CN116327653A - 一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法 - Google Patents

一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法。本发明的方法以有机牧豆粉、阿拉伯糖为培养基，由布氏乳杆菌、植物乳杆菌两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物。本发明优先利用布氏乳杆菌预发酵处理牧豆粉促进黄酮、蛋白、生物碱、短链脂肪酸类物质从植物纤维结构中释放，利用植物乳杆菌二次发酵进一步表达修饰小分子活性肽。采用同型发酵与异型发酵的两步联合有效提升发酵过程的有氧稳定性与生物利用率，获得的乳酸杆菌发酵产物表现出优异的自由基淬灭能力和抵御过氧化物损伤的生物活性。

Description

一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法
技术领域
本发明涉及一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，属于益生菌发酵制备化妆品原料技术领域。
背景技术
乳酸杆菌(Lactobacillus)是一类可以通过糖酵解途径(EMP)代谢产生乳酸、短链脂肪酸、短肽、氨基酸等活性因子的益生菌，乳酸杆菌发酵产物(LACTOBACILLUS FERMENT)则包含菌体溶胞及在发酵过程中合成的全部活性成分，能为皮肤提供丰富的益生元，具有良好的抗氧化、抗衰老效果，现已被收录于《已使用化妆品原料目录》(2021版)，INCI编号02162。
牧豆树是一种带刺的豆科灌木，因为营养价值突出，被美洲人民称为“生命之树”。牧豆树的豆荚通常被研磨成粉末，因富含氨基酸、黄酮、植物纤维和蛋白质，极有利于机体构建一个活跃的抗氧化免疫系统，然而传统提取工艺对豆科植物的木质素和纤维素结构的降解效果较差，产物中具备益生性的黄酮多肽类物质含量普遍偏低。
研究表明双歧杆菌、乳酸杆菌、植物乳杆菌等乳酸菌发酵豆类可促使异黄酮单体由糖苷型转化为人体更易吸收，更具抗氧化生物活性的苷元型，特别是，其中植物乳杆菌还具有较强的蛋白酶分泌能力，可对发酵过程中直接或间接产生的小肽通过重排、移接等加工方式，修饰不良基团，使小肽具有更高的应用价值，然而植物乳杆菌通常对纤维无降解能力，直接利用植物基质的能力较弱，为解决该问题，现有专利中乳酸杆菌发酵植物纤维基本以酶解法做预处理，但酶解过程条件控制严格、成本高且仍需对发酵底物做疏松或加水均质等前处理。
就现阶段而言，在发酵护肤的细分市场，乳酸杆菌发酵产物、二裂酵母发酵产物、酵母发酵产物等成分位列消费者关注的微生态护肤成分榜前十，发酵产物的使用已成为发酵类护肤品的主流，以现代工业微生物发酵调控技术为依托制备益生菌发酵产物并应用于化妆品中具有长远价值与意义。
发明内容
本发明的目的是：针对现有技术的不足，提供一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，该方法以有机牧豆粉、阿拉伯糖为培养基，由布氏乳杆菌、植物乳杆菌两步联合发酵制备乳酸杆菌发酵产物，采用同型发酵与异型发酵的两步联合有效提升发酵过程的有氧稳定性与生物利用率，获得的乳酸杆菌发酵产物表现出优异的自由基淬灭能力和抵御过氧化物损伤的生物活性。
为了实现上述目的，本发明提供了一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，包括以下步骤：
步骤1.菌种活化：在种子培养基中分别接入布氏乳杆菌和植物乳杆菌进行活化培养分别得到布氏乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；其中，所述种子培养基的组成为：2.00wt％葡萄糖、2.00wt％大豆蛋白胨、0.20wt磷酸二氢钾、0.30wt％氯化钠、0.06wt％硫酸镁以及余量的水；
步骤2.发酵培养基的制备：称取阿拉伯糖和有机牧豆粉加入水中，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，蒸汽灭菌后冷却至室温；
步骤3.两步发酵处理：将步骤2制备得到的发酵培养基接入步骤1所得的布氏乳杆菌种子液，发酵培养，所得发酵液调节pH至6.0-7.0，蒸汽灭菌后冷却至室温，然后接入步骤1所得的植物乳杆菌种子液，继续发酵培养；
步骤4.发酵产物的制备：将步骤4经过两步发酵处理所得的发酵液依次进行离心和微滤，收集上清液，加入己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油，即得乳酸杆菌发酵产物。
