CN116287197A - 一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记、检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记、检测方法及装置。一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记,所述SNP分子标记如表10所示。本发明使用孕妇患者外周血中的游离DNA和胎儿生物学父亲外周血基因组DNA作为检测对象,采用液相杂交捕获和高通量测序技术,使用数千个SNP位点,通过夫妻双方的基因型,获得胎儿的基因型,消除胎儿来源cfDNA对移植器官来源cfDNA含量的影响,准确测定移植器官cfDNA的浓度,检测灵敏度要更高,只需患者外周血即可以进行多次检测,实现长期动态监测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记、检测方法及装置。
背景技术
器官移植是临床治疗终末期器官病变的优选手段,而术后排斥反应是影响移植器官生存率的重要因素,是器官移植患者面临的最大的威胁。早期诊断及时治疗排斥反应可以有效减少移植器官的病理损害程度,延长移植器官的存活时间。
穿刺活检一直是临床检测移植器官损伤状况的金标准,但取材部位受限,不能全面反应移植器官的病理情况,且常有创伤性并发症出现。所以寻求一种无创的检测技术成为努力的方向。目前临床上常规的无创检测方法有影像学、生化指标(丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶、肌酐或心肌酶谱)检测,但检测的灵敏度和特异性低。比如血清中肌酐除了肾排斥反应,肾移植患者排异药物中毒引起的急性肾衰竭也会导致肌酐升高。目前,器官移植患者面临的主要临床问题之一就是缺少用于早期诊断和连续监控移植物排斥风险的高灵敏度、高特异性且非侵入性的检测。
游离DNA(cell free DNA,cfDNA),是指游离于细胞外的部分降解了的机体内源DNA,主要来自于细胞的凋亡或坏死。异源或自体的体细胞突变DNA都可以通过无创的方法在本体的血液中检测到,已广泛应用到肿瘤早筛,肿瘤靶向治疗和无创产前诊断中。在器官移植领域,Dennis Lo最早在女性肝、肾移植患者的血浆中检测到来自男性供体组织的游离DNA,被认为是供体器官在患者体内凋亡或坏死,细胞裂解释放出的cfDNA,游离DNA可以作为器官移植排异的标志物。
孕妇器官移植患者是器官移植中一类特殊的群体,患者血液中除自身的cfDNA外,还包括移植器官释放的cfDNA和来自胎儿的cfDNA,而后两类cfDNA都属于异源cfDNA,单纯的检测异源cfDNA含量,不能真实的反映移植器官释放的cfDNA含量,从而不能准确的评估该类患者移植器官的损伤程度;成为孕妇器官移植患者进行无创检测的一大难点,也是临床在处理该类患者的痛点。因此,临床上需要一种适合孕妇器官移植患者的无创检测方法。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于提供一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记、检测方法及装置。
为此,本发明提供了如下的技术方案:
一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记,所述SNP分子标记如表10所示。
一种所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针,所述探针是基于所述的SNP分子标记设计的。
可选的,每个SNP分子标记的探针包括上游探针和下游探针,所述上游探针为以SNP位点为起始向5’端方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的,所述下游探针为以SNP位点为起始向3’端方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的。
一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的试剂盒或检测芯片,包括所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针。
一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的方法,包括如下步骤:
S1、获取待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA;
S2、文库构建,获得cfDNA文库和基因组DNA文库;
S3、使用所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针对构建的文库进行目标区域捕获,扩增富集目标区域序列,测序;
S4、分别从cfDNA文库和基因组DNA文库的测序数据中提取所述SNP分子标记位点信息,进行基因分型,筛选cfDNA文库测序数据和基因组DNA文库测序数据中基因型相同且两者均为纯合子的SNP位点作为有效SNP位点;
S5、检测cfDNA文库中所述有效SNP位点处的基因分型,将所述有效SNP位点的基因分型与步骤S4中的有效SNP位点基因分型不一致的信号除以有效SNP位点处的总测序信号,所得到的比值为供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA;
