CN116287256A - 用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒及其应用。用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒包括尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR反应预混液和质控品，其中，PCR反应预混液包括PCR反应酶、dNTP、缓冲液、OTX1基因的引物、OTX1基因的探针、OTX1基因的阻遏物序列、SOX1基因的引物、SOX1基因的探针、SOX1基因的阻遏物序列、GAPDH基因的引物和GAPDH基因的探针。本发明具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、普及度高、检测结果稳定的优点。

Description

用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒及其应用。
背景技术
膀胱癌(Bladder Carcinoma，BC)，在全世界范围内，排在恶性肿瘤发病率第九位，在男性恶性肿瘤发病率上，位于第六位，而在女性恶性肿瘤发病率上，位于前十位之外。在欧美国家，在男性恶性肿瘤发病率上，膀胱癌仅次于前列腺癌、肺癌和结肠癌之后，位于第四位，在女性恶性肿瘤发病率上，位于第十位以后。在我国，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，男性发病率位居所有肿瘤的第八位，女性在第十二位以后。
2009年，以膀胱癌年龄标准化死亡率为例，在城市男性居民为3.79/10万，而女性居民为1.30/10万，在农村，男性居民为2.42/10万，而女性居民为0.81/10万，城市居民膀胱癌年龄标准化死亡率大于农村，且差异显著。全国卫生统计年鉴显示我国膀胱癌发病率不断提高，这个趋势在这几年尤为明显，男性膀胱癌发病率高于女性2-3倍。
膀胱癌症状：(1)血尿：膀胱黏膜会受到恶性肿瘤的侵犯，在这时就有可能会出现出血的问题。膀胱粘膜出血之后，尿中就会出现红细胞，此时就会表现出血尿的症状。血尿是膀胱癌非常常见的症状。血尿为间歇出现，一段时间有，一段时间无，所以很多人容易忽视膀胱癌的症状。(2)排尿困难：随着恶性肿瘤的生长和繁殖，肿瘤体积会越来越大，从而使膀胱局部受到明显的压迫，此时排尿就会有明显的压迫感，就会出现排尿困难的症状。(3)尿频尿急：当膀胱的恶性肿瘤不停的发展时，就有可能刺激到膀胱，使膀胱出现明显的刺激症状，表现出来就是患者很容易出现尿频、尿急的症状。(4)疼痛：肿瘤细胞非常容易坏死、溃疡，此时可能浸润膀胱壁，如果出现梗阻的话，就会出现明显的疼痛。
膀胱癌诊断方法有：
(1)膀胱镜检查：可以最直观的检查，可用组织钳取组织送检病理，为膀胱癌诊断金标准。其检验结果的敏感性和特异性均较高，但患者依存性差，检测存在风险。
(2)尿常规检查：血尿是膀胱癌的最常见症状，尿常规是诊断隐性血尿的常用方法，简单快捷，但特异性较差，适用于早期膀胱癌的筛查。
(3)尿脱落细胞检查：对膀胱癌的诊断具有重要价值，简单快捷，检测成本低，但检出率有限，适用于早期膀胱癌的筛查。
(4)X线血管造影：通过血管造影，可了解膀胱充盈度，肿瘤浸润的程度和深度。
(5)常规肿瘤标志物：膀胱肿瘤抗原(BTA)、ABO(H)血型抗原、核基质蛋白22(NMP22)、癌胚抗原(CEA)、纤维蛋白降解产物(FDP)等，此类检测无创、快捷、成本低，但是检出率有限，特异性较差，尤其对于早期肿瘤。
DNA甲基化是科学家们最早发现的DNA修饰途径之一，即在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶。DNA甲基化能够引起染色质结构、DNA稳定性等发生改变，从而控制机体基因的表达。
癌细胞与健康细胞在DNA甲基化方面存在不同。这些不同被作为生物标记物用于检测肿瘤的发生和复发，预测肿瘤病人的预后。DNA甲基化参与特定的调控机制，这些都能决定细胞的基因表达模式，还可以遗传到子细胞，不存在DNA序列的改变。利用DNA甲基化检测，可发现早期肿瘤与肿瘤的早期复发。
目前，亟需提供一种特异性好、灵敏度高、成本低廉的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、普及度高、检测结果稳定的优点；本发明同时提供了用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，通过对尿沉渣DNA甲基化异常高灵敏度检测，可同时对两个膀胱癌标记物的甲基化异常进行分析，对尿沉渣DNA异常有低至0.1％的检测灵敏度，可实现肿瘤的早期发现。
