CN116333023A - 寡核苷酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种寡核苷酸的合成方法；所述合成方法包括如下步骤：脱保护步骤、偶联步骤、加帽步骤和氧化步骤；其中，在所述氧化步骤使用氧化剂将亚磷酯键转化为磷酸三酯键，所述氧化剂中包括碘液和氮甲基咪唑。本申请利用含有氮甲基咪唑的碘液作为氧化试剂合成寡核苷酸的方法，解决了寡核苷酸探针合成时间长、效率低、操作繁琐等问题。此外，采用本申请的合成方法，能够减少氧化步骤的反应时间、避免MGB探针在合成过程中出现杂质问题，并且在使用仪器合成普通序列时无需更换氧化剂，使得MGB探针与普通寡核苷酸序列的合成变得更加方便、快速、高效。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种寡核苷酸的合成方法。
背景技术
随着生物科学的发展，尤其是分子生物学研究领域的不断进步，寡核苷酸的应用也越来越广泛。目前存在着多种寡核苷酸的合成方法，其中最常见的方法之一为亚磷酰胺固相合成法，该方法主要包括脱保护步骤、偶联步骤、加帽步骤以及氧化步骤。在氧化步骤中，通常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯，从而得到稳定的寡核苷酸。
已有研究表明，普通碘液在氧化过程可能破坏碱基和修饰物；如在合成CDPI3 MGBCPG时使用0.02M的碘氧化剂，发现CDPI3 MGB CPG的吲哚残基易受碘化影响，可能是因为CDPI3 MGB CPG的5'-CDPI3 MGB磷酸基吲哚环氮上缺乏乙酯基保护基团。此外，普通碘液在氧化过程中容易使得合成的MGB探针质谱图中出现杂峰；虽然在合成后再使用EtOH/NH4OH混合溶液脱保护17小时、并经过GlenPakTM纯化，可以得到较好的产品(The Glen Report,2018,30.2,12)，但是17小时的脱保护时间严重影响了引物合成的效率，且处理步骤繁琐。以CDPI3 MGB CPG为原料，在CSO氧化剂的作用下，采用UltraMild单体和CapA进行合成，虽然合成效果相对较好(The Glen Report,2018,30.2,12)，但是存在以下问题：第一，CSO氧化剂氧化时间较长，需要3min或者以上；第二，在合成其它不易受碘影响的探针的时候还需要在合成仪器上更换氧化剂，使合成过程变得更加繁琐。
为了解决上述问题，迫切需要一种新的寡核苷酸探针的合成方法。
发明内容
基于此，本申请提供了一种快速、高效、并且能够减少成品中杂质的寡核苷酸的合成方法。
根据本申请的一个方面，提供了一种寡核苷酸的合成方法，包括如下步骤：
脱保护步骤、偶联步骤、加帽步骤和氧化步骤；
其中，在所述氧化步骤使用氧化剂将亚磷酯键转化为磷酸三酯键，所述氧化剂中包括碘液和氮甲基咪唑。
在其中一个实施例中，所述碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.1mol/L。
在其中一个实施例中，所述碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.05mol/L。
在其中一个实施例中，所述碘液中氮甲基咪唑的含量为2％(v/v)～20％(v/v)。
在其中一个实施例中，所述碘液中氮甲基咪唑的含量为4％(v/v)。
在其中一个实施例中，所述氧化剂中还包括四氢呋喃、吡啶和水。
在其中一个实施例中，所述碘液中四氢呋喃的含量为60％(v/v)～70％(v/v)。
在其中一个实施例中，所述碘液中四氢呋喃的含量为66％(v/v)。
在其中一个实施例中，所述碘液中吡啶的含量为10％(v/v)～30％(v/v)。
在其中一个实施例中，所述碘液中吡啶的含量为20％(v/v)。
与传统技术相比，本申请的合成方法具有如下有益效果：
本申请中，使用含有氮甲基咪唑的碘液作为氧化试剂合成寡核苷酸的方法，解决了寡核苷酸探针合成时间长、效率低、操作繁琐等问题。此外，本申请的合成方法还能够减少氧化步骤的反应时间、避免MGB探针在合成过程中出现杂质问题，并且在使用仪器合成普通序列和MGB序列时无需更换氧化剂，使寡核苷酸序列的合成更加便捷、快速、高效。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1合成的分子量为4132的寡核苷酸探针的质谱图；
图2为本申请实施例2合成的分子量为4132的寡核苷酸探针的质谱图；
图3为本申请实施例3合成的分子量为3012的寡核苷酸探针的质谱图；
图4为本申请对比例1合成的分子量为4132的寡核苷酸探针的质谱图；
图5为本申请对比例2合成的分子量为4132的寡核苷酸探针的质谱图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的一些实施方式提供了一种寡核苷酸的合成方法，包括如下步骤：
脱保护步骤、偶联步骤、加帽步骤和氧化步骤；
其中，在氧化步骤使用氧化剂将亚磷酯键转化为磷酸三酯键，氧化剂中包括碘液和氮甲基咪唑。