S6、对供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA进行校正,校正计算公式如下:
adj_ddcfDNA=ddcfDNA/(ddcfDNA+(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA));
公式中ffcfDNA通过表11得到;
将步骤S5中得到的ddcfDNA代入所述校正计算公式中。
可选的,所述待测样本为血液样本;
可选的,为外周血样本。
一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的装置,包括:
样本获取单元:用于获取待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA。
文库构建单元:用于对待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA进行文库构建;
目标区域捕获和测序单元:使用所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针对构建的文库进行目标区域捕获,扩增富集目标区域序列,测序;
有效SNP位点提取单元:用于将cfDNA文库和基因组DNA文库的测序数据中提取所述SNP分子标记位点信息,进行基因分型,筛选cfDNA文库测序数据和基因组DNA文库测序数据中基因型相同且两者均为纯合子的SNP位点作为有效SNP位点;
供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA计算单元:用于检测cfDNA文库中所述有效SNP位点处的基因分型,将所述有效SNP位点的基因分型与有效SNP位点提取单元中的有效SNP位点基因分型不一致的信号除以有效SNP位点处的总测序信号,所得到的比值为供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA;
校正单元:对供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA进行校正,校正计算公式如下:
adj_ddcfDNA=ddcfDNA/(ddcfDNA+(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA));
公式中ffcfDNA通过表11得到;
将供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA计算单元中得到的ddcfDNA代入所述校正计算公式中,得到校正后的供体来源cfDNA的浓度adj_ddcfDNA。
可选的,包括:
所述待测样本为血液样本;
可选的,为外周血样本。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供了一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记,所述SNP分子标记如表10所示。本发明使用孕妇患者外周血中的游离DNA和胎儿生物学父亲外周血基因组DNA作为检测对象,采用液相杂交捕获和高通量测序技术,使用数千个所述SNP分子标记,通过夫妻双方的基因型,获得胎儿的基因型,消除胎儿来源cfDNA对移植器官来源cfDNA含量的影响,准确测定移植器官cfDNA的浓度,检测灵敏度高;同时,只需患者外周血即可以进行多次检测,实现长期动态监测的目的。
2.本发明提供了一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的方法,使用孕妇患者外周血中的游离DNA和胎儿生物学父亲外周血基因组DNA作为检测对象,使用数千个所述SNP分子标记,通过夫妻双方的基因型,获得胎儿的基因型,消除胎儿来源cfDNA对移植器官来源cfDNA含量的影响,利用校正计算公式计算得到移植器官cfDNA的浓度,检测灵敏度高,准确度高。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
1、cfDNA和基因组DNA的获取
1.1样本采集和血浆分离
(1)样本采集:分别抽取患者和胎儿生物学父亲外周血液8ml左右,用cfDNA专用采血管保存运输;
(2)血浆分离:获得新鲜全血样本,1600g,4℃离心10min,分离上清液至新的离心管,将上清液继续16000g,4℃离心10min,离心后的上清液转移至新的离心管,得到分离后的血浆,血浆可在-20℃下保存;
(3)血细胞分离:全血样本离心后的下层沉淀即为血细胞。
1.2、使用莱枫基因组DNA提取试剂盒(DK603)提取分离后的血细胞,得到基因组DNA;用Qiagen游离DNA提取试剂盒(DK607)抽提分离后血浆,得到cfDNA。
2、文库构建
2.1、分别取1μl cfDNA和基因组DNA进行Qubit3.0定量。
2.2、以基因组DNA和cfDNA作为样本,使用KAPA LTP Library Preparation Kit分别制备基因组DNA文库和cfDNA文库,具体步骤如下所示:
(1)末端补平
a.向标记好的离心管中加入表1所示的末端补平混合液,用移液器吹打混匀;
表1末端补平混合液
试剂名称 | 体积 |
水 | 8μl |
KAPA End Repair Buffer(10X) | 7μl |