本发明所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，包括尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR反应预混液和质控品，其中，PCR反应预混液包括PCR反应酶、dNTP、缓冲液、OTX1基因的引物、OTX1基因的探针、OTX1基因的阻遏物序列、SOX1基因的引物、SOX1基因的探针、SOX1基因的阻遏物序列、GAPDH基因的引物和GAPDH基因的探针；
OTX1基因的引物为OTX1-F和OTX1-R，
OTX1基因的探针为OTX1-Pro，
OTX1基因的阻遏物序列为OTX1-Blocker，
SOX1基因的引物为SOX1-OT-F和SOX1-OT-R，
SOX1基因的探针为SOX1-OT-Pro，
SOX1基因的阻遏物序列为SOX1-OT-Blocker，
GAPDH基因的引物为GAPDH-F和GAPDH-R，
GAPDH基因的探针为GAPDH-Pro，
OTX1-F、OTX1-R、OTX1-Pro、OTX1-Blocker、SOX1-OT-F、SOX1-OT-R、SOX1-OT-Pro、SOX1-OT-Blocker、GAPDH-F、GAPDH-R和GAPDH-Pro依次为SEQ ID NO.01～11所示的序列。
所述的OTX1-F中5’端到3’端第18位腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
OTX1-R中5’端到3’端第14位胞嘧啶脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
OTX1-Pro的5’端带有Oregon Green修饰或FAM修饰，3’端带有Dabcyl修饰或BHQ1修饰；
OTX1-Blocker的3’端带有间臂3修饰、间臂5修饰或磷酸化修饰中的一种。
所述的SOX1-OT-F中5’端到3’端第17位鸟嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
SOX1-OT-R中5’端到3’端第16位腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
SOX1-OT-Pro的5’端带有JOE修饰、HEX修饰或CY3修饰中的一种，3’端带有BHQ1修饰；
SOX1-OT-Blocker的3’端带有间臂3修饰、间臂5修饰或磷酸化修饰中的一种。
所述的GAPDH-Pro的5’端带有CY5修饰或CY5.5修饰，3’端带有BHQ2修饰。
所述的尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂包括亚硫酸氢盐修饰试剂、DNA保护液、结合液、脱磺液、漂洗液、洗脱液和氧化硅磁珠悬浮液。
所述的亚硫酸氢盐修饰试剂为亚硫酸氢钠和硫酸钠的混合物，其中，亚硫酸氢钠和硫酸钠的质量比为4:1。
所述的DNA保护液为水溶性VE的二甲醚溶液，浓度为3-4.5M。
所述的结合液为异硫酸氢胍溶液，浓度为6-9M。
所述的脱磺液为氢氧化钠溶液，浓度为1.1-2.2M。
所述的漂洗液为75％乙醇和Tris-HCl的混合物，Tris-HCl的浓度为8.2-12.1mM。
所述的洗脱液为Tris-HCl溶液，浓度为10mmol/L。
所述的氧化硅磁珠悬浮液是采用含有1％乙醇的超纯水悬浮氧化硅磁珠制得，其中，氧化硅磁珠的浓度为78mg/ml。
所述的PCR反应酶为热启动Taq酶，缓冲液为聚合酶缓冲液。
所述的质控品为阳性质控品(PC)、阴性质控品(NC)和空白质控品(NTC)，阳性质控品为EJ细胞系DNA，阴性质控品为Jurkat细胞系DNA，空白质控品为去离子水。
本发明所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)采用尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂对样品DNA和质控品DNA进行亚硫酸氢盐修饰；
(3)采用PCR反应预混液对样品DNA和质控品DNA进行PCR检测。
步骤(1)中所述的样本为尿液，样本的体积为10-50ml。
步骤(3)中所述的PCR检测体系如下：
PCR反应预混液15μl
PCR级的去离子水(ddH2O)7μl
样本DNA或质控品DNA 8μl。
步骤(3)中所述的PCR检测程序如下：
①37℃反应32min；
②94℃反应3min；
③60℃反应45s、95℃反应15s，循环5次：
④63℃反应3秒、56-60℃反应45s、94℃反应15s，循环40次，收集荧光信号；
