CN116287084A - 一种酶转化合成脱氧胆酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，首先获得重组表达胆汁酸水解酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌胞高效表达胆汁酸水解酶后，将期应用于转化甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)或牛磺脱氧胆酸盐(taurodeoxycholate)，可分别将甘氨脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸盐转化为甘氨酸(glycine)或牛磺酸(taurine)和脱氧胆酸的混合物，通过进一步分离获得脱氧胆酸，具有反应时间短、转化率高和制备的产品纯度高的优势，具备工业化生产应用前景。

Description

一种酶转化合成脱氧胆酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。
背景技术
脱氧胆酸(Deoxycholic acid)是一种在第7位碳原子上缺失一个羟基的胆汁酸，是胆酸失去一个氧原子而得到的一种游离胆汁酸。脱氧胆酸在胆汁中主要以牛磺脱氧胆酸盐或甘氨脱氧胆酸的形式存在。脱氧胆酸的分子式C24H40O4，熔点176-178℃，易溶于乙醇，溶于丙酮、冰醋酸、碱金属氢氧化物和碱金属碳酸盐，稍溶于乙醚、氯仿，微溶于水、苯。
脱氧胆酸及脱氧胆酸盐(Deoxycholate)具有表面活性，作为化妆品和药剂中安全有效的乳化剂使用，同时具有抗真菌和抗炎作用，一般临床上也常用作利胆药。将脱氧胆酸做成针剂，注射到皮下脂肪组织时会导致脂肪细胞溶解。注射脱氧胆酸可以有效改善成人颏下脂肪相关的中度至重度凸度或饱满度的外观，这是目前唯一在美国和欧盟获准治疗下巴以下脂肪堆积的方法，所以脱氧胆酸通常多应用在医学美容领域。根据最新研究，经皮下注射的脱氧胆酸不会改变脂质如游离脂肪酸、总胆固醇或甘油三酯的组成，也不会影响脂肪因子例如白细胞介素-6或-15、载脂蛋白B、脂联素在人体内的临床检测水平。脱氧胆酸这种特殊的促进脂肪细胞溶解的功能和特有的安全性使其在国内和国外医学美容市场的需求量都很大。
目前脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的合成主要以化学合成为主。常用方法以牛胆水解液加入氢氧化钠和40％水溶液于80-90℃，搅拌后冷却至20℃，过滤，将滤液用50％硫酸在10℃调节至pH至1.5，收集沉淀用水洗至pH7-7.5。将滤得的沉淀在40℃以乙酸乙酯和苯1∶1的混合溶液中搅拌，过滤去，冷却，待溶液中析出晶体即为脱氧胆酸。CN114716497A公开了一种化学合成脱氧胆酸盐的方法，主要涉及一种制备脱氧胆酸盐中间产物的合成方法。CN106083969A公开了以9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮为起始底物，经消除反应、还原反应、witting反应等步骤制备获得脱氧胆酸及脱氧胆酸盐的方法。化学法合成过程涉及的步骤多、反应条件苛刻及催化剂要求较高。与化学合成法相比，酶转化或生物合成法发展迅速，其具有环境友好、过程无需高压催化剂等要求，污染小且产物得率高。
CN107099516A公开了一种通过重组胞外酶表达转化底物获得脱氧胆酸的方法，即通过分子进化获得活性和稳定性均提高的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体蛋白并通过异源表达获得这种重组突变体酶制剂。后将该重组突变体酶制剂应用在熊脱氧胆酸合成中，经过与固定化7α-羟基甾醇脱氢酶酶法耦联，可以直接催化廉价底物鹅脱氧胆酸的差向异构，连续转化制备熊脱氧胆酸。将酶法转化用于生产脱氧胆酸，具有反应条件温和、产率高、显著降低生产成本且具有操作简单易于放大等优势。
发明内容
本发明目的在于提供一种酶转化合成脱氧胆酸的方法。
本发明的技术路线为：
当以甘氨脱氧胆酸为底物时，反应如下：
Figure BDA0003966989890000021
当以牛磺脱氧胆酸盐为底物时，反应如下：
Figure BDA0003966989890000022
本发明的具体技术方案如下：
一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，包括如下步骤：
(1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ ID NO：01、02或03所示；
(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
(3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。
在本发明的一个优选实施方案中，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh-F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh-R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
进一步优选的，所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环。
在本发明的一个优选实施方案中，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：06所示的Bsh-F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh-R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
进一步优选的，所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共28个循环。
在本发明的一个优选实施方案中，所述酶促反应的pH为6-7，温度为30-37℃，转速为200rpm，时间为0.5-1h。
胆汁酸水解酶在酶转化合成脱氧胆酸中的应用，该胆汁酸水解酶来源于动物双歧杆菌、产气荚膜梭菌或肠乳杆菌。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ ID NO：01、02或03所示；
(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
