CN116287446A - 基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS‑CoV‑2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用，属于病原分子生物学检测技术领域。其中，所述引物探针组合包括分别用于检测S基因的突变位点的引物和探针，所述突变位点包括△69‑70 aa、V126A、△242‑244 aa、K417N、K417T、L452R、E484K、E484Q、E484A、N501Y、P681R、P681H和F888L，所述试剂盒包括所述引物探针组合及阴性质控品和阳性质控品。利用本发明的试剂组合和试剂盒进行SARS‑CoV‑2突变株检测，具有成本低、高效和易推广的特点，具有十分重要的临床应用价值。

Description

基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂 盒及应用
技术领域
本发明属于病原分子生物学检测技术领域，具体地，涉及基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
突变扩增阻滞系统（Amplification-refractory Mutation System，ARMS），又称等位基因特异性聚合酶链反应（Allele-specific Polymerase Chain Reaction，ASPCR），是基于PCR技术建立的分析方法。该方法一建立就受到人们广泛关注，并迅速得到应用，包括肺癌组织EGFR突变、镰刀状细胞贫血症、苯丙酮尿症、β地中海贫血症等癌症和遗传病疾病检测。并且，ARMS法在基因分型方面也已经展现其独特优势，比如人类白细胞抗原（HLA）分型、ABO血型基因分型等。
ARMS法是利用DNA聚合酶缺乏3'-5'端外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能实现扩增的原理。ARMS扩增条件与PCR所需条件基本一致，但其引物的3'端不配对的核苷阻滞影响了DNA聚合酶的延伸效率，使与ARMS引物存在一个碱基差异的等位基因也不能被扩增，因此ARMS可以区分模板中单个核苷酸差异。但这种阻滞程度依赖于错配碱基的类型。研究发现，C/T、A/A、T/T（嘌呤/嘌呤、嘧啶/嘧啶）错配比G/T、T/G、A/C、C/A（嘌呤/嘧啶）错配对聚合酶催化效率的影响更大。当一对3'末端错配碱基不足以阻滞扩增反应时，近末端必须增添其它错配碱基加强阻滞作用。有时为了能最大限度地提高引物与靶DNA结合的特异性，常常将引物的3'端倒数第二个核苷也设计为错配碱基。但由于ARMS扩增反应条件复杂，改变一些因素就会影响扩增结果，加之PCR扩增条件不尽相同。因此，对于不同反应体系的最佳错位位点、引物类型、反应的温度、时间等条件都需要验证确认以获得最优的PCR反应体系统。
国际世卫组织（WHO）将值得注意的新型冠状病毒（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的变异株分为“监测中的变异株”（VUM，VariantsUnder Monitoring）、“需留意的变异株”（VOI，Variants of Interest）以及“需关注的变异株”（VOC，Variants of Concern），截至2022年11月，出现过的VOC包括B.1.1.7（α）、B.1.351（β）、P.1（γ）、B.1.617.2（δ）和B.1.1.529（Omicron），VUM和VOI包括B.1.617.1（κ）、B.1.525（η）和B.1.620等。
SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，是一种单链正链RNA病毒，其基因组编码四种结构蛋白：核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）。其中，刺突蛋白是I型融合蛋白，在病毒粒子表面形成三聚体，由两个亚基组成，S1负责受体结合，S2负责膜融合。刺突蛋白决定了病毒的传染性及其在宿主中的传播能力，但突变是病毒复制过程中的自然现象，而RNA病毒的突变率高于DNA病毒。刺突蛋白的氨基酸变化可以显著影响病毒功能，比如ΔHV69-70、L452、E484、N501分别与病毒的免疫逃逸和/或血管紧张素转换酶（ACE，病毒进入靶细胞的受体）亲和力相关，而P681则与Furin蛋白酶切位点有关等。不同的突变位点出现在SARS-CoV-2不同变异株中，从而使不同变异株具有其相应的特点。
目前快速对SARS-CoV-2变异株进行检测的手段仍然十分有限。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在基于ARMS的原理，即利用ARMS法可以特异性识别不同突变株中相应的突变位点，从而判定具体突变株型别。具体地，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合，包括分别用于检测S基因的突变位点的引物和探针，所述突变位点包括△69-70 aa、V126A、△242-244aa、K417N、K417T、L452R、E484K、E484Q、E484A、N501Y、P681R、P681H和F888L，其中，