⑤40℃反应5s。
步骤③中5个循环不收集荧光信号，步骤④中40个循环收集荧光信号。
步骤(3)中所述的PCR检测中采集荧光信号的通道有3个，3个通道的激发-发射波长分别为470-510nm、530-565nm和630-665nm。
SEQ ID NO.01～11序列见表1。
表1 SEQ ID NO.01～11序列
Figure BDA0004090805510000041
Figure BDA0004090805510000051
本发明的试剂盒为一种高灵敏度、特异性的尿沉渣DNA甲基化多靶标检测试剂盒，用于膀胱癌的早期诊断。该试剂盒包括尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR反应预混液、质控品试剂。PCR反应预混液中包括PCR反应酶、dNTP、缓冲液、以及OTX1、SOX1、GAPDH三个基因的特异性引物、探针、阻遏物序列，引物携带锁核酸修饰基团，探针携带了荧光基团、荧光淬灭基团，阻遏物序列携带了间臂修饰基团或磷酸化修饰基团。本试剂盒具有特异性好、灵敏度高、成本低廉、易于普及的特点。本发明提供一种以检测尿沉渣DNA甲基化来诊断膀胱癌的方法。
锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2'与4'碳连结在一起。锁核酸修饰可以增加引物或探针的融解温度(Tm值)，加强引物或探针结合的稳定性，利用LNA可以起到增加引物特异性结合、增加引物Tm值的作用。本发明中，通过对引物靠近3’端的部分进行LNA修饰，以此增加引物对于阳性模板的结合稳定性，降低引物对于阴性模板的结合稳定性，从而有效提高了引物的特异性，达到提高PCR体系检测灵敏度的目的。
本发明中OTX1-Blocker、SOX1-OT-Blocker序列针对阴性模板序列设计，可有效的封闭阴性模板，阻止阳性的一端引物或者探针结合在阴性模板上，影响检出率。
本发明的有益效果如下：
(1)特异性好：常规肿瘤标志物在非肿瘤的病理或生理条件下也有可能升高，临床检测上有一定比例的假阳性，但是脱落细胞的甲基化标志物只发生在异常细胞中，因此具有较好的特异性。
(2)可跟踪患病病程：膀胱内脱落细胞DNA甲基化检测，可反映患者采样当天尿液内是否有肿瘤细胞，当进行肿瘤组织手术切除或其他治疗手段后，若治疗彻底，在治疗24小时后可检测为脱落细胞DNA甲基化阴性，因此能够实时反映肿瘤的动态进展。
(3)敏感性更高：依赖于尿沉渣高灵敏度检测技术，本发明检测试剂盒可对单拷贝肿瘤脱落细胞DNA甲基化进行定性分析，由此实现膀胱癌的高敏感性检测。
(4)可进行复发风险评估：当进行肿瘤组织手术切除后，通过使用本发明试剂盒检测尿液脱落细胞甲基化来发现手术是否切除彻底，是否有微小病灶残留，由此评估治疗后复发风险。
附图说明
图1是SOX1基因PCR体系检测线结果图。
图2是OTX1基因PCR体系检测线结果图。
图3是N1-N5样本SOX1检测结果图。
图4是N1-N5样本OTX1检测结果图。
图5是S1-S5样本OTX1检测结果图。
图6是S1-S5样本SOX1检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒组成见表2。
表2用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒组成
Figure BDA0004090805510000061
Figure BDA0004090805510000071
尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂组成如下：
亚硫酸氢盐修饰试剂为40g亚硫酸氢钠和10g硫酸钠。
DNA保护液为水溶性VE的二甲醚溶液，浓度为3.5M。
结合液为异硫酸氢胍溶液，浓度为6.8M。
脱磺液为氢氧化钠溶液，浓度为1.8M。
漂洗液为75％乙醇和Tris-HCl的混合物，Tris-HCl的浓度为10.3mM。
洗脱液为Tris-HCl溶液，浓度为10mmol/L。
氧化硅磁珠悬浮液是采用含有1％乙醇的超纯水悬浮氧化硅磁珠制得，其中，氧化硅磁珠的浓度为78mg/ml。
PCR反应预混液组成如下：
2×聚合酶缓冲液；
热启动Taq酶，浓度为0.28U；
dNTPs，浓度为4.0mM；
OTX1基因的引物、OTX1基因的探针、OTX1基因的阻遏物序列、SOX1基因的引物、SOX1基因的探针、SOX1基因的阻遏物序列、GAPDH基因的引物和GAPDH基因的探针为SEQ IDNO.01～11所示的序列；其中，引物终浓度为0.2μmol/L，探针终浓度为0.04μmol/L，阻遏物序列终浓度为0.05μmol/L。