优选地，所述步骤1中的布氏乳杆菌为保藏编号为CGMCC No.19125的布氏乳杆菌MF060(即公开号为CN113288847A、发明名称为《一种白附子发酵提取液的制备方法及其应用》专利中所公开的菌株)。
优选地，所述步骤2的发酵培养基中阿拉伯糖的添加量为0.10wt％-2.00wt％，有机牧豆粉的添加量为1.00wt％-3.00wt％。
优选地，所述步骤3中所述布氏乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液在使用前稀释至菌种浓度为0.5～2×109cfu/mL。
优选地，所述步骤3中布氏乳杆菌种子液的接种量为3.00-5.00wt％，接入布氏乳杆菌种子液发酵培养的条件为：于37℃摇床培养48-72h；所述植物乳杆菌种子液的接种量为1.00-2.00wt％，接入植物乳杆菌种子液发酵培养的条件为：于30℃静置培养24-48h。
优选地，所述步骤4中加入的己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油的量分别为1wt％、0.3wt％、0.2wt％。
本发明还提供了上述两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法制备得到的乳酸杆菌发酵产物。所得乳酸杆菌发酵产物中黄酮和多肽含量较高，且获得的乳酸菌发酵产物具有较高的DPPH清除率以及优异的抵御过氧化氢损伤能力，因此，可用于制备功效型化妆品。
本发明还提供了上述乳酸杆菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明优先利用布氏乳杆菌预发酵处理牧豆粉促进黄酮、蛋白、生物碱、短链脂肪酸类物质从植物纤维结构中释放，利用植物乳杆菌二次发酵进一步表达修饰小分子活性肽，对比现有技术，本发明的优点在于：1)通过微生物发酵代谢调控特异性提升乳酸杆菌发酵产物中黄酮类、肽类活性物的含量及其生物活性；2)获得的乳酸杆菌发酵产物富含多种植物源与微生物源益生元、生物碱类组分，表现出优异的淬灭自由基与抵御过氧化物损伤的能力，可广泛应用于具有抗氧化、抗辐射、防晒等特性的保湿水、护肤霜、精华液中；3)采用同型发酵与异型发酵的两步联合极大得提升了发酵过程的有氧稳定性与生物利用率，加速活性因子溶出得同时降低能耗。
附图说明
图1为实施例1-3和对比例1-3不同方法获得的乳酸杆菌发酵产物或牧豆提取物抵御过氧化氢损伤能力的检测结果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
以下实施例中所用的布氏乳杆菌菌株为保藏编号为CGMCC No.19125的布氏乳杆菌MF060(即公开号为CN113288847A、发明名称为《一种白附子发酵提取液的制备方法及其应用》专利中所公开的菌株)；所用的植物乳杆菌为常规市售菌株。
实施例1
一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
准确称取2.00wt％葡萄糖、2.00wt％大豆蛋白胨、0.20wt磷酸二氢钾、0.30wt％氯化钠、0.06wt％硫酸镁和余量的水，充分溶解后调节pH至6.0±0.2，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，分别接入布氏乳杆菌CGMCC No.19125、植物乳杆菌活化培养48h，将所得种子液菌液浓度稀释至1×109cfu/mL。
(2)布氏乳杆菌发酵处理：
准确称取2.00wt％阿拉伯糖、3.00wt％有机牧豆粉，其余用水补足，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，接入布氏乳杆菌种子液5.00wt％，于37℃，200rpm摇床培养72h。
(3)植物乳杆菌发酵处理：
将发酵液pH值调节至6.0-7.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温接入植物乳杆菌种子液2.00wt％，于30℃静置培养48h。
(4)发酵产物制备：
将发酵液在5000rpm离心10min除去发酵残渣，在0.22μm滤膜微滤除去菌体，收集上清加入1wt％己二醇、0.3wt％对羟基苯乙酮、0.2wt％乙基己基甘油，得到乳酸杆菌发酵产物。
实施例2
一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
准确称取2.00wt％葡萄糖、2.00wt％大豆蛋白胨、0.20wt磷酸二氢钾、0.30wt％氯化钠、0.06wt％硫酸镁和余量的水，充分溶解后调节pH至6.0±0.2，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，分别接入布氏乳杆菌CGMCC No.19125、植物乳杆菌活化培养48h，将所得种子液菌液浓度稀释至1×109cfu/mL。