用于检测△69-70 aa的引物序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示，探针序列如SEQ ID No. 2所示，△69-70aa是指导致S蛋白上第69-70位氨基酸发生突变的突变位点；用于检测V126A的引物序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示，探针序列如SEQ ID No. 11所示；用于检测△242-244aa的引物序列分别如SEQ ID No. 19和SEQ IDNo. 21所示，探针序列如SEQ ID No. 20所示，△242-244 aa是指导致S蛋白上第242-244位氨基酸发生突变的突变位点；用于检测K417N的引物序列分别如SEQ ID No. 28和SEQIDNo. 30所示，探针序列如SEQ ID No. 29所示；用于检测K417T的引物序列分别如SEQ IDNo. 37和SEQ ID No. 39所示，探针序列如SEQ ID No. 38所示；用于检测L452R的引物序列分别如SEQID No. 46和SEQ ID No. 48所示，探针序列如SEQ ID No. 47所示；用于检测E484K的引物序列分别如SEQ ID No. 55和SEQ ID No. 57所示，探针序列如SEQ ID No. 56所示；用于检测E484Q的引物序列分别如SEQ ID No. 64和SEQ ID No. 66所示，探针序列如SEQID No. 65所示；用于检测E484A的引物序列分别如SEQ ID No. 73和SEQ ID No. 75所示，探针序列如SEQ ID No. 74所示；用于检测N501Y的引物序列分别如SEQ ID No. 82和SEQID No. 84所示，探针序列如SEQ ID No. 83所示；用于检测P681R的引物序列分别如SEQID No. 91和SEQ ID No. 93所示，探针序列如SEQ ID No. 92所示；用于检测P681H的引物序列分别如SEQID No. 100和SEQ ID No. 102所示，探针序列如SEQ ID No. 101所示；用于检测F888L的引物序列分别如SEQ ID No. 109和SEQ ID No. 111所示，探针序列如SEQ IDNo. 110所示，各探针的5'端利用第一荧光基团标记，3'端利用第一淬灭基团标记。
本发明针对不同SARS-CoV-2突变株的关键突变位点，设计了基于ARMS的引物和探针，并且在探针上利用荧光基团标记，可以进一步通过荧光定量PCR扩增检测突变位点，能够准确检测不同的突变株。
进一步地，所述引物探针组合还包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针，从而能够确保突变株判定是在SARS-CoV-2的基础上进行的。用于检测ORF1ab基因的引物序列分别如SEQ ID No. 118和SEQ ID No. 120所示，探针序列如SEQ ID No. 119所示，5'端利用第一荧光基团标记，3'端利用第一淬灭基团标记。
更进一步地，所述引物探针组合还包括用于检测人GAPDH基因的引物和探针，从而确保检测全过程的准确性。当然，本领域技术人员也可以采用其他基因作为内标基因，如Actin基因。优选地，用于检测人GAPDH基因的引物序列分别如SEQ ID No. 121和SEQ IDNo. 123所示，探针序列如SEQ ID No. 122所示，5'端利用第二荧光基团标记，3'端利用第二淬灭基团标记，其中，所述第二荧光基团与所述第一荧光基团不同，相应地，所述第二淬灭基团与所述第一淬灭基团不同。
优选地，所述第一荧光基团和所述第二荧光基团分别选自FAM、Cy5、ROX和HEX中。例如分别为FAM和Cy5，或分别为ROX和HEX。
在本发明中，将各个用于检测SARS-CoV-2 S基因的突变位点的引物和探针，以及用于检测ORF1ab基因的引物和探针，分别与用于检测人GAPDH基因的引物和探针混合在一起，形成14个混合体系。
优选地，各个混合体系中，引物量是相应探针量的2倍。即对于基于检测靶标，其引物量均是相应探针量的2倍。在本发明的一些实施方案中，各个混合体系中，用于检测ORF1ab基因或S基因各突变位点的引物量与用于检测人GAPDH基因的引物量之比为5：3。
本发明第二方面提供一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS-CoV-2突变株的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物探针组合，具体地，包括上述14个混合体系。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、阴性质控品和/或阳性质控品，其中阳性质控品为包括所述用于检测SARS-CoV-2 S基因的突变位点的引物的所有扩增子序列的假病毒颗粒。
优选地，所述阳性质控品包括分别具有SEQ ID No. 124~126所示序列的假病毒颗粒的混合物。更优选地，将3种假病毒颗粒序列1、序列2和序列3分别进行梯度稀释，稀释7个梯度（D1~D7），前两个高浓度（D1和D2）采取100倍稀释，从D3开始采取10倍梯度稀释，分别检测3种序列的D2-D7的Ct值，并分别选取Ct值范围20.00~26.00的稀释梯度，将选取相应稀释梯度的3种假病毒颗粒序列产物等体积混合为阳性质控品。