序列SEQ ID NO.01的第18位(5’端到3’端)腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；序列SEQ ID NO.02的第14位(5’端到3’端)胞嘧啶脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；序列SEQ IDNO.05的第17位(5’端到3’端)鸟嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；序列SEQ ID NO.06的第16位(5’端到3’端)腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰。
序列SEQ ID NO.04的3’端带有间臂3修饰；序列SEQ ID NO.08的3’端带有间臂3修饰。
SEQ ID NO.03序列的5’端带有Oregon Green修饰，3’端带有Dabcyl修饰；SEQ IDNO.07序列的5’端带有JOE修饰，3’端带有BHQ1修饰；SEQ ID NO.11序列的5’端带有CY5修饰，3’端带有BHQ2修饰。
阳性质控品为EJ细胞系DNA，阴性质控品为Jurkat细胞系DNA，空白质控品为去离子水。
用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，包括如下步骤：
第一步：对样本、质控品进行核酸富集，洗脱液洗脱后进行亚硫酸氢盐修饰，纯化后得到试剂盒检测模板；使用“MagMAXTM核酸提取试剂盒(大体积)”(Thermo Scientific，货号:AM1939)试剂提取尿沉渣DNA。操作步骤如下：
(1)取10ml尿液，尿液为晨尿。
(2)将尿液倒入离心管中，4000rpm/min离心15min，倒出上清。
(3)尿沉渣中加入5ml PBS缓冲液，涡旋重悬后，4000rpm/min离心15min，倒出上清。
(4)加入200μl蛋白消化液和40μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，盖紧管盖，涡旋重悬后置于金属浴60℃孵育1h；(期间混匀数次)
(5)金属浴90℃孵育1h，结束后获得消化混合液。
(6)金属浴结束后，加入300μl裂解液混匀，将混合液全部转入吸附柱中。
(7)10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
(8)向吸附柱中加入500μl洗涤液A，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
(9)向吸附柱中加入500μl洗涤液B，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。
(10)重新放回收集管，空管12000rpm离心2min。
(11)将吸附柱置于新的1.5ml离心管，打开管盖，室温放置5min彻底晾干吸附柱。
(12)向吸附柱中悬空加入50-100μl洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心1min，收集DNA产物。
第二步：对获得的DNA进行亚硫酸氢盐修饰。
在装有亚硫酸氢盐修饰试剂的管子中加入900ul超纯水，震荡混匀5分钟，得到亚硫酸氢盐修饰试剂溶液。
将得到的DNA模板取30ul加入200ul EP管中，然后加入DNA保护液15μl，亚硫酸氢盐修饰试剂溶液85μl，使用RNase free water补至150μl，瞬时离心后放入PCR仪中，设置程序为98℃10min，64℃120min运行，运行结束后得到反应混合液。最后进行下列步骤：
(1)在2ml EP管中，加入上述反应混合液，再加入1.6ml结合液，涡旋混匀，瞬时离心，然后加入20ul氧化硅磁珠悬浮液。
(2)吸出液体转入离心管中，13000rpm/min离心40s，弃流出液。
(3)重复上一步骤。
(4)加入250μl漂洗液，13000rpm/min离心10s，弃流出液。
(5)加入250μl脱磺液，室温放置15min，13000rpm/min离心10s，弃流出液。
(6)加入250μl漂洗液，13000rpm/min离心15s，弃流出液。
(7)加入250μl漂洗液，13000rpm/min离心2min，弃流出液。
(8)在离心柱中央位置加入30μl洗脱液，室温放置5min，13000rpm/min离心3min，流出液即为纯化后的DNA。
第三步：PCR检测。
在200μl EP管中，加入PCR反应预混液15μl，PCR级的去离子水7μl，样本DNA或质控品DNA 8μl。
