CN116297415A - 一种protac药物的筛选方法及载体 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种PROTAC药物的筛选方法及载体，包括如下步骤：S1.选用包括内参荧光基因及海肾荧光素酶基因的载体，并在所述载体的海肾荧光素酶基因下游克隆入靶蛋白基因，包装形成病毒后感染真核细胞，表达出内参荧光蛋白及海肾荧光素酶‑靶蛋白的融合蛋白；S2.将步骤S1感染后的真核细胞加入PROTAC药物，先后采用荧光检测法及海肾荧光素酶生物发光检测法，获得PROTAC药物降解靶蛋白的数据，完成PROTAC药物的筛选。与现有技术例如western blot相比，本发明所提供的筛选体系，筛选操作简单、快速，降低实验成本；本发明筛选实验通量大，可同时筛选多个PROTAC药物。

Description

一种PROTAC药物的筛选方法及载体
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种PROTAC药物的筛选方法及载体。
背景技术
目前人为干扰细胞功能蛋白的技术方式主要有两个方面: 一种是基于转录水平对核酸的调节，包括siRNA干扰、反义寡核苷酸以及CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术; 另一种是直接对靶蛋白进行抑制和降解，包括小分子抑制药及PROTAC分子（蛋白降解靶向嵌合体）。近年来，PROTAC分子在肿瘤、神经退行疾病等多种疾病中的药物开发中深受欢迎，推动了相关疾病的治疗进展。
PROTAC 分子或药物是一个异质双功能小分子，由一个结合靶蛋白的配体小分子和一个结合 E3 连接酶的配体小分子通过一个小分子链串联构成。PROTAC 分子进入细胞后，同时与靶蛋白和 E3 连接酶结合，利用 E3 连接酶招募 E2 对靶蛋白进行泛素化修饰，泛素化的靶蛋白通过26S 蛋白酶系统降解为氨基酸，释放出来的 PROTAC 分子可以重复使用。
由于PROTAC只需要结合活性，触发靶蛋白与E3 酶结合从而引发降解这一事件，属于“事件驱动”，与传统的小分子抑制剂的“占位驱动”不同，不需要直接抑制靶蛋白的活性，药物不需要与靶蛋白长时间和高强度的结合，因此可以靶向传统难以成药的蛋白，比如表面光滑但缺乏小分子结合区域的蛋白等。
PROTAC药物筛选通常是进行western blot检测（蛋白质印迹法），对于蛋白进行量的比较从而判断蛋白是否降解。此方法虽然被广泛接受，但是其有明显的缺点：1、操作过于复杂，往往经历多个实验步骤，例如细胞裂解、蛋白定量、电泳、转模、一抗孵育、二抗孵育和曝光。2、经历的时间长，往往需要1-2天。3、步骤繁多，人为操作造成的系统误差大，实验结果波动大。4、定量采用灰度比较，需要对每个条带依此分析，工作量大且精准度低。5、每个western blot只能鉴定10个左右的PROTAC药物，通量低。除了western blot尚无其他方法用于PROTAC药物效果的高通量评价。
发明内容
本发明的主要目的在于提供PROTAC药物的筛选方法及载体。即采用荧光蛋白和海肾荧光素酶的双报告基因表达系统筛选PROTAC药物。荧光蛋白中最常见的是增强绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry蛋白，它们分子量小，具有发色团，无需额外的辅助因子、底物或酶活性，经激光照射发光，起到转录报告及细胞内参的作用。
鉴于荧光蛋白及海肾荧光素酶的发光特性，将两者克隆在同一载体上，即可产生双报告的功能。荧光蛋白起到内参的作用，海肾荧光素酶和靶蛋白融合表达，在PROTAC药物作用下降解，海肾荧光素酶会与靶蛋白一起被降解，从而起到PROTAC药物药效指示的作用。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，一种PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.选用包括内参荧光基因及海肾荧光素酶基因的载体，并在所述载体的海肾荧光素酶基因下游克隆入靶蛋白基因，包装形成病毒后感染真核细胞，表达出内参荧光蛋白及及海肾荧光素酶基因靶蛋白融合蛋白；
S2. 将步骤S1感染后的真核细胞加入PROTAC药物，先后采用荧光检测法及海肾荧光素酶生物发光检测法，获得PROTAC药物降解靶蛋白的数据，完成PROTAC药物的筛选。
根据本发明提供的步骤S2中获得PROTAC药物降解靶蛋白的数据，完成PROTAC药物的筛选方法为：
S3.通过检测荧光检测法得到荧光值RFU，通过海肾荧光素酶生物发光检测法得到生物发光值RLU，根据RLU/RFU比值经过计算，判断药物降解靶蛋白的效果，从而完成PROTAC药物的筛选。
根据本发明提供的步骤S3包括如下步骤：
S31.培养细胞：培养步骤S1感染后的真核细胞，消化计数，在96孔黑壁板中每孔接种20k细胞，并预留无细胞孔；
S32.加入药物：稀释N种针对特定靶点的PROTAC药物及DMSO，分别加入有细胞孔及无细胞孔中，终浓度为100nM；