KAPA End Repair Enzyme Mix | 5μl |
总体积 | 20μl |
b.取50μl步骤2.1中定量后的样本,加入20μl表1所示的末端补平混合液,得到总体积为70μl的样本反应液,用移液器吹打混匀;
c.在PCR仪上运行如下程序:
20℃保持30min,
10℃静置。
(2)补平后纯化
重悬浮(用Agencourt AMpure XP reagent纯化),磁珠室温放置30min,具体如下:
a.样品管中加入120ul磁珠和步骤(1)中末端补平后的样本反应液,充分吹打混匀,室温静置5min;
b.将样品管置于磁力架上,待上清澄清后,吸弃上清;
c.保持样品管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇,室温孵育至少30sec,转动离心管以清洗磁珠,吸弃上清;
d.保持样品管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇,室温孵育至少30秒,转动离心管以清洗磁珠,吸弃上清;
e.将样品管瞬时离心,放置于磁力架上去掉残存的乙醇,室温晾干至磁珠表面无明亮反光后,从磁力架上取下样品管,加入42ul Nuclease-Free water重悬磁珠。
(3)加A尾
a.根据样本的数量,计算所需试剂用量,于标记好的离心管中加入表2所示的混合液,用移液器吹打混匀;
表2加A尾混合液
试剂名称 | 1个样本 | 8个样本 | 48个样本 |
KAPA A-Tailing Buffer(10X) | 5μl | 40μl | 240μl |
KAPA A-Tailing Enzyme | 3μl | 24μl | 144μl |
总体积 | 8μl | 64μl | 384μl |
b.取42μl步骤(2)中纯化后的样本,加入8μl表2所示的混合液,总体积为50μl,用移液器吹打混匀;
c.在PCR仪上运行如下程序:
30℃保持30min,
10℃静置。
(4)加A尾后纯化
a.样品管中加入KAPA PEG/NaCl SPRI Solution 90μl和步骤(3)中加A尾后的样本反应液,充分吹打混匀,室温静置5min;
b.将样品管置于磁力架上,待上清澄清后,吸弃上清;
c.保持样品管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇,室温孵育至少30sec,转动离心管以清洗磁珠,吸弃上清;
d.保持样品管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇,室温孵育至少30sec,转动离心管以清洗磁珠,吸弃上清;
e.将样品管瞬时离心,放置于磁力架上去掉残存的乙醇,室温晾干至磁珠表面无明亮反光后,从磁力架上取下样品管,加入32ul Nuclease-Free water重悬磁珠。
(5)加单分子标记接头
a.根据样本的数量,计算所需试剂用量,于标记好的离心管中加入如下表3所示的接头连接混合液和步骤(4)所得纯化后的样本(Beads with DNA),用移液器吹打混匀:
表3接头连接混合液
试剂名称 | 1个样本 |
单分子标记接头(由安徽通用生物合成) | 5μl |
5X KAPA Ligation Buffer | 10μl |
KAPA T4 DNA Ligase | 5μl |
Beads with DNA | 30μl |
总体积 | 18μl |
c.连接:20℃保持15min。
(6)加接头后磁珠纯化
(7)文库扩增
a.室温解冻2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix,于标记好的离心管中加入表4所示的文库扩增体系,用移液器吹打混匀;
表4文库扩增体系
b.取23μl步骤(6)中的纯化样本加入27μl表4所示的PCR扩增体系,总体积50μl,用移液器轻轻混匀,瞬时离心2s,在PCR仪上运行如下程序:98℃变性45s,8个循环(98℃变性45s,65℃退火30s,72℃延伸30s),72℃延伸1min,4℃冷却静置。
(8)文库鉴定
取2μl步骤(7)所得PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳,确定片段分布于250-500bp之间。
(9)文库纯化
a.加入Agencourt AMpure XP reagent 50μl于样品管中,样本管中盛装有步骤(7)中扩增后的文库样本,充分吹打混匀,室温静置5min。
b.瞬时离心样品管2s,置于磁力架上5min,吸弃上清。
c.保持样品管在磁力架上,加入200μl新鲜配制的80%乙醇,快速转动样品管以清洗磁珠,吸弃上清。
d.将样品管瞬时离心,放置于磁力架上去掉残存的乙醇,室温晾干至磁珠表面无明亮反光,加入22μl Nuclease free water,用移液器吹打混匀。室温静置2min,再次放置于磁力架上,取20μl上清于新的离心管。
e.取1μl样本使用QuantiFluorTM-ST(Promega)精确定量,得到样本文库,将样本文库保存至-20℃或进行下一步的杂交捕获。
3、文库目标区域杂交捕获、测序
3.1、根据步骤2中纯化后的文库样本浓度吸取总量为500ng的样本至新的1.5ml离心管,加入表5所示试剂,放入浓缩仪浓缩至完全干燥,如不立即进行下一步实验,可室温(15-25℃)放置过夜;
表5浓缩体系
3.2、杂交体系配制与文库的变性