将上述加好反应液的EP管放入实时定量荧光PCR仪中，检测程序如下：
步骤1：37℃反应32min；
步骤2：94℃反应3min；
步骤3：60℃反应45s，95℃反应15s，循环5次：
步骤4：63℃反应3s，56-60℃反应45s、94℃反应15s，循环40次(收集荧光)；
步骤5：40℃反应：5s
PCR检测需要采集荧光信号的通道有3个，3个通道的激发-发射波长分别为：470-510nm、530-565nm和630-665nm。
第四步：对检测数据进行分析。
记录检测数据，按照以下标准对结果进行判读。
(1)检测无效判读：样本检测孔GAPDH基因的扩增Ct值≥36；或NTC质控品OTX1基因、SOX1基因有扩增，且荧光值deta Rn＞0.1；或NC质控品中OTX1基因、SOX1基因扩增，且荧光值deta Rn＞0.1。
(2)检测阳性判读：在无检测无效判读的前提下，SOX1基因的扩增Ct值≤38，或OTX1基因的扩增Ct值≤38，且GAPDH基因的扩增Ct值≤36。
(3)检测阴性判读：在无检测无效判读的前提下，SOX1基因的扩增Ct值＞38，或OTX1基因的扩增Ct值＞38，且GAPDH基因的扩增Ct值≤36。
小样本临床验证结果表明：本发明试剂盒检测灵敏度为85％，特异性为95％。
方法验证如下：
1、尿沉渣DNA的回收率验证
检测方法：
检测样本为参考品，参考品为膀胱癌细胞系EJ细胞所提取的DNA(经过NanoDrop定量)和健康人(经膀胱镜检查)尿液所提取的DNA(经过NanoDrop定量)的混合物。参考品体积为1ml，分别配制成EJ细胞DNA的浓度为5ng/ml、20ng/ml、80ng/ml的参考品。使用“MagMAXTM核酸提取试剂盒(大体积)”(Thermo Scientific，货号:AM1939)试剂提取参考品。
检测仪器设备有：
高速离心机、荧光定量PCR仪(ABI 7500)，漩涡震荡仪，瞬时离心机，冰箱，磁力架，超净工作台，NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)等。
1)取1ml参考品，加入200μl蛋白消化液和40μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，盖紧管盖，涡旋重悬后置于金属浴60℃孵育1h(期间混匀数次)；
2)金属浴90℃孵育1h，结束后获得消化混合液；
3)金属浴结束后，加入300μl裂解液混匀，将混合液全部转入吸附柱中；
4)10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
5)向吸附柱中加入500μl洗涤液A，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
6)向吸附柱中加入500μl洗涤液B，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
7)重新放回收集管，空管12000rpm离心2min；
8)将吸附柱置于新的1.5ml离心管，打开管盖，室温放置5min彻底晾干吸附柱；
9)向吸附柱中悬空加入50-100μl洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心1min，收集DNA产物。
检测结果及讨论：
使用ddPCR对纯化回收回来的DNA进行定量，设计了ddPCR引物，引物只能扩增EJ细胞DNA，得到的回收率见表3。
表3回收率结果
投入量(ng) 回收量(ng) 回收率
5 2.45 49％
20 14.75 73.75％
80 63.7 79.63％
2、尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰转化率确定
检测仪器设备有：
高速离心机、荧光定量PCR仪(ABI)、漩涡震荡仪、瞬时离心机、冰箱、磁力架、超净工作台、NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)等。
检测方法：
取一个200μl EP管，依次加入DNA模板30μl，DNA保护液15μl，亚硫酸氢盐修饰试剂溶液85μl，RNase free water补至150μl，盖紧管盖涡旋混匀，瞬时离心。再将EP管放入PCR仪，设置程序为98℃10min，64℃120min，运行。
按照下列步骤纯化DNA：
(1)在2ml EP管中，加入上步反应混合液，再加入1.6ml结合液，涡旋混匀，瞬时离心，后加入20ul氧化硅磁珠悬浮液；
(2)吸出800μl液体转入离心管中，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(3)重复上一步骤；