在本发明中，本领域技术人员可以根据需要选取任意PCR扩增试剂，包括但不限于TaKaRa公司生产的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Life公司生产的TaqPath™ 1‐Step RT‐qPCR Master Mix，南京诺唯赞公司生产的HiScript®II OneStep qRT-PCR SYBR Green Kit。
本发明第三方面提供本发明第一方面所述的引物探针组合在制备适用于以下方法检测不同SARS-CoV-2突变株的试剂盒中的应用：
S1，获得SARS-CoV-2阳性样本的核酸样本；
S2，利用所述14个混合体系分别对步骤S1获得的核酸样本进行荧光定量PCR扩增检测；
S3，根据荧光检测信号，判断是否存在相应的突变位点：
针对13个包括用于检测S基因突变位点的引物和探针的混合体系中的一个，若第二荧光基团Ct值≤35.00，第一荧光基团Ct值≤38.00，且有典型S型扩增曲线，同时与包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针混合体系得到的第一荧光基团Ct值之间的差值的绝对值|△Ct|≤5.00，则判定样本存在相应的突变位点。
在本发明的一些实施方案中，阴性质控品的第一荧光基团和第二荧光基团Ct值应为阴性；阳性质控品的第一荧光基团和第二荧光基团Ct值应≤31.00。
进一步地，针对同一个样本，包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针混合体系得到的第二荧光基团Ct值应≤35.00；当包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针混合体系得到的第一荧光基团＞38.00或无典型S型扩增曲线时，则是SARS-CoV-2阴性样本，不再进行具体突变位点的判读。
进一步地，突变位点与突变型的关系如下：
Figure SMS_1
其中，“+”表示存在相应的突变位点，“-”表示不存在相应的突变位点。
即：
若存在△69-70 aa、E484K、N501Y和P681H突变位点，不存在V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484Q、P681R、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.1.7；
若存在△242-244 aa、K417N、E484K和N501Y突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、K417T、L452R、E484Q、P681R、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.351；
若存在K417T、E484K和N501Y突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、L452R、E484Q、P681R、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：P.1；
若存在L452R和P681R突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、E484K、E484Q、N501Y、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.617.2；
若存在L452R、E484Q和P681R突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、E484K、N501Y、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.617.1；
若存在△69-70 aa、E484K和F888L突变位点，不存在V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484Q、N501Y、P681R、P681H和E484A突变位点，则突变株为：B.1.525；
若存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、E484K和P681H突变位点，不存在K417N、K417T、L452R、E484Q、N501Y、P681R、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.620；
若存在△69-70 aa、K417N、N501Y、P681H和E484A突变位点，不存在V126A、△242-244 aa、K417T、L452R、E484K、E484Q、P681R和F888L突变位点，则突变株为：B.1.1.529。