(1)室温溶解xGen 2X Hybridization Buffer,根据文库样本数量,配制表6所示的杂交混合液,用移液器吹打混匀;
表6杂交混合液
试剂名称 | 1个反应体积 |
xGen 2X Hybridization Buffer | 8.5μL |
xGen Hybridization Buffer Enhancer | 2.7μL |
Nuclease-Free Water | 1.8μL |
总体积 | 13μL |
(2)向每管步骤1中浓缩完成后的样本加入13μl表6所示的杂交混合液,室温静置5min;
(3)用移液器吹打混匀样本并转移至low-bind 0.2ml PCR管,将样本放入PCR仪运行如下程序:
95℃保持10min,
65℃静置;
(4)当95℃运行结束时,保持样本在PCR仪上,立即加入4μl xGen Lockdown Probepool(IDT(Integrated DNA Technologies,Inc.)),用移液器吹打混匀,避免产生气泡,此时反应总体积为17μl。
(5)记录杂交开始时间,根据实验进度,选择4h或16h杂交时间。
3.3、配制洗涤缓冲液
(1)根据表7将xGen 2X Bead Wash Buffer、xGen 10X Wash Buffer I、xGen 10XWash Buffer II、xGen 10X Wash Buffer III、xGen 10X Stringent Wash Buffer配制成1X工作液,移液器吹打混匀;
表7工作液体系
(2)准备稀释好的1×Wash Buffer I和1×Stringent Wash Buffer,按表8条件存放,其它试剂于室温存放(保证65℃孵育时间不少于2h);
表8存放条件
(3)准备M-270磁珠
从4℃冰箱中取出M-270磁珠,确认磁珠已放置于室温30min,涡旋混匀使磁珠重悬浮;
①在1.7ml low-bind管中为每个样本准备100μl磁珠;
②将low-bind管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
③加入200μl 1X Bead Wash Buffer,涡旋混匀10sec,静置于磁力架上至管内液体澄清,吸弃上清;
④重复步骤③一次;
⑤加入100μl 1X Bead Wash Buffer,移液器吹打混匀。
⑥将100μl悬浮磁珠转移至新的0.2ml low-bind管,置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
3.4、捕获
(1)确认步骤3.2的杂交反应已满足4h,保持样本和磁珠在PCR仪上,将样品转至准备好的磁珠管内,移液器吹打混匀,避免产生气泡;
(2)65℃孵育45min,期间每隔12min将磁珠混匀(保持样本在PCR仪上),避免产生气泡。
3.5、洗涤
注意以下步骤需在65℃条件下快速操作:
(1)每个样本加入100μl 1X Wash Buffer I(65℃预热),快速混匀;
(2)将样品转移至一新的1.7ml管中(65℃预热),快速混匀;
(3)样品管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
(4)加入200μl 1X Stringent Wash Buffer(65℃预热),轻柔混匀,65℃水浴5min。样品管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
(5)重复步骤(4)一次;
(6)加入200μl常温1X Wash Buffer I,涡旋混匀2min。样品管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
(7)加入100μl常温1X Wash BufferⅡ,涡旋混匀1min。样品管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
(8)加入200μl常温1X Wash BufferⅢ,涡旋混匀30sec,样品管置于磁力架上,静置至管内液体澄清,吸弃上清;
(9)将样品管从磁力架上取下,加入20μl Nuclease-Free Water,移液器吹打混匀,确保所有磁珠处于悬浮状态并全部转至0.2ml PCR管。
3.6、PCR富集
(1)室温解冻2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix,配制表9所示的PCR扩增体系,快速混匀:
表9 PCR扩增体系
试剂名称 | 基因组文库 |
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25μL |
10uM P5/P7primer | 2μL |
总体积 | 27μL |
(2)每个样本(23uL)加入27μL PCR mix,总体积50μL,用移液器轻轻混匀,瞬时离心2s,在PCR仪上运行如下程序:98℃变性45s,12个循环(98℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s),72℃延伸1min,4℃冷却静置。
3.7、纯化
重悬浮Agencourt AMpure XP reagent,确认磁珠已放置室温30min,每个样本用70μl beads纯化,20μl洗脱。
3.8、文库定量
a.取1μl步骤3.7中纯化后的样品用Qubit Fluorometer 3.0定量;