(3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸
进一步优选的，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh-F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh-R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
进一步优选的，所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ D NO：06所示的Bsh-F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh-R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
本发明的有益效果是：本发明首先获得重组表达胆汁酸水解酶基因的质粒，通过重组大肠杆菌胞高效表达胆汁酸水解酶后，将期应用于转化甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)或牛磺脱氧胆酸盐(taurodeoxycholate)，可分别将甘氨脱氧胆酸或牛磺脱氧胆酸盐转化为甘氨酸(glycine)或牛磺酸(taurine)和脱氧胆酸的混合物，通过进一步分离获得脱氧胆酸，具有反应时间短、转化率高和制备的产品纯度高的优势，具备工业化生产应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中高效液相法检测脱氧胆酸结果图，其中，峰①为脱氧胆酸，保留时间15.6min。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
以下实施例中的胆汁酸水解酶还可替换为肠乳杆菌(Lactobacillusintestinalis)的胆汁酸水解酶(如SEQ ID NO：03所示)。
实施例1
1、构建胆汁酸水解酶的表达载体
根据动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的胆汁酸水解酶基因序列(SEQID NO：01)设计引物bsh-F/bsh-R(SEQ ID NO：04和05)，以动物双歧杆菌的基因组DNA序列为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶经过PCR扩增得到Ba-bsh基因。PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环。以pET28a质粒为模板，设计引物pET28a-F/pET28a-R(SEQ ID NO：08和09)，PCR扩增得到pET28a载体片段。PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共28个循环。
将扩增得到的Ba-bsh基因和pET28a载体片段按照浓度比3：1混合。然后利用Gibson Assembly无缝连接技术将两个片段依次连接构建重组质粒，具体方法为50℃水浴孵育30min，尽快冰上冷却；然后采用42℃热激法转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，过夜培养，挑取在含卡那霉素抗生素平板上生长的克隆，将克隆接种在3mL试管中30℃，220rpm摇床过夜，提取重组质粒测序验证。
2、胆汁酸水解酶的重组大肠杆菌表达
挑取含上述构建的重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落至含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的5ml LB试管中，37℃，200rpm振荡培养8h。取菌液按1％接种量接种于100mL的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.8。向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，25℃，100rpm培养4h。取1mL菌液12000rpm离心5min，收集菌体待用。加入1mL PBS洗涤并离心菌体，将上清吸干后加入160μLPBS重悬菌体，振荡混匀。
在冰上使用超声破碎仪进行超声破碎细胞，超声波输出功率为200W，超声2s间歇2s，超声时间共持续20min，获得超声波破碎液。
将超声破碎液离心，取上清，加入底物牛磺脱氧胆酸盐1g，37℃，pH7，200rpm转速下充分反应30min后，离心收集上清，高效液相色谱(HPLC)检测脱氧胆酸的含量。HPLC检测使用高效液相色谱仪(美国Waters公司E2695型)，配备PDA检测器以及SymmetryC18色谱柱(5μm 4.6×150mm)(美国Waters公司)。检测波长280nm，柱温25℃，HPLC的检测条件为：C18反相色谱柱进行分离检测，流动相为水(0.1％甲酸+10mmol/L乙酸铵)，甲醇(0.1％甲酸+10mmol/L乙酸铵)，梯度洗脱，流速0.1mL/min，检测时间45min。1g牛磺脱氧胆酸盐为底物经过转化，可以获得0.506g的脱氧胆酸(如图1所示)，摩尔转化率为55.72％。
实施例2
1、构建胆汁酸水解酶的表达载体
以产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的胆汁酸水解酶基因序列(SEQ IDNO：02)设计引物bsh-F1/bsh-R1(SEQ ID NO：06和07)，以产气荚膜梭菌的基因组DNA序列为模板，使用Q5高保真DNA聚合酶经过PCR扩增得到Cp-bsh基因。PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共25个循环。以pET28a质粒为模板，设计引物pET28a-F/pET28a-R(SEQ ID NO：08和09)，PCR扩增得到pET28a载体片段。PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共28个循环。
将扩增得到的Cp-bsh基因和pET28a载体片段按照浓度比3∶1混合。然后利用Gibson Assembly无缝连接技术将两个片段依次连接构建重组质粒，具体方法为50℃水浴孵育30min，尽快冰上冷却；然后采用42℃热激法转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，过夜培养，挑取在含卡那霉素抗生素平板上生长的克隆，将克隆接种在3mL试管中30℃，220rpm摇床过夜，提取质粒测序验证，所获得的重组质粒命名为pET-BSH。