优选地，在步骤S2中，荧光定量PCR扩增反应程序如下：42℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 5sec，60℃ 20sec，5个循环；95℃ 5sec，60℃ 20sec，采集荧光，40个循环。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
利用本发明的试剂组合和试剂盒，可以基于PCR技术对突变型进行检测。相比较NGS和Sanger全基因组测序法，在费用方面极大地下降，并且在结果数据分析也简单了很多。同时，ARMS法将扩增步骤和判断步骤结合在一起，极大缩短日常检测的周转时间，相比NGS和Sanger全基因组测序法的周转时间分别为超过24和10-12小时，PCR周转时间可缩短至3-4小时。因此，利用本发明的试剂组合和试剂盒进行SARS-CoV-2突变株检测，具有成本低、高效和易推广的特点，特别是对于相对欠发达的地区。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中针对S基因的突变位点设计的不同引物检测同一突变模板和正常模板的结果。
图2示出了本发明实施例1中针对S基因的突变位点筛选得到的最优引物检测同一突变模板和正常模板的结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株的试剂组合
本实施例针对SARS-CoV-2突变株B.1.1.7（α）、B.1.351（β）、P.1（γ）、B.1.617.2（δ）、B.1.1.529（Omicron）、B.1.617.1（κ）、B.1.525（η）和B.1.620进行基于AMRS的引物探针设计，以检测这些突变株。
具体地，引物探针针对SARS-CoV-2突变株的两个基因片段（ORF1ab基因和S基因）进行设计检测。
其中，S基因上的每个突变位点均设计3种引物探针组合，以获得最佳的引物探针组合。具体引物探针组别的引物探针序列如表1所示。
表1 S基因突变位点筛选引物探针组合序列表
Figure SMS_2
Figure SMS_3
Figure SMS_4
Figure SMS_5
Figure SMS_6
其中，各探针的荧光基团均为FAM，淬灭基团为BHQ1。
S基因各突变位点的不同引物探针组检测同一突变模板（含有突变位点基因序列的假病毒颗粒核酸）和正常模板（突变前基因序列的假病毒颗粒核酸）的对比结果如图1所示。不同引物探针组检测对比会出现各种不同情况的结果，以下是几种典型的对比结果：
如针对V126A的三组引物扩增结果，可以看到组1引物探针组检测突变模板的Ct值最靠前，Rn值最高，检测正常模板则完全未扩增；组2引物探针组虽然检测突变模板的Ct值与组1接近，但Rn值低于组1，同时检测正常模板也存在扩增；组3引物探针组虽然检测正常模板完全未扩增，但检测突变模板的Ct值明显滞后于组1和组2，同时Rn值也明显低于组1和组2。因此，V126A-组1的引物探针组合更优于其他两个组合。
再如针对L452R的三组引物的扩增，因AMRS法检测突变位点的原理，检测突变的引物探针组在检测正常模板时出现扩增是正常情况，需要筛选出可以最大区分突变模板和正常模板的引物探针组。如图1中L452R对应的图可见，三个引物探针组检测突变模板的Ct值一致，Rn值基本一致，其中组1的Rn值略高，但不明显；但检测正常模板时，可以看到组1的Ct值明显滞后于组2和组3。组1检测突变模板和正常模板的ΔCt值为17左右，可以有效区分。因此，选择组1作为L452R突变位点检测的引物探针组合。
再如针对K417T的三组引物扩增结果，组3引物探针组检测突变模板的Ct值较组1略靠前，Rn值也高于组1，但其检测正常模板的Ct值远远小于组1，组3差于组1；而组2引物探针组，虽然检测正常模板未出现扩增，要略优于组1，但其检测突变模板的Ct值显著滞后于组1，组2也差于组1。因此，选择组1作为K417T突变位点检测的引物探针组合。
综合对比S基因上突变位点的引物探针组对突变模板的检出效果和与正常模板的区分度，针对各突变位点，均选择组1作为最终的引物探针。上述每个突变位点的引物探针均采用相同的方法进行设计，组1的引物探针对突变模板的检出更准确，与正常模板的区分度更高，是发明人未曾预料到的，如图2所示。
ORF1ab基因的引物探针如表2所示：
表2 ORF1ab基因的引物探针
Figure SMS_7
其中，ORF1ab基因的探针的荧光基团也为FAM，淬灭基团也为BHQ1。
除了ORF1ab基因和S基因的检测引物探针外，同时加入人源内标GAPDH基因，用于确保试剂盒检测从采样到检测操作全过程的准确性。GAPDH基因的引物探针的具体的核苷酸序列如表3所示。
表3 GAPDH基因的引物探针
Figure SMS_8
GAPDH基因的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。
上述引物和探针可以作为试剂组合基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株。
实施例2基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株试剂盒
本实施例提供一种基于ARMS检测不同SARS-CoV-2突变株试剂盒，主要组成为实施例1中设计的引物、探针、荧光PCR试剂、阳性质控品和阴性质控品。
引物探针工作液的配制