脱保护步骤使用二氯乙酸或者三氯乙酸脱掉连在固相载体上的核苷酸5’羟基上的保护基团DMT；偶联步骤将亚磷酰胺单体用四唑活化，形成高反应性的亚磷酰胺四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡合苷酸5’羟基偶联；加帽步骤是为了防止少量微反应的连在固相载体上的5’羟基进入下一个循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，能够在很大程度上提高最后产品的纯度；氧化步骤在缩合反应时，核苷酸单体通过亚磷酯键与连在CPG上的寡合苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，使用氧化剂将亚磷酯转化为磷酸三酯，得到稳定的寡合苷酸。经过上面四个步骤，寡合苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。最后用浓氨水把寡合苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。
在其中一些实施方式中，上述的寡核苷酸为MGB探针。
在其中一些实施方式中，上述的寡核苷酸还可以为不带MGB标记的寡核苷酸。
小沟结合物(MGB)分子能够选择性地结合到DNA分子的小沟，即DNA螺旋中的浅沟。MGB标记的寡核苷酸能够与互补的DNA和RNA靶序列形成稳定的杂合复合物，这是因为带有偶联MGB基团的DNA探针与单链DNA靶标形成非常稳定的双螺旋结构，使得在反应中使用较短的探针也能获得很高效率。因此，MGB探针比经典的双标记探针更特异、更高效、更敏感。与未经修饰的DNA相比，MGB探针的结合能力更强，能够在DNA杂交分析中使用更严格的杂交条件，同时短链的MGB探针具有更好的错配辨别能力。MGB探针具有更高的熔化温度(Tm)和更高的特异性，特别是当双相MGB区域失配时。因此，MGB探针可以明显比传统探针短，但可以提供更好的序列识别和灵活性，以适应更多的目标。MGB探针长度约为13至23个碱基，在5'端标记一个荧光基团，在3'端标记了MGB淬灭基团。最简单的MGB探针设计方法是使用一个MGB载体，加入一个猝灭分子作为第一个加成，并用一个5'-荧光团完成合成。或者，荧光团载体可以与5'端包含猝灭分子，然后在5'端最后添加MGB一起使用。
CDPI3(二氢吡咯吲哚-羧酸三肽)是天然产物CC-1065衍生的小沟槽结合(MGB)基团，具有很强的DNA结合特性。包含小沟结合物探针CDPI3的寡核苷酸可提高特异性和杂交强度，从而增强DNA双链体的稳定性。与CDPI3共价结合合成的寡核苷酸增强了DNA的亲和力，改善了序列特异性和DNA探针的杂交特性。MGB探针可应用于引物延伸和PCR阻断剂的捕获、短荧光PCR引物、实时PCR探针、miRNA的抑制剂等。
在其中一些实施方式中，碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.1mol/L。
本申请中，碘液中碘的浓度为“0.02mol/L～0.1mol/L”，即可取0.02mol/L～0.1mol/L的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体包括但不限于实施例中的点值及以下点值：0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.08mol/L、0.09mol/L或者0.1mol/L；或者这些数值中任意两个组成的范围，如：0.04mol/L～0.08mol/L。
在其中一些优选的实施方式中，碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.05mol/L。
在其中一些实施方式中，碘液中氮甲基咪唑的含量为2％(v/v)～20％(v/v)。
本申请中，碘液中氮甲基咪唑的含量为“2％(v/v)～20％(v/v)”，即可取2％(v/v)～20％(v/v)的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体包括但不限于实施例中的点值及以下点值2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)、10％(v/v)、11％(v/v)、12％(v/v)、13％(v/v)、14％(v/v)、15％(v/v)、16％(v/v)、17％(v/v)、18％(v/v)、19％(v/v)或者20％(v/v)；或者这些数值中任意两个组成的范围，如：4％(v/v)～10％(v/v)。
在其中一些优选的实施方式中，碘液中氮甲基咪唑的含量为4％(v/v)。
在其中一些实施方式中，上述氧化剂中还包括四氢呋喃、吡啶和水。
在其中一些实施方式中，碘液中四氢呋喃的含量为60％(v/v)～70％(v/v)。
在其中一些优选的实施方式中，碘液中四氢呋喃的含量为66％(v/v)。
在其中一些实施方式中，碘液中吡啶的含量为10％(v/v)～30％(v/v)。
在其中一些优选的实施方式中，碘液中吡啶的含量为20％(v/v)。
在其中一些实施方式中，碘液中水的含量为5％(v/v)～15％(v/v)。
在其中一些优选的实施方式中，碘液中水的含量为10％(v/v)。
上述的寡核苷酸的合成方法，至少具有如下优点：
(1)快速、高效：使用本申请的方法可以减少氧化步骤的反应时间；
(2)合成的寡核苷酸单一、无杂质；
(3)适用性广：可以同时作为合成MGB探针和普通寡核苷酸序列的氧化剂，无需在合成仪上频繁更换氧化试剂。