(2)布氏乳杆菌发酵处理：
准确称取1.00wt％阿拉伯糖、2.00wt％有机牧豆粉，其余用水补足，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，接入布氏乳杆菌种子液3.00wt％-5.00wt％，于37℃，200rpm摇床培养36h。
(3)植物乳杆菌发酵处理：
将发酵液pH值调节至6.0-7.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温接入植物乳杆菌种子液1.50wt％，于30℃静置培养36h。
(4)发酵产物制备：
将发酵液在5000rpm离心10min除去发酵残渣，在0.22μm滤膜微滤除去菌体，收集上清加入1wt％己二醇、0.3wt％对羟基苯乙酮、0.2wt％乙基己基甘油，得到乳酸杆菌发酵产物。
实施例3
一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：
准确称取2.00wt％葡萄糖、2.00wt％大豆蛋白胨、0.20wt磷酸二氢钾、0.30wt％氯化钠、0.06wt％硫酸镁和余量的水，充分溶解后调节pH至6.0±0.2，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，分别接入布氏乳杆菌CGMCC No.19125、植物乳杆菌活化培养48h，将所得种子液菌液浓度稀释至1×109cfu/mL。
(2)布氏乳杆菌发酵处理：
准确称取0.10wt％阿拉伯糖、1.00wt％有机牧豆粉，其余用水补足，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，接入布氏乳杆菌种子液3.00wt％，于37℃，200rpm摇床培养48h。
(3)植物乳杆菌发酵处理：
将发酵液pH值调节至6.0-7.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温接入植物乳杆菌种子液1.00wt％，于30℃静置培养24h。
(4)发酵产物制备：
将发酵液在5000rpm离心10min除去发酵残渣，在0.22μm滤膜微滤除去菌体，收集上清加入1wt％己二醇、0.3wt％对羟基苯乙酮、0.2wt％乙基己基甘油，得到乳酸杆菌发酵产物。
对比例1
准确称取2.00wt％阿拉伯糖、3.00wt％有机牧豆粉，其余用水补足，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温，在5000rpm离心10min除去植物残渣，过0.22μm微孔滤膜微滤膜收集上清加入1wt％己二醇、0.3wt％对羟基苯乙酮、0.2wt％乙基己基甘油，得到牧豆提取物。
对比例2
一种发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，具体步骤同实施1，不同之处在于省略步骤2)中布氏乳杆菌发酵处理，即准确称取2.00wt％阿拉伯糖、3.00wt％有机牧豆粉，其余用水补足，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，高压蒸汽灭菌121℃、15min后冷却至室温后，直接接入植物乳杆菌种子液2.00wt％，于30℃静置培养48h。
对比例3
一种发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，具体步骤同实施1，不同之处在于省略步骤3)植物乳杆菌发酵处理。
上述实施例1～3和对比例1～3所得样品进行如下检测：
1、黄酮含量的测定：
用60％甲醇水溶液配制0.6g/L芦丁标准液，取2.5mL不同稀释倍数的标准液，加400μL 5％ NaNO2静置5min，加400μL 10％ Al(NO3)3静置6min，加600μL10％ NaOH静置6min，加30％乙醇定容至10mL静置10min，于510nm处测定吸光值。以标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。将待测液按相同步骤测定吸光值代入标曲即得黄酮含量。
2、DPPH清除率测定：
参考GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性测定》
3、抵御过氧化氢损伤能力测定：