（1）将装有引物探针干粉的离心管用离心机4000~12000rpm离心60s。
（2）1×TE Buffer作为引物探针稀释缓冲液，按照引物探针终浓度10μM进行溶解，关盖漩涡震荡60s，震荡期间，间隔15s左右上下颠倒6次，4000~12000rpm，离心60s。
（3）每个引物探针工作液按照表4分别进行配制，各组分配制成混合液，关盖漩涡震荡60s，震荡期间，间隔15s左右上下颠倒6次，4000-12000rpm，离心60s。
表4 引物探针工作液配制表
Figure SMS_9
其中，目标区域上游引物、目标区域探针和目标区域下游引物是指分别针对ORF1ab基因和S基因突变位点（△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484K、E484Q、E484A、N501Y、P681R、P681H、F888L）的上游引物、探针和下游引物，由此，得到14个体系。其中，针对S基因的上游引物、探针和下游引物为实施例1中筛选出来的组1的上游引物、探针和下游引物。例如，针对△69-70 aa突变位点，上游引物、探针和下游引物分别为△69-70-F1、△69-70-P1和△69-70-R1。
荧光PCR试剂
所用荧光PCR试剂为TaKaRa公司生产的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂。
阳性质控品和阴性质控品的配制
试剂盒内配备阳性质控品和阴性质控品，以监控从提取到检测整个过程的有效性。其中阴性质控品为1×TE，而阳性质控品为包含所有引物探针扩增子的假病毒颗粒，由3种假病毒颗粒混合而成，具体序列如下：
序列1（SEQ ID No. 124）：
GAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAGTGTAAAAGTGCCTTTTACATTCTACCATCTATTATCTCTAATGAGAAGCAAGAAATTCTTGGAACTGTTTCTTGGAATTTGCGAGAAATGCTTGCACATGCAGAAGAAACACGCAAATTAATGCCTGTCTGTGTGGAAACTAAAGCCATAGTTTCAACTATACACGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGCAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGC
序列2（SEQ ID No. 125）：
GTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATCTCTGGGACCAATGGTACTAAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGCTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAATTATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTAAAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAATAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTGATCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACT
序列3（SEQ ID No. 126）：
CAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAACGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCGGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTACAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTTATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCGTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCCTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATT
将3种假病毒颗粒序列1、序列2和序列3分别进行梯度稀释，稀释7个梯度（D1~D7），前两个高浓度（D1和D2）采取100倍稀释，从D3开始采取10倍梯度稀释。分别检测3种序列的D2-D7的Ct值，并分别选取Ct值范围20.00~26.00的稀释梯度，将选取相应稀释梯度的3种假病毒颗粒序列产物等体积混合为阳性质控品。
实施例3荧光PCR检测
1.反应体系
14种引物探针工作液对应14种体系，分别按照下表5进行反应体系的配制：
表5 体系配制表
Figure SMS_10
2.反应程序
荧光信号的收集定为FAM（靶基因）和Cy5（内标基因），数据的采集定在60℃。采用ABI7500仪器时，将“Quencher”一栏设置为“none”，“passive reference”一栏选为“none”。具体反应程序如下表6：