S33.建立培养试验环境：在37°C，5 % CO2 的恒温培养箱中继续培养8h；
S34.步骤S33结束后，先在多功能酶标仪上检测荧光，有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU实验组， DMSO的孔测得RFUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景；
S35.步骤S34结束后，每孔添加50ul腔肠素，继续在多功能酶标仪上检测生物发光，有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU实验组， DMSO的孔测得RLUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景；
S36.通过公式计算与统计如下：
RLU比率=［（RLU实验组-RLU药物背景）/（RFU实验组-RFU药物背景）］/ ［（RLUDMSO组-RLUDMSO背景）/（RFUDMSO组-RFUDMSO背景）］*100%
S37.计算降解率：
降解率=100%-RLU比率，当降解率大于50%的药物为高活性候选药物，当降解率为40-50%的药物为中等活性候选药物。
根据本发明提供的所述内参荧光基因为增强绿色荧光蛋白基因，其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选;绿色荧光蛋白基因表达增强绿色荧光蛋白，在激光激发下产生绿色荧光。
根据本发明提供的所述内参荧光基因为红色荧光蛋白基因,其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 红色荧光蛋白基因表达红色荧光蛋白荧光蛋白，在激光激发下产生红色荧光。
根据本发明提供的所述海肾荧光素酶基因，其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光。
根据本发明提供的所述克隆位点由多个酶切位点组成，连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
本发明还提供了一种用于PROTAC药物筛选的载体，包括:
内参荧光基因：为增强绿色荧光蛋白基因，其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 绿色荧光蛋白基因表达增强绿色荧光蛋白，在激光激发下产生绿色荧光；
海肾荧光素酶基因：其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光；
所述克隆位点：位于海肾荧光素酶基因下游，由多个酶切位点组成，可以连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
本发明还提供了一种用于PROTAC药物筛选的载体，包括:
内参荧光基因：为红色荧光蛋白基因,其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 红色荧光蛋白基因表达红色荧光蛋白，在激光激发下产生红色荧光；
海肾荧光素酶基因：其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光；
所述克隆位点：位于海肾荧光素酶基因下游，由多个酶切位点组成，可以连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
根据本发明提供的所述载体与psPAX2载体和pMD2G载体共转染到包装细胞293T中，在psPAX2载体和pMD2G载体辅助下，翻译出的蛋白组装成为慢病毒。
本发明的有益效果是：
与现有技术例如western blot相比，
1、本发明所提供的筛选体系，仅仅在孔板中进行光学检测，不涉及提取蛋白、电泳、转膜、抗体杂交、曝光等复杂的物理化学过程，因此筛选操作简单、快速，降低实验成本。
2、本发明筛选实验通量大，可同时筛选多个PROTAC药物。
3、本发明筛选实验可同时作多个重复孔，提高实验结果的重复性和可靠性。
4、内参荧光基因和海肾荧光素酶基因（报告基因）被置于同一个载体上，各自含有独立的启动子和终止子，活性稳定，线性范围宽广，满足PROTAC药物的筛选的需要。
5、预留多克隆酶切位点，满足多种限制性内切酶的酶切，方便将靶蛋白基因克隆到海肾荧光素酶基因的 3’UTR 。
6、制备的慢病毒颗粒可以感染多种真核细胞，适用的细胞范围广，满足不同的筛选需求。
7、本发明的筛选定量简单、准确。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
对于本领域专业科技人员来说是易于理解的、可以重复验证的。
图1.“EGFP/Rluc-tAR”的双报告基因在293T细胞中的表达。
图2.“EGFP/Rluc-tAR”的双报告基因在293T细胞中的活性。
图3.“mCherry/Rluc-tAR”的双报告基因在293T细胞中的表达。