本申请的另一些实施方式提供了一种采用上述的方法合成的寡核苷酸。
上述的寡核苷酸可以用于引物延伸、PCR阻断剂的捕获、短荧光PCR引物、实时PCR探针、miRNA的抑制剂等。
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。
实施例1：
(1)使用TCA脱掉连接在固相载体上的核苷酸5’羟基上的保护基团DMT，TCA(购买自河北迪纳兴科生物科技有限公司)的组成为：包含3％(v/v)三氯乙酸的二氯甲烷溶液。
(2)将亚磷酰胺单体用活化试剂ACT(购买自河北迪纳兴科生物科技有限公司)活化，形成高反应性的亚磷酰胺四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡合苷酸5’羟基偶联，ACT的组成为：包含0.25M的5-乙硫基四氮唑(ETT)的ACN溶液。
(3)加帽步骤，为了防止少量未反应的连接在固相载体上的5’羟基进入下一个循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，能够在很大程度上提高最后产品的纯度。加帽试剂为CapA和CapB(河北迪纳兴科生物科技有限公司)，CapA为含10％(v/v)醋酐的四氢呋喃溶液，CapB为10％(v/v)吡啶、16％(v/v)氮甲基咪唑、74％(v/v)的四氢呋喃溶液。
(4)氧化步骤，核苷酸单体通过亚磷酯键与连在CPG上的寡合苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，使用氧化剂将亚磷酯氧化为磷酸三酯，得到稳定的寡合苷酸，氧化剂中碘的浓度为0.02mol/L，包括66％(v/v)四氢呋喃，20％(v/v)吡啶，10％(v/v)超纯水，4％(v/v)氮甲基咪唑。
(5)使用洗涤液将步骤(1)～(4)中残留的试剂清除；
(6)重复一次步骤(1)～(5)。
(7)经过上述步骤，寡核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。最后用浓氨水将寡合苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。
采用北京擎科生物科技有限公司研发的24道合成仪进行寡核苷酸合成。
MGB序列的合成柱为applied biosystems 3900HT MGB 0.2uL DNA SynthesisColumn；普通序列的合成柱为河北迪纳兴科1000A200nmol Universial CPG frit。
通过以下循环程序合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、且3’带有MGB修饰的引物(ACGTACGTAC-MGB)。
步骤1设计程序为：Deblock打液量200uL，等待29s，小抽0.09s，大抽10.01s。
步骤2设计程序为：Deblock打液量200uL，等待29s，小抽0.09s，大抽10.01s。
步骤3设计程序为：Wash打液量200uL，等待3.175s，小抽0.25s，大抽11.32s。
步骤4设计程序为：Wash打液量200uL，等待3.175s，小抽0.25s，大抽11.32s。
步骤5设计程序为：Couple等待45.045s，小抽0.03s，大抽10.925s。
步骤6设计程序为：Couple等待45.045s，小抽0.03s，大抽10.925s。
步骤7设计程序为：CAP打液量CapA50uL、CapB 50uL，等待19.77s，小抽0.04s，大抽10.2s。
步骤8设计程序为：CAP打液量CapA 50uL、CapB 50uL，等待19.77s，小抽0.04s，大抽10.2s。
步骤9设计程序为：Oxidize打液量100uL，等待20.12s，小抽0.04s，大抽10.195s。
步骤10设计程序为：Wash打液量200uL，等待3.175s，小抽0.25s，大抽11.32s。
步骤11设计程序为：Wash打液量200uL，等待3.175s，小抽0.25s，大抽11.32s。
重复以上操作进行多个碱基的合成，然后通过以下步骤对合成物进行检测：
1、下机，手动加入600uL TCA脱保护试剂观察是否呈现橘黄色，再依次加入600uLACN Washing，600uL二乙胺，600uL ACN Washing。
2、把合成柱的柱膜捅入氨解管中，加入400uL氨水，密封，60℃氨解1h。
3、氨解结束恢复室温，13000rpm离心3min，转移上清液至新的离心管中，加入40uLNaCl(3mol/L)和1200uL无水乙醇的混合液，放入离心机13000rpm离心3min，转移出上清液，加入1mL 75％乙醇，13000rpm离心3min，转移出上清液。
4、加入400uL无菌水溶解，取10uL溶解后的菌液和190uL水，测值、并进行质谱检测。
图1为本实施例合成的分子量为4132的探针质谱图，序列为ACGTACGTAC-MGB。
实施例2：
与实施例1基本相同，区别仅在于碘的浓度不同：碘的浓度为0.05mol/L。
图2为本实施例氧化剂合成序列为ACGTACGTAC-MGB、分子量为4132的探针的质谱图。
实施例3：
与实施例1基本相同，区别仅在于：合成的序列为未结合MGB的普通序列ACGTACGTAC。