表6 反应程序
Figure SMS_11
3.结果分析
（1）反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值和Threshold值（可自行调节，Start值可以在3~15之间，End值可以位于5~20之间）。
（2）阴性质控品的FAM和Cy5荧光Ct值应为阴性（Ct值＞38.00）；阳性质控品的FAM和Cy5荧光Ct值应≤31.00。两个条件同时符合时，进行结果分析。
（3）针对同一个样本核酸，ORF1ab体系检测管的Cy5荧光Ct值应≤35.00；当ORF1ab体系检测管的FAM荧光Ct值＞38.00或无典型S型扩增曲线时，则是SARS-CoV-2阴性样本，不再进行具体突变位点的判读；当ORF1ab体系检测管的FAM荧光Ct值≤38.00，且有典型S型扩增曲线，则是SARS-CoV-2阳性样本，进行具体突变位点的判读。
（4）已判定为SARS-CoV-2阳性样本的，其余13个检测体系管的Cy5荧光Ct值均应≤35.00；13个检测体系管中任意一个检测管的FAM荧光Ct值≤38.00，且有典型S型扩增曲线，同时，此检测管Ct值与ORF1ab体系检测管的FAM荧光Ct值之间的差值的绝对值|△Ct|≤5.00，则判定样本存在此检测管所对应突变位点。否则，则不存在对应突变位点。
（5）获得相应的具体突变位点后，按照下表7进行SARS-CoV-2突变株判定。
表7 SARS-CoV-2突变株判定表
Figure SMS_12
其中，“+”表示存在相应的突变位点，“-”表示不存在相应的突变位点。
利用上述试剂盒和方法对部分样本进行检测，同时进行全基因组测序确定突变株类型，结果发现，两者达到100%一致性，表明了本发明的试剂盒和方法能够快速、准确地判定SARS-CoV-2突变株的类型。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS-CoV-2突变株的引物探针组合，其特征在于，包括分别用于检测S基因的突变位点的引物和探针，所述突变位点包括△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484K、E484Q、E484A、N501Y、P681R、P681H和F888L，其中，
用于检测△69-70 aa的引物序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示，探针序列如SEQ ID No. 2所示；
用于检测V126A的引物序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示，探针序列如SEQ ID No. 11所示；
用于检测△242-244 aa的引物序列分别如SEQ ID No. 19和SEQ ID No. 21所示，探针序列如SEQ ID No. 20所示；
用于检测K417N的引物序列分别如SEQ ID No. 28和SEQ ID No. 30所示，探针序列如SEQ ID No. 29所示；
用于检测K417T的引物序列分别如SEQ ID No. 37和SEQ ID No. 39所示，探针序列如SEQ ID No. 38所示；
用于检测L452R的引物序列分别如SEQ ID No. 46和SEQ ID No. 48所示，探针序列如SEQ ID No. 47所示；
用于检测E484K的引物序列分别如SEQ ID No. 55和SEQ ID No. 57所示，探针序列如SEQ ID No. 56所示；
用于检测E484Q的引物序列分别如SEQ ID No. 64和SEQ ID No. 66所示，探针序列如SEQ ID No. 65所示；
用于检测E484A的引物序列分别如SEQ ID No. 73和SEQ ID No. 75所示，探针序列如SEQ ID No. 74所示；
用于检测N501Y的引物序列分别如SEQ ID No. 82和SEQ ID No. 84所示，探针序列如SEQ ID No. 83所示；
用于检测P681R的引物序列分别如SEQ ID No. 91和SEQ ID No. 93所示，探针序列如SEQ ID No. 92所示；
用于检测P681H的引物序列分别如SEQ ID No. 100和SEQ ID No. 102所示，探针序列如SEQ ID No. 101所示；
用于检测F888L的引物序列分别如SEQ ID No. 109和SEQ ID No. 111所示，探针序列如SEQ ID No. 110所示，
各探针的5'端利用第一荧光基团标记，3'端利用第一淬灭基团标记。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针，用于检测ORF1ab基因的引物序列分别如SEQ ID No. 118和SEQ ID No. 120所示，探针序列如SEQ ID No. 119所示，5'端利用第一荧光基团标记，3'端利用第一淬灭基团标记。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测人GAPDH基因的引物和探针，用于检测人GAPDH基因的引物序列分别如SEQ ID No. 121和SEQ ID No. 123所示，探针序列如SEQ ID No. 122所示，5'端利用第二荧光基团标记，3'端利用第二淬灭基团标记，其中，所述第二荧光基团与所述第一荧光基团不同，相应地，所述第二淬灭基团与所述第一淬灭基团不同。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，将各个用于检测SARS-CoV-2 S基因的突变位点的引物和探针，以及用于检测ORF1ab基因的引物和探针，分别与用于检测人GAPDH基因的引物和探针混合在一起，形成14个混合体系。