2、胆汁酸水解酶的重组大肠杆菌表达
挑取含上述构建的重组质粒pET-BSH的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落至含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的5ml LB试管中，37℃，200rpm振荡培养8h。取菌液按1％接种量接种于100mL的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD600达到0.6-0.8。向培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，25℃，100rpm培养4h。取1mL菌液12000rpm离心5min，收集菌体待用。加入1mLPBS洗涤并离心菌体，将上清吸干后加入160μLPBS重悬菌体，振荡混匀。
在冰上使用超声破碎仪进行超声破碎细胞，超声波输出功率为200W，超声2s间歇2s，超声时间共持续20min，获得超声波破碎液。
将超声破碎液离心，取上清，加入底物甘氨脱氧胆酸1g，37℃，pH7，200rpm转速下充分反应30min后，离心收集上清，高效液相色谱(HPLC)检测脱氧胆酸的含量。
HPLC检测使用高效液相色谱仪(美国Waters公司E2695型)，配备PDA检测器以及SymmetryC18色谱柱(5μm 4.6×150mm)(美国Waters公司)。检测波长280nmm，柱温25℃，HPLC的检测条件为：C18反相色谱柱进行分离检测，流动相为水(0.1％甲酸+10mmol/L乙酸铵)，甲醇(0.1％甲酸+10mmol/L乙酸铵)，梯度洗脱，流速0.1mL/min，检测时间45min。
配制浓度分别为0.1g/L、0.5mg/L、1g/L、2g/L和3g/L的脱氧胆酸标准溶液，经过0.22μm有机滤膜过滤后用液相检测。采用外标绝对定量法，通过HPLC分析获得各浓度标准液对应的峰面积，并建立脱氧胆酸浓度与峰面积之间的关系曲线。经过HPLC检测，1g甘氨脱氧胆酸为底物经过转化，可以获得0.664g的脱氧胆酸，摩尔转化率为76.31％。
SEQ ID NO：01
Figure BDA0003966989890000061
SEQ ID NO：02
Figure BDA0003966989890000062
Figure BDA0003966989890000071
SEQ ID NO：03
Figure BDA0003966989890000072
SEQ ID NO：04
Figure BDA0003966989890000073
SEQ ID NO：05
Figure BDA0003966989890000074
SEQ ID NO：06
Figure BDA0003966989890000075
SEQ ID NO：07
Figure BDA0003966989890000076
SEQ ID NO：08
Figure BDA0003966989890000077
SEQ ID No：09
Figure BDA0003966989890000078
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ D NO：01、02或03所示；
(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
(3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。
2.如权利要求1所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：04所示的Bsh-F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh-R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
3.如权利要求2所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环。
4.如权利要求1所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ ID NO：06所示的Bsh-F1和如SEQ ID NO：07所示的Bsh-R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
5.如权利要求4所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述PCR的条件为：98℃预变性5min，98℃变性28s，56℃退火50s，72℃延伸2min，共28个循环。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的一种酶转化合成脱氧胆酸的方法，其特征在于：所述酶促反应的pH为6-7，温度为30-37℃，转速为200rpm，时间为0.5-1h。
7.胆汁酸水解酶在酶转化合成脱氧胆酸中的应用，其特征在于：该胆汁酸水解酶来源于动物双歧杆菌、产气荚膜梭菌或肠乳杆菌。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将胆汁酸水解酶的基因片段插入到pET28a载体中，获得表达质粒载体，该基因片段如SEQ ID NO：01、02或03所示；
(2)将上述表达质粒载体转化入大肠杆菌中，进行扩大培养、诱导表达、细胞破碎和离心取上清，获得重组胆汁酸水解酶；
(3)将上述重组胆汁酸水解酶和甘氨脱氧胆酸/牛磺脱氧胆酸盐混合进行酶促反应，再经纯化分离，获得脱氧胆酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQ IDNO：04所示的Bsh-F和如SEQ ID NO：05所示的Bsh-R，以动物双歧杆菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述胆汁酸水解酶的基因片段由如SEQDNO：06所示的Bsh-F1和如SEQ D NO：07所示的Bsh-R1，以产气荚膜梭菌的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得。
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