图3为本实施例中利用含有氮甲基咪唑的碘液来合成核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的普通序列(ACGTACGTAC)、分子量为3012的探针的质谱图。
对比例1：
与实施例1基本相同，区别仅在于氧化剂的组分不同：使用普通氧化剂(购买自河北迪纳兴科生物科技有限公司)进行ACGTACGTAC-MGB探针合成，氧化剂的主要成分为0.05mol/L碘，70％(v/v)四氢呋喃，20％(v/v)吡啶，10％(v/v)超纯水。
图4为对比例1中合成的序列为ACGTACGTAC-MGB、分子量为4132的探针的质谱图。
对比例2：
与实施例1基本相同，区别仅在于：加帽阶段使用的CapB中包含10％(v/v)吡啶、20％(v/v)氮甲基咪唑和70％(v/v)四氢呋喃溶液，氧化试剂采用普通碘液，包含0.05mol/L碘、70％(v/v)四氢呋喃、20％(v/v)吡啶和10％(v/v)超纯水。
图5为对比例2中合成的序列为ACGTACGTAC-MGB、分子量为4132的探针的质谱图。
实施例1～3，采用本申请的合成方法，在氧化步骤中采用特定配分的氧化剂，由此合成的寡核苷酸成分单一、无杂质。
与实施例1相比，对比例1的区别仅在于：氧化剂中未添加氮甲基咪唑，由此合成的寡核苷酸中存在多种不同的杂质。与实施例1相比，对比例2的区别仅在于：氧化步骤中未添加氮甲基咪唑，而是在加帽步骤中添加20％(v/v)氮甲基咪唑，由此制备的产物中存在分子量大小为4257.8的杂质。
上述结果表明，含有氮甲基咪唑的氧化试剂在MGB探针合成过程中减少了不必要的杂质，可能是在碘的氧化过程中，氮甲基咪唑提供了一个弱碱性催化环境，加速了碘的氧化过程，同时氮甲基咪唑对MGB的磷酸吲哚残基起到了一定的保护作用，使得MGB探针的合成结果稳定，避免了生成不必要的杂质。同时，在加帽阶段的氮甲基咪唑的增加对氧化过程中的氧化试剂作用没有影响。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种寡核苷酸的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
脱保护步骤、偶联步骤、加帽步骤和氧化步骤；
其中，在所述氧化步骤使用氧化剂将亚磷酯键转化为磷酸三酯键，所述氧化剂中包括碘液和氮甲基咪唑。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.1mol/L。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中碘的浓度为0.02mol/L～0.05mol/L。
4.根据权利要求1至3任一项所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中氮甲基咪唑的含量为2％(v/v)～20％(v/v)。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中氮甲基咪唑的含量为4％(v/v)。
6.根据权利要求1至3任一项所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述氧化剂中还包括四氢呋喃、吡啶和水。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中四氢呋喃的含量为60％(v/v)～70％(v/v)。
8.根据权利要求7所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中四氢呋喃的含量为66％(v/v)。
9.根据权利要求6所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中吡啶的含量为10％(v/v)～30％(v/v)。
10.根据权利要求9所述的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述碘液中吡啶的含量为20％(v/v)。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100176 Floor 6, West Half Unit, Building 3, Yard 105, Jinghai 3rd Road, Daxing District, Beijing Economic-Technological Development Area Applicant after: Beijing Qingke Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 100176 Beijing Daxing District Beijing Economic and Technological Development Zone No. 156 Courtyard Building 401 Jinghai Fourth Road Applicant before: Beijing Qingke Biotechnology Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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