllyl保护后，采用哌啶及DMF的混合溶液脱Fmoc保护，而后加入PyAOP、HOAt、NMM及无水DMF混合溶液进行固相环合，该过程重复1次；
(7)八肽粗品制备及纯化：使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得到所述八肽，其中，所述切割剂为TIPS、H2O和TFA的混合溶液，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
其中，步骤(1)中，树脂选用Wang树脂，载样量为0.59mmol/g，采用DCM进行溶胀，；偶联反应的温度为25～28℃，偶联反应的时间为10-15h；
步骤(2)中，吡啶和乙酸酐的体积比为1:1，反应时的振荡时间为20min，而后依次用DCM、DMF、无水乙醚各洗涤树脂3次后，抽真空干燥树脂；
步骤(3)中，Oxyma与哌啶及DMF溶液的质量体积比为0.71:1:4(mg/ml/ml)，进行脱保护时，在20～30℃连续振荡两次5min后，脱去树脂上的Fmoc基团，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次，
步骤(4)和步骤(5)中，氨基酸、Oxyma、DIC、NMP间的摩尔比为1:1:1:10；进行氨基酸连接时，在60℃下的振荡时间为20min，然后依次采用DCM、DMF洗涤树脂各3次，
步骤(6)中，直链肽、四三苯基膦钯与苯硅烷摩尔比为5:1:100；直链肽、PyAOP、HOAt、NMM间的摩尔比例为1:5:5:10，混合溶液浓度为0.02M，
步骤(7)中，切割试剂中TIPS、H2O、PhOH和TFA的体积比为2.5:5:5:87.5，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10mL/mg，切割的温度为20～30℃，切割的时间为4h；
纯化条件如下：色谱柱：CST Daiso C18柱，10μm，30*250mm；流动相：流动相A为0.1％TFA/水，流动相B为0.1％TFA/乙腈；梯度洗脱程序：25％B洗脱0～5min，25％B～65％B、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
7.权利要求1所述的八肽及其衍生物或权利要求2所述的环八肽及其衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤药物为增强肿瘤细胞内TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达或蛋白表达的药物。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，
其中，所述肿瘤为肺癌，
所述的八肽的衍生物为在八肽氨基酸侧链基团上、氨基端、羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为八肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物，
所述的环八肽的衍生物为在环八肽氨基酸侧链基团上进行常规修饰得到的产物，或者为环八肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物，
所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、胆固醇化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇化修饰和固定化修饰中的任意一种。
10.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，所述活性组分以权利要求1所述的八肽或权利要求2所述的环八肽为唯一活性组分，或者包含所述八肽或环八肽。
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