5.一种基于突变扩增阻滞系统检测不同SARS-CoV-2突变株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~4任一所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂、阴性质控品和/或阳性质控品，其中阳性质控品为包括所述用于检测SARS-CoV-2 S基因的突变位点的引物的所有扩增子序列的假病毒颗粒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括分别具有SEQ IDNo. 124~126所示序列的假病毒颗粒的混合物。
8.权利要求4所述的引物探针组合在制备适用于以下方法检测不同SARS-CoV-2突变株的试剂盒中的应用：
S1，获得SARS-CoV-2阳性样本的核酸样本；
S2，利用所述14个混合体系分别对步骤S1获得的核酸样本进行荧光定量PCR扩增检测；
S3，根据荧光检测信号，判断是否存在相应的突变位点：
针对13个包括用于检测S基因突变位点的引物和探针的混合体系中的一个，若第二荧光基团Ct值≤35.00，第一荧光基团Ct值≤38.00，且有典型S型扩增曲线，同时与包括用于检测ORF1ab基因的引物和探针混合体系得到的第一荧光Ct值之间的差值的绝对值|△Ct|≤5.00，则判定样本存在相应的突变位点。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，突变位点与突变型的关系如下：
若存在△69-70 aa、E484K、N501Y和P681H突变位点，不存在V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484Q、P681R、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.1.7；
若存在△242-244 aa、K417N、E484K和N501Y突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、K417T、L452R、E484Q、P681R、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.351；
若存在K417T、E484K和N501Y突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、L452R、E484Q、P681R、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：P.1；
若存在L452R和P681R突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、E484K、E484Q、N501Y、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.617.2；
若存在L452R、E484Q和P681R突变位点，不存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、E484K、N501Y、P681H、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.617.1；
若存在△69-70 aa、E484K和F888L突变位点，不存在V126A、△242-244 aa、K417N、K417T、L452R、E484Q、N501Y、P681R、P681H和E484A突变位点，则突变株为：B.1.525；
若存在△69-70 aa、V126A、△242-244 aa、E484K和P681H突变位点，不存在K417N、K417T、L452R、E484Q、N501Y、P681R、F888L和E484A突变位点，则突变株为：B.1.620；
若存在△69-70 aa、K417N、N501Y、P681H和E484A突变位点，不存在V126A、△242-244aa、K417T、L452R、E484K、E484Q、P681R和F888L突变位点，则突变株为：B.1.1.529。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在步骤S2中，荧光定量PCR扩增反应程序如下：42℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 5sec，60℃ 20sec，5个循环；95℃ 5sec，60℃ 20sec，采集荧光，40个循环。
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