图4.“mCherry/Rluc-tAR”的双报告基因在293T细胞中的活性。
图5.“EGFP/Rluc-tAR”的双报告系统对于AR PROTAC药物的筛选。
图6.“mCherry/Rluc-tAR”的双报告系统对于AR PROTAC药物的筛选。
图7. Western blot验证双报告系统对ARPROTAC药物的筛选效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部试验结果。
实施例1 构建一种基于内参荧光基因的荧光蛋白（EGFP或mCherry）和海肾荧光素酶（Rluc）的双报告基因的表达载体
以下实施例使用的pCDH-EGFP质粒、pCDH-mCherry质粒、pEASY载体、psPAX2载体、pMD2G载体及TOP10感受态细胞均可商业获得；所述T4 DNA连接酶及限制性内切酶均可商业获得。
通过全基因合成法，以5’→3’方向合成海肾荧光素酶（Rluc）报告基因的插入片段，并在上游引入Bmt I、下游引入 EcoR I的酶切位点，进而连接在pEASY载体上，得到pEASY-Rluc中间载体。
采用BmtI及EcoR I限制性内切酶，在Buffer O缓冲溶液的条件下对pCDH-EGFP或pCDH-mCherry质粒载体上进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到质粒片段；同样的条件，双酶切pEASY-Rluc中间载体，琼脂糖凝胶电泳切胶回收得到Rluc片段。
取1μL的T4 Buffer、0.5μl T4连接酶溶液加入5.5μL的ddH2O中，并加入上述获得的酶切后的Rluc片段、pCDH-EGFP或pCDH-mCherry质粒载体，在16℃条件下连接12～16h，得到pCDH-EGFP-Rluc或pCDH-mCherry-Rluc双报告基因载体，转染TOP10感受态细胞，挑取克隆测序，并保存。
实施例2 在双报告基因的表达载体中接入靶蛋白基因
本发明以雄激素受体尾部片段tAR（624-920aa）为例，阐述双报告基因的表达载体中接入靶蛋白基因的过程。
通过全基因合成法，以5’→3’方向合成linker及雄激素受体尾部片段tAR（624-920aa），并在上游引入 EcoR I、下游引入Not I的酶切位点，进而连接在pEASY载体上，得到pEASY-linker-tAR中间载体。
采用EcoRI及Not I限制性内切酶，在Buffer 0缓冲溶液的条件下对pCDH-EGFP-Rluc或pCDH-mCherry-Rluc质粒载体上的多克隆位点进行双酶切3h，并用琼脂糖凝胶电泳得到胶条，切胶回收得到质粒片段；同样的条件，双酶切pEASY-linker-tAR中间载体，琼脂糖凝胶电泳切胶回收得到linker-tAR片段。
取1μl的T4 Buffer、0.5μl T4连接酶溶液加入5.5μl的ddH2O中，并加入上述获得的酶切后的linker-tAR片段、pCDH-EGFP-Rluc或pCDH-mCherry-Rluc质粒载体，在16℃条件下连接12～16h，得到pCDH-EGFP-Rluc-linker-tAR（简称pCDH-EGFP-Rluc-tAR）或pCDH-mCherry-Rluc-linker-tAR（简称pCDH-mCherry-Rluc-tAR）双报告基因载体，进而转化TOP10感受态细胞，挑取克隆测序，并保存。
实施例3带有靶基因（tAR）的双报告基因的慢病毒颗粒的形成
本发明采用三质粒慢病毒系统进行病毒包装过程。三质粒慢病毒系统包括以下质粒：带有tAR基因的双报告基因质粒（pCDH-EGFP-Rluc-tAR或pCDH-mCherry-Rluc-tAR）、病毒包装辅助质粒pSPAX2载体及pMD2G载体。
提前传代293T细胞用于包装病毒。操作完毕后置于37°C，5% CO2 的培养箱中；转染前观察细胞密度，达到70～80% 的汇合率即可进行转染；做脂质体转染complex，转染100mm皿的complex成分如下：pSPAX210μg、pMD2G5μg、双报告基因质粒（即穿梭质粒）10μg及LipofiterTM75μL。脂转complex混匀后在室温下温育15 min后缓慢滴加至293T细胞中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。转染后16h更换含10%胎牛血清的新鲜完全培养基。转染后48 h和72 h分别收集两次病毒上清（48 h收集后置换新鲜完全培养基）。在48 h收毒时，将100 mm dish中的培养基倒入50 mL离心管中，随后补入10 mL含10%胎牛血清 FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37°C，5 % CO2的恒温培养箱中继续培养。在72 h收毒时，直接将100 mmdish中的培养基倒入50 mL离心管中。