(4)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(5)加入200μl脱磺液，室温放置20min，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(6)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(7)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心2min，弃流出液；
(8)在离心柱中央位置加入20μl洗脱液，室温放置3min，12000rpm/min离心1min，流出液即为纯化后的DNA。
检测结果及讨论：
将纯化的DNA进行sanger测序，与原序列对比后得到C转U的转化率。共统计456个C，只有一个C未转变为U，转化率为99.78％。
3、PCR检测体系检测下线分析
检测仪器设备有：
高速离心机、荧光定量PCR仪(ABI)，漩涡震荡仪，瞬时离心机，冰箱，磁力架，超净工作台，NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)等。
配置参考品：
使用EJ细胞DNA和健康人(经膀胱镜检查)的尿沉渣DNA配置参考品，使用ddPCR对DNA进行定量，健康人(经膀胱镜检查)的尿沉渣DNA为阴性背景DNA，参考品中EJ细胞DNA的占比为0.2％，每个样本各重复8次检测。
在200μl EP管中，加入PCR反应预混液15μl，PCR级的去离子水7μl，参考品或质控品DNA 8μl。
将上述EP管放入qPCR仪器中，检测程序如下：
步骤1：37℃反应32min；
步骤2：94℃反应3min；
步骤3：60℃反应45s、95℃反应15s，循环5次：
步骤4：63℃反应3s、56-60℃反应45s、94℃反应15s，循环40次(收集荧光)；
步骤5：40℃反应：5s
PCR检测需要采集荧光信号的通道有3个，3个通道的激发-发射波长分别为：470-510nm、530-565nm和630-665nm。
(2)检测结果及讨论
8次对于检测下线参考品的检测中，GAPDH基因、OTX1基因、SOX1基因均检出，检出率为100％，检查结果见图1-2。图1是SOX1基因PCR体系检测线结果图，8例重复检测中，内参基因GAPDH全扩增，SOX1基因也全扩增。图2是OTX1基因PCR体系检测线结果图，8例重复检测中，内参基因GAPDH全扩增，OTX1基因也全扩增。
4、膀胱癌临床样本检测
检测5例膀胱癌样本，检测5例健康人样本，1例阳性质控，1例阴性质控，1例空白对照样本。
膀胱癌样本信息见表4，健康人样本信息见表5。
表4膀胱癌样本信息
样本编号 样本类型 样本体积 样本病理分期
S1 晨尿 10ml II期
S2 晨尿 10ml II期
S3 晨尿 10ml IIIB期
S4 晨尿 10ml II期
S5 晨尿 10ml IIIB期
表5健康人样本信息
样本编号 样本类型 样本体积 膀胱镜检查
N1 晨尿 10ml 正常
N2 晨尿 10ml 正常
N3 晨尿 10ml 正常
N4 晨尿 10ml 正常
N5 晨尿 10ml 正常
检测仪器设备有：高速离心机、荧光定量PCR仪(ABI)、漩涡震荡仪、瞬时离心机、冰箱、磁力架、超净工作台、NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)等。
检测步骤一：核酸纯化。
使用“MagMAXTM核酸提取试剂盒(大体积)”(Thermo Scientific，货号:AM1939)试剂提取所检测样本。
1)取10ml检测样本或质控品，吸取后加入50ml离心管中，4000rpm/min离心15min，倒出上清。沉渣中加入5ml PBS缓冲液，涡旋重悬后，4000rpm/min离心15min，倒出上清。
2)加入200μl蛋白消化液和40μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，盖紧管盖，涡旋重悬后置于金属浴60℃孵育1h(期间混匀数次)；
3)金属浴90℃孵育1h，结束后获得消化混合液；
4)金属浴结束后，加入300μl裂解液混匀，将混合液全部转入吸附柱中；
5)10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
6)向吸附柱中加入500μl洗涤液A，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