b.取2μl PCR产物用于2%琼脂糖凝胶电泳,剩余样本于-20℃保存。
3.9、送测
样本数据量为10M Reads,插入片段选择178(测序平台为illumine X-Ten,或其他高通量测序平台)。
4.供体来源cfDNA(ddcfDNA)定量分析
4.1、对胎儿生物学父亲基因组DNA文库和患者cfDNA文库高通量测序后数据callSNP(samtool),提取5754个SNP位点信息,具体见下表10;
表10、SNP位点
4.2、对患者cfDNA文库和胎儿生物学父亲基因组DNA文库中的上表10中的5754个SNP位点进行基因分型,测序深度为50X时,即可获得基因分型;筛选出在孕妇和胎儿生物学父亲中均为纯合子且基因型一致的SNP位点,作为有效SNP位点;
4.3、根据步骤4.2中的有效SNP位点对患者cfDNA文库进行分析,检测cfDNA测序结果的有效位点处SNP分型与步骤4.2中有效SNP位点分型不一致的信号占cfDNA在有效位点处总测序信号的比例,即得到供体来源cfDNA(ddcfDNA)的浓度;
4.4、根据步骤4.3中计算得出的ddcfDNA浓度=供体来源cfDNA/样本总cfDNA,其中,样本总cfDNA包括了供体来源cfDNA,患者本身的cfDNA和胎儿来源的cfDNA,因此,需要对ddcfDNA浓度进行校正,消除胎儿来源cfDNA对ddcfDNA浓度的影响。校正后ddcfDNA浓度(adj_ddcfDNA)计算公式1如下:
公式1:adj_ddcfDNA =供体来源cfDNA总量/(供体来源cfDNA总量+母体来源cfDNA总量)。
校正模型如下:
在器官移植的孕妇血液中,设孕妇来源+胎儿来源+供体来源cfDNA总量是N,根据步骤4.3计算异源cfDNA的浓度是矫正前的供体来源cfDNA浓度(ddcfDNA),通过“Analysisof cell-free fetal DNA in 16,843pregnant women from a single center in Chinausing targeted sequencing approach”中公开的数据见下表11,获得对应孕周胎儿来源游离DNA的浓度(ffcfDNA),即可根据公式2算出母体来源cfDNA总量,公式2如下:
公式2:母体来源cfDNA总量=(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA)*N;
公式3:供体来源cfDNA总量=ddcfDNA*N;
将公式2和公式3代入公式1中,得出校正后ddcfDNA浓度(adj_ddcfDNA):
即adj_ddcfDNA=ddcfDNA/(ddcfDNA+(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA))。
表11、对应孕周胎儿来源游离DNA的浓度(ffcfDNA)
孕周 | ffcfDNA(%) | 孕周 | ffcfDNA(%) |
1 | 0.45% | 21 | 9.71% |
2 | 0.78% | 22 | 10.29% |
3 | 0.89% | 23 | 10.69% |
4 | 1.64% | 24 | 11.75% |
5 | 1.75% | 25 | 12.51% |
6 | 2.55% | 26 | 13.16% |
7 | 4.32% | 27 | 14.39% |
8 | 6.33% | 28 | 15.48% |
9 | 7.72% | 29 | 16.19% |
10 | 8.57% | 30 | 18.23% |
11 | 8.91% | 31 | 18.01% |
12 | 8.64% | 32 | 19.56% |
13 | 9.30% | 33 | 21.61% |
14 | 9.07% | 34 | 22.22% |
15 | 8.54% | 35 | 21.44% |
16 | 8.69% | 36 | 21.69% |
17 | 9.23% | 37 | 22.59% |
18 | 8.89% | 38 | 33.77% |
19 | 8.99% | 39 | 35.91% |
20 | 9.35% | 40 | 38.34% |
实验例孕妇供体来源cfDNA(ddcfDNA)浓度验证
已知孕周和病理的肾移植孕妇血液样本(3例),具体见下表。采用上述样本的血液样本按照实施例1进行实施,结果见下表。
表12
注:1、“+”表示病理诊断有排斥反应,“-”表示病理诊断无排斥反应。
2、ddcfDNA浓度>1%,提示有排斥反应。
由以上结果可知,在本发明实施例1-4对3个肾移植孕妇的血液样本进行检测结果中,校正后ddcfDNA浓度与病理诊断一致率为100%,而校正前ddcfDNA浓度与病理诊断一致率33.3%,说明通过本发明的方法,在对器官移植孕妇患者ddcfDNA检测评估排斥风险上,可以有效提高准确度高。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记如表10所示。
2.一种如权利要求1所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针,其特征在于,所述探针是基于所述的SNP分子标记设计的。
3.根据权利要求2所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针,其特征在于,每个SNP分子标记的探针包括上游探针和下游探针,所述上游探针为以SNP位点为起始向5’端方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的,所述下游探针为以SNP位点为起始向3’端方向延伸80bp的碱基序列为序列信息设计的。