超速离心浓缩：将50 mL离心管中的病毒上清，4°C ，2000 × g ，离心10 min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4°C ，82700 × g ，离心120 min，完全培养基重悬病毒沉淀，最后将超离重悬液分装到灭菌处理的病毒管中，-80°C冰箱保存。
实施例4融合靶基因的双报告基因慢病毒颗粒感染真核细胞
本发明以293T细胞为例阐述融合了靶基因的双报告基因慢病毒颗粒感染真核细胞的过程。将对数生长期的293T细胞消化重悬后，按 1x105/ml 密度接种于 12 孔板，生长过夜。将70-80%铺满细胞的12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入 PBS 浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。24小时后添加puromycin筛选，先吸去含病毒培养基，加入含1.5 μg/mL puromycin10 % FBS完全培养基,继续培养48-72h。然后换成正常培养基，继续培养。一周后，对感染的细胞的Rluc、AR、EGFP或mCherry表达进行鉴定。
外源蛋白表达的鉴定：取1x105感染与未感染的细胞，在蛋白裂解缓冲液（1%TritonX-100,0.1%SDS和0.1M Tris-HCl（pH=7.0））中提取全细胞蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。随后，将蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上分离，转移到NC膜（Millipore）上，并在室温下用10%脱脂干牛奶封闭1小时。将膜在4°C下与供应商推荐的稀释度的相应一级抗体在室温下孵育。洗涤后，将膜与二级抗体孵育1小时。使用ECL检测试剂（Pierce）显示信号，并使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD，USA）分析印迹图像。从而判定感染的细胞的Rluc、tAR、EGFP或mCherry表达情况。
从附图1可以看出：293T细胞没有Rluc-tAR及EGFP的表达，而转染双报告基因表达系统的293T细胞则表达Rluc-tAR及EGFP，β-actin作为内参。
从附图2可以看出：293T细胞没有Rluc-tAR及mCherry的表达，而转染此表达系统的293T细胞则表达Rluc-tAR及mCherry，β-actin作为内参。
感染双报告基因表达系统细胞的荧光及生物发光检测:取100ul不同数量具有双报告基因系统细胞（20k/40k/60k/80k/100k），将细胞接种到96孔黑壁板中。先在多功能酶标仪上检测绿色荧光（激发波长488nm，发射波长510nm）或红色荧光（激发波长580nm，发射波长610nm），测得RFU实验组值。检测结束后，每孔添加50ul腔肠素（7.2uM），继续在多功能酶标仪上检测生物发光，测得RLU实验组值。多功能酶标仪可以是任意公司产品，只要具备检测荧光和生物发光的功能即可。
从附图3可以看出：具EGFP/Rluc-tAR双报告基因表达系统的293T细胞随着细胞数量的增加，其生物发光值（RLU）也增加，绿色荧光值（RFU）也增加，表明两种报告方式均能被检测，说明两种报告方式均在细胞中表现出活性。
从附图4可以看出：具mCherry/Rluc-tAR双报告基因表达系统的293T细胞随着细胞数量的增加，其生物发光值（RLU）也增加，红色荧光值（RFU）也增加，表明两种报告方式均能被检测，两种报告方式均在细胞中表现出活性。
实施例5转入双报告基因的真核细胞对AR PROTAC药物的筛选
本发明以雄激素受体（AR）的PROTAC 药物为例，阐述双报告基因表达系统的筛选功能。AR-PROTAC药物（100-107）、ARV110及恩杂鲁胺（ENZA,enzalutamide）均可商业获得。
ARV110是目前已经成熟的AR的PROTAC药物,在此作为阳性药物进行对照,证明双报告基因筛选系统的性能。恩杂鲁胺（ENZA）为AR特异性的抑制剂，只具有结合功能，没有降解功能，作为阴性对照。
本发明利用前述已表达双报告基因系统的真核细胞（293T细胞），添加AR PROTAC药物，然后分别检测荧光值（RFU）和生物发光值（RLU），根据RLU/RFU比值经过计算，即可进行判断药物降解靶蛋白（tAR）的效果。具体步骤如下：
正常培养表达EGFP/Rluc-tAR细胞或表达mCherry/Rluc-tAR细胞，消化计数，在96孔黑壁板中每孔接种20k细胞，并预留无细胞孔。稀释8种AR-PROTAC药物（100-107）、相应浓度DMSO及对比试验ARV110、恩杂鲁胺（ENZA），分别加入各自孔中，至终浓度为100nM,37°C，5% CO2 的恒温培养箱中继续培养8 h。
孵育结束后，先在多功能酶标仪上检测绿色荧光（激发波长488，发射波长510）或红色荧光（激发波长580，发射波长610），有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU实验组， DMSO的孔测得RFUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景。