7)向吸附柱中加入500μl洗涤液B，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；
8)重新放回收集管，空管12000rpm离心2min；
9)将吸附柱置于新的1.5ml离心管，打开管盖，室温放置5min彻底晾干吸附柱；
10)向吸附柱中悬空加入50-100μl洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心1min，收集DNA产物。
检测步骤二：DNA亚硫酸氢盐修饰。
取一个200μl EP管，依次加入DNA模板30μl，DNA保护液15μl，亚硫酸氢盐修饰试剂溶液85μl，RNase free water补至150μl，然后放入PCR仪中，设置程序98℃10min，64℃120min，运行。
然后再按照下列步骤纯化DNA：
(1)在2ml EP管中，加入上步反应混合液，再加入1.6ml结合液，涡旋混匀，瞬时离心，加入20ul氧化硅磁珠悬浮液；
(2)吸出800μl液体转入离心管中，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(3)重复上一步骤；
(4)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(5)加入200μl脱磺液，室温放置20min，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(6)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心30s，弃流出液；
(7)加入200μl漂洗液，12000rpm/min离心2min，弃流出液；
(8)在离心柱中央位置加入20μl洗脱液，室温放置3min，12000rpm/min离心1min，流出液即为纯化后的DNA。
检测步骤三：PCR检测。
在200μl EP管中，加入PCR预混液15μl，PCR级的去离子水7μl，样本DNA或质控品DNA 8μl，分装至96孔板中，排板方式见表6。
表6排板方式
S1 N1 S1 N1
S2 N2 S2 N2
S3 N3 S3 N3
S4 N4 S4 N4
S5 N5 S5 N5
NC PC NC PC
NTC NTC
将上述EP管放入qPCR仪器中，检测程序如下：
步骤1：37℃反应32min；
步骤2：94℃反应3min；
步骤3：60℃反应45s、95℃反应15s，循环5次：
步骤4：63℃反应3s，56-60℃反应45s，94℃反应15s，循环40次(收集荧光)；
步骤5：40℃反应5s
PCR检测需要采集荧光信号通道有3个，激发-发射波长分别为：470-510nm、530-565nm和630-665nm。
检测步骤四：对检测数据进行分析。
记录检测数据，按照以下标准对结果进行判读。
(1)检测无效判读：样本检测孔GAPDH基因的扩增Ct值≥36；或NTC质控品OTX1基因、SOX1基因有扩增，且荧光值deta Rn＞0.1；或NC质控品中OTX1基因、SOX1基因扩增，且荧光值deta Rn＞0.1。
(2)检测阳性判读：SOX1基因的扩增Ct值≥38，或OTX1基因的扩增Ct值≥38，且GAPDH基因的扩增Ct值≤36。
(3)检测阴性判读：SOX1基因的扩增Ct值＞38，或OTX1基因的扩增Ct值＞38，且GAPDH基因的扩增Ct值≤36。
检测步骤五：检测结果及讨论。
检测结果见表7。
表7检测结果
样本编号 有效性判读 结果判读
S1 有效 阳性
S2 有效 阴性
S3 有效 阳性
S4 有效 阳性
S5 有效 阳性
N1 有效 阴性
N2 有效 阴性
N3 有效 阴性
N4 有效 阴性
N5 有效 阴性
共检测5例膀胱癌患者样本，有4例为阳性；共检测5例健康人，均为阴性；检测结果见图3-6。图3是N1-N5样本SOX1检测结果图，内参基因GAPDH全扩增，SOX1基因都未扩增。图4是N1-N5样本OTX1检测结果图，内参基因GAPDH全扩增，OTX1基因都未扩增。图5是S1-S5样本OTX1检测结果图，内参基因GAPDH全扩增，OTX1基因4例扩增，1例未扩增。图6是S1-S5样本SOX1检测结果图，内参基因GAPDH全扩增，SOX1基因4例扩增，1例未扩增。

Claims (10)

1.一种用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于包括尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR反应预混液和质控品，其中，PCR反应预混液包括PCR反应酶、dNTP、缓冲液、OTX1基因的引物、OTX1基因的探针、OTX1基因的阻遏物序列、SOX1基因的引物、SOX1基因的探针、SOX1基因的阻遏物序列、GAPDH基因的引物和GAPDH基因的探针；