收集对数生长期的HaCat细胞，接种于96孔板，调整HaCaT细胞密度至1×105个/孔，贴壁培养24h后吸弃培养基，加入含有不同浓度乳酸杆菌发酵产物的DMEM培养基100μL，每组6个复孔。药物作用24h后加入0.2mM过氧化氢作人为损伤处理，以不含样品与过氧化氢的DMEM培养基为空白对照组，以不含样品含0.2mM过氧化氢的DMEM培养基为阳性对照组，继续培养24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育2h于450nm处测量各孔吸光度，计算细胞增殖率。
表1为实施例1-3和对比例1-3不同方法获得的样品中黄酮、多肽含量及DPPH自由基清除率检测结果。图1为实施例1-3和对比例1-3不同方法获得的样品抵御过氧化氢损伤能力的检测结果。
表1样品中黄酮、多肽含量检测结果
实验组 黄酮(g/L) 多肽(g/L) DPPH清除率(％)
实施例1 1.24 3.15 92.14％
实施例2 1.03 2.74 85.32％
实施例3 0.98 2.31 73.98％
对比例1 0.06 0.58 12.15％
对比例2 0.14 1.97 32.19％
对比例3 0.46 1.06 45.76％
以上结果表明：本发明的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法制备的乳酸杆菌发酵产物中黄酮和多肽含量均高于传统水提法制备的牧豆提取物或一步发酵制备的乳酸杆菌发酵产物，且DPPH清除率以及抵御过氧化氢损伤能力均为最优。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.菌种活化：在种子培养基中分别接入布氏乳杆菌和植物乳杆菌进行活化培养分别得到布氏乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；其中，所述种子培养基的组成为：2.00wt％葡萄糖、2.00wt％大豆蛋白胨、0.20wt磷酸二氢钾、0.30wt％氯化钠、0.06wt％硫酸镁以及余量的水；
步骤2.发酵培养基的制备：称取阿拉伯糖和有机牧豆粉加入水中，充分混匀后调节pH至4.0-5.0，蒸汽灭菌后冷却至室温；
步骤3.两步发酵处理：将步骤2制备得到的发酵培养基接入步骤1所得的布氏乳杆菌种子液，发酵培养，所得发酵液调节pH至6.0-7.0，蒸汽灭菌后冷却至室温，然后接入步骤1所得的植物乳杆菌种子液，继续发酵培养；
步骤4.发酵产物的制备：将步骤4经过两步发酵处理所得的发酵液依次进行离心和微滤，收集上清液，加入己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油，即得乳酸杆菌发酵产物。
2.如权利要求1所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，所述步骤1中的布氏乳杆菌为保藏编号为：CGMCC No.19125的布氏乳杆菌MF060。
3.如权利要求1所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，所述步骤2的发酵培养基中阿拉伯糖的添加量为0.10wt％-2.00wt％，有机牧豆粉的添加量为1.00wt％-3.00wt％。
4.如权利要求1所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，所述步骤3中所述布氏乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液在使用前稀释至菌种浓度为0.5～2×109cfu/mL。
5.如权利要求1所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，所述步骤3中布氏乳杆菌种子液的接种量为3.00-5.00wt％，接入布氏乳杆菌种子液发酵培养的条件为：于37℃摇床培养48-72h；所述植物乳杆菌种子液的接种量为1.00-2.00wt％，接入植物乳杆菌种子液发酵培养的条件为：于30℃静置培养24-48h。
6.如权利要求1所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法，其特征在于，所述步骤4中加入的己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油的量分别为1wt％、0.3wt％、0.2wt％。
7.权利要求1～6中任意一项所述的两步联合发酵牧豆制备乳酸杆菌发酵产物的方法制备得到的乳酸杆菌发酵产物。
8.权利要求7所述的乳酸杆菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
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