4.一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的试剂盒或检测芯片,其特征在于,包括权利要求2或3所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针。
5.一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、获取待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA;
S2、文库构建,获得cfDNA文库和基因组DNA文库;
S3、使用权利要求2或3所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针对构建的文库进行目标区域捕获,扩增富集目标区域序列,测序;
S4、分别从cfDNA文库和基因组DNA文库的测序数据中提取所述SNP分子标记位点信息,进行基因分型,筛选cfDNA文库测序数据和基因组DNA文库测序数据中基因型相同且两者均为纯合子的SNP位点作为有效SNP位点;
S5、检测cfDNA文库中所述有效SNP位点处的基因分型,将所述有效SNP位点的基因分型与步骤S4中的有效SNP位点基因分型不一致的信号除以有效SNP位点处的总测序信号,所得到的比值为供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA;
S6、对供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA进行校正,校正计算公式如下:
adj_ddcfDNA=ddcfDNA/(ddcfDNA+(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA));
公式中ffcfDNA通过表11得到;
将步骤S5中得到的ddcfDNA代入所述校正计算公式中。
6.根据权利要求5所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的方法,其特征在于,所述待测样本为血液样本;
可选的,为外周血样本。
7.一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的装置,其特征在于,包括:
样本获取单元:用于获取待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA;
文库构建单元:用于对待测样本的cfDNA和胎儿生物学父亲的基因组DNA进行文库构建;
目标区域捕获和测序单元:使用权利要求2或3所述的检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的SNP分子标记的探针对构建的文库进行目标区域捕获,扩增富集目标区域序列,测序;
有效SNP位点提取单元:用于将cfDNA文库和基因组DNA文库的测序数据中提取所述SNP分子标记位点信息,进行基因分型,筛选cfDNA文库测序数据和基因组DNA文库测序数据中基因型相同且两者均为纯合子的SNP位点作为有效SNP位点;
供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA计算单元:用于检测cfDNA文库中所述有效SNP位点处的基因分型,将所述有效SNP位点的基因分型与有效SNP位点提取单元中的有效SNP位点基因分型不一致的信号除以有效SNP位点处的总测序信号,所得到的比值为供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA;
校正单元:对供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA进行校正,校正计算公式如下:
adj_ddcfDNA=ddcfDNA/(ddcfDNA+(1-ddcfDNA)*(1-ffcfDNA));
公式中ffcfDNA通过表11得到;
将供体来源cfDNA的浓度ddcfDNA计算单元中得到的ddcfDNA代入所述校正计算公式中,得到校正后的供体来源cfDNA的浓度adj_ddcfDNA。
8.根据权利要求7所述的一种检测妊娠器官移植患者供体cfDNA的装置,其特征在于,包括:
所述待测样本为血液样本;
可选的,为外周血样本。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024076469A1 (en) * | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Natera, Inc. | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients |
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2023
- 2023-02-07 CN CN202310096461.2A patent/CN116287197A/zh active Pending
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