检测结束后，每孔添加50ul腔肠素（7.2uM），继续在多功能酶标仪上检测生物发光，有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU实验组， DMSO的孔测得RLUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景。计算与统计如下：
RLU比率=［（RLU实验组-RLU药物背景）/（RFU实验组-RFU药物背景）］/ ［（RLUDMSO组-RLUDMSO背景）/（RFUDMSO组-RFUDMSO背景）］×100%
降解率=100%-RLU比率
附图5及附图6所示，以RFU值（红色或绿色）为内参，进行归一化，然后统一与DMSO对照组进行比较，即可得出不同给药组的RLU比率值，RLU比率值越低说明药物引起蛋白降解程度越高，从而筛选出具有高活性的PROTAC药物，我们定义降解效率>50%的药物高活性候选药物，40-50%为中等活性候选药物,。从图可见ARV110的降解效果最好，残留的Rluc-tAR仅有35%左右。ARV110是目前已经成熟的AR的PROTAC药物,在此作为阳性药物进行对照,证明双报告基因筛选系统的性能。恩杂鲁胺（ENZA）为AR特异性的抑制剂，只具有结合功能，没有降解功能，作为阴性对照。其他的AR的PROTAC药物（100-107）产生的Rluc-tAR降解程度各不相同，化合物102和104作用较强，为中等活性候选药物。
实施例6 Western blot验证双报告基因系统对AR PROTAC药物的筛选结果
正常培养表达EGFP/Rluc-tAR细胞或表达mCherry/Rluc-tAR细胞，消化计数，在6孔板中每孔接种100k细胞。稀释8种AR-PROTAC药物（100-107）、ARV110、恩杂鲁胺及相应浓度DMSO，加入每孔中，至终浓度为100nM, 37°C，5 % CO2 的恒温培养箱中继续培养8 h。
孵育后，去上清。上述细胞在蛋白裂解缓冲液（1%Triton X-100,0.1%SDS和0.1MTris-HCl（pH 7.0））中提取全细胞蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。随后，将蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上分离，转移到NC膜（Millipore）上，并在室温下用10%脱脂干牛奶封闭1小时。将膜在4°C下与供应商推荐的稀释度的相应一级抗体在室温下孵育。此后，将膜与二级抗体孵育1小时。使用ECL检测试剂（Pierce）显示信号。曝光的条带使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD，USA）进行分析,计算Rluc-tAR 残留率。计算公式如下：
Rluc-tAR残留率=（tAR实验组/β-actin实验组）/ （tARDMSO组/β-actinDMSO组）×100%，
tAR实验组:各加药组Rluc-tAR表达的灰度值；
β-actin实验组：各加药组β-actin表达的灰度值；
tARDMSO组：DMSO组Rluc-tAR表达的灰度值；
β-actinDMSO组：DMSO组β-actin表达的灰度值；
降解率=100%-（Rluc-tAR残留率）。
附图7为western blot实验代表图，以EGFP/Rluc-tAR细胞为例展示，mCherry/Rluc-tAR细胞的实验结果相似。实验组以β-actin的曝光条带灰度进行归一化，然后统一与DMSO对照组进行比较，即可得出不同给药组的Rluc-tAR 表达率。Rluc-tAR 残留率越低说明药物引起蛋白降解程度越高。结果显示：western blot结果与双报告基因系统筛选结果吻合，进一步表明双报告基因系统筛选PROTAC药物的可靠性。
本领域技术人员会理解，本发明不限于这里的实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (10)

1.一种PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.选用包括内参荧光基因及海肾荧光素酶基因的载体，并在所述载体的海肾荧光素酶基因下游克隆入靶蛋白基因，包装形成病毒后感染真核细胞，表达出内参荧光蛋白及及海肾荧光素酶基因靶蛋白融合蛋白；
S2. 将步骤S1感染后的真核细胞加入PROTAC药物，先后采用荧光检测法及海肾荧光素酶生物发光检测法，获得PROTAC药物降解靶蛋白的数据，完成PROTAC药物的筛选。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：
步骤S2中获得PROTAC药物降解靶蛋白的数据，完成PROTAC药物的筛选方法为：