OTX1基因的引物为OTX1-F和OTX1-R，
OTX1基因的探针为OTX1-Pro，
OTX1基因的阻遏物序列为OTX1-Blocker，
SOX1基因的引物为SOX1-OT-F和SOX1-OT-R，
SOX1基因的探针为SOX1-OT-Pro，
SOX1基因的阻遏物序列为SOX1-OT-Blocker，
GAPDH基因的引物为GAPDH-F和GAPDH-R，
GAPDH基因的探针为GAPDH-Pro，
OTX1-F、OTX1-R、OTX1-Pro、OTX1-Blocker、SOX1-OT-F、SOX1-OT-R、SOX1-OT-Pro、SOX1-OT-Blocker、GAPDH-F、GAPDH-R和GAPDH-Pro依次为SEQ ID NO.01～11所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的OTX1-F中5’端到3’端第18位腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
OTX1-R中5’端到3’端第14位胞嘧啶脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
OTX1-Pro的5’端带有Oregon Green修饰或FAM修饰，3’端带有Dabcyl修饰或BHQ1修饰；
OTX1-Blocker的3’端带有间臂3修饰、间臂5修饰或磷酸化修饰中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的SOX1-OT-F中5’端到3’端第17位鸟嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
SOX1-OT-R中5’端到3’端第16位腺嘌呤脱氧核苷酸带有锁核酸修饰；
SOX1-OT-Pro的5’端带有JOE修饰、HEX修饰或CY3修饰中的一种，3’端带有BHQ1修饰；
SOX1-OT-Blocker的3’端带有间臂3修饰、间臂5修饰或磷酸化修饰中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的GAPDH-Pro的5’端带有CY5修饰或CY5.5修饰，3’端带有BHQ2修饰。
5.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂包括亚硫酸氢盐修饰试剂、DNA保护液、结合液、脱磺液、漂洗液、洗脱液和氧化硅磁珠悬浮液，其中，亚硫酸氢盐修饰试剂为亚硫酸氢钠和硫酸钠的混合物，DNA保护液为水溶性VE的二甲醚溶液，结合液为异硫酸氢胍溶液，脱磺液为氢氧化钠溶液，漂洗液为75％乙醇和Tris-HCl的混合物，洗脱液为Tris-HCl溶液，氧化硅磁珠悬浮液是采用含有1％乙醇的超纯水悬浮氧化硅磁珠制得。
6.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的PCR反应酶为热启动Taq酶，缓冲液为聚合酶缓冲液。
7.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒，其特征在于所述的质控品为阳性质控品、阴性质控品和空白质控品，阳性质控品为EJ细胞系DNA，阴性质控品为Jurkat细胞系DNA，空白质控品为去离子水。
8.一种权利要求1-7任一所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)采用尿沉渣DNA亚硫酸氢盐修饰试剂对样品DNA和质控品DNA进行亚硫酸氢盐修饰；
(3)采用PCR反应预混液对样品DNA和质控品DNA进行PCR检测。
9.根据权利要求8所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，其特征在于步骤(1)中所述的样本为尿液，样本的体积为10-50ml。
10.根据权利要求8所述的用于膀胱癌早期诊断的检测试剂盒的应用，其特征在于步骤(3)中所述的PCR检测体系如下：
PCR反应预混液15μl
PCR级的去离子水7μl
样本DNA或质控品DNA 8μl；
PCR检测程序如下：
①37℃反应32min；
②94℃反应3min；
③60℃反应45s、95℃反应15s，循环5次：
④63℃反应3秒、56-60℃反应45s、94℃反应15s，循环40次，收集荧光信号；
⑤40℃反应5s。
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