S3.通过检测荧光检测法得到荧光值RFU，通过海肾荧光素酶生物发光检测法得到生物发光值RLU，根据RLU/RFU比值经过计算，判断药物降解靶蛋白的效果，从而完成PROTAC药物的筛选。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤S3包括如下步骤：
S31.培养细胞：培养步骤S1感染后的真核细胞，消化计数，在96孔黑壁板中每孔接种20k细胞，并预留无细胞孔；
S32.加入药物：稀释N种针对特定靶点的PROTAC药物及DMSO，分别加入有细胞孔及无细胞孔中，终浓度为100nM；
S33.建立培养试验环境：在37°C，5 % CO2 的恒温培养箱中继续培养8h；
S34.步骤S33结束后，先在多功能酶标仪上检测荧光，有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU实验组， DMSO的孔测得RFUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RFU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景；
S35.步骤S34结束后，每孔添加50ul腔肠素，继续在多功能酶标仪上检测生物发光，有细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU实验组， DMSO的孔测得RLUDMSO组，无细胞孔的PROTAC药物的孔测得RLU药物背景， DMSO的孔测得RFUDMSO背景；
S36.通过公式计算与统计如下：
RLU比率=［（RLU实验组-RLU药物背景）/（RFU实验组-RFU药物背景）］/ ［（RLUDMSO组-RLUDMSO背景）/（RFUDMSO组-RFUDMSO背景）］×100%
S37.计算降解率：
降解率=100%-RLU比率，当降解率大于50%的药物为高活性候选药物，当降解率为40-50%的药物为中等活性候选药物。
4.根据权利要求1所述的PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，所述内参荧光基因为增强绿色荧光蛋白基因，其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 绿色荧光蛋白基因表达增强绿色荧光蛋白，在激光激发下产生绿色荧光。
5.根据权利要求1所述的PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，所述内参荧光基因为红色荧光蛋白基因,其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 红色荧光蛋白基因表达红色荧光蛋白荧光蛋白，在激光激发下产生红色荧光。
6.根据权利要求1所述的PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，所述海肾荧光素酶基因，其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光。
7.根据权利要求6所述的PROTAC药物的筛选方法，其特征在于，所述克隆位点由多个酶切位点组成，连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
8.一种用于PROTAC药物筛选的载体，其特征在于，包括:
内参荧光基因：为增强绿色荧光蛋白基因，其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 绿色荧光蛋白基因表达增强绿色荧光蛋白，在激光激发下产生绿色荧光；
海肾荧光素酶基因：其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光；
所述克隆位点：位于海肾荧光素酶基因下游，由多个酶切位点组成，可以连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
9.一种用于PROTAC药物筛选的载体，其特征在于，包括:
内参荧光基因：为红色荧光蛋白基因,其上游启动子为EF1，下游含有独立表达的嘌呤霉素puro基因，嘌呤霉素基因用于转染真核细胞后的筛选; 红色荧光蛋白基因表达红色荧光蛋白，在激光激发下产生红色荧光；
海肾荧光素酶基因：其上游启动子为CMV，下游含有外源基因的克隆位点；该基因表达海肾荧光素酶，催化腔肠素发出蓝光；
所述克隆位点：位于海肾荧光素酶基因下游，由多个酶切位点组成，可以连接入带有linker的外源基因，转染真核细胞后，外源基因通过linker与海肾荧光素酶基因进行融合表达。
10.根据权利要求8或9所述的用于PROTAC药物筛选的载体，其特征在于，所述载体与psPAX2载体和pMD2G载体共转染到包装细胞293T中，在psPAX2载体和pMD2G载体辅助下，翻译出的蛋白组装成为慢病毒。
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