CN116286558A - 一种黄杆菌及其在农业上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄杆菌Flavobacterium F‑55，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26998，其对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种具有抑制作用。F‑55菌株可作为生防菌用于防治猕猴桃细菌性溃疡病。还有，F‑55菌株还具有促进植物生长的作用。

Description

一种黄杆菌及其在农业上的应用

技术领域

本发明属于微生物资源化利用领域，涉及一种微生物菌株及其生物活性，具体涉及一种黄杆菌及其在农业上的应用。

背景技术

由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa）引起的细菌性溃疡病是猕猴桃产业最严重的病害。猕猴桃细菌性溃疡病可危害猕猴桃的叶片、花器以及枝干等，导致叶斑、花腐，枝干溃疡坏死，严重时可导致树死园毁。

目前，猕猴桃细菌性溃疡病的防治主要以化学防治为主，辅助以田间管理，但是长期盲目过量施用化学农药（主要是铜制剂）已经造成耐药菌株的出现，致使土壤农药残留过高，生态环境破坏、人类健康隐患等问题日益严重。

近年来随着人们对于食品安全以及环境的重视，生物防治成为防治病害的主要策略。然而，目前可用于防治猕猴桃细菌性溃疡病的生防菌剂匮乏，尚未发现对猕猴桃细菌性溃疡病防效优良且市场化的生防菌剂。

发明内容

猕猴桃细菌性溃疡病（又称猕猴桃溃疡病）目前的防治高度依赖铜制剂等化学药剂，但长期大量使用化学药剂的健康和环境风险日益受到重视。再者，市场上生物药剂种类有限且防治效果不佳，已成为猕猴桃产业发展不容忽视的制约因素。因此，高效抑制丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa），实现猕猴桃溃疡病的有效防治是本发明亟待解决的技术问题。

土壤是筛选微生物并实现微生物资源化利用的主要来源，很多性能优良的生防菌株都是从土壤中分离获得的。本发明旨在探寻生防菌剂的新来源，从土壤中分离筛选出一株黄杆菌Flavobacterium F-55，首次报道其对猕猴桃细菌性溃疡病菌（Psa）具有显著的抑制作用，并预判其在农业生产中将具有重要的潜在应用价值。

黄杆菌Flavobacterium F-55是从猕猴桃根际土中分离纯化得到。本发明通过详细的生测试验验证了F-55菌体可抑制丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa）的生长，能够解决现有技术存在的问题。

为了更好地理解本发明的技术方案，本发明提供了所述黄杆菌FlavobacteriumF-55的保藏信息。

菌种名称：黄杆菌

拉丁名：Flavobacterium

菌株编号：F-55

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2023年03月31日

保藏编号：CGMCC No.26998

具体地，所述黄杆菌Flavobacterium F-55来源于陕西省咸阳市杨凌区刘黄堡村猕猴桃园的海沃德品种根际，有关该菌株的分离纯化参见本发明的具体实施例。黄杆菌F-55菌株生长繁殖快，适应能力强，可作为一种较好的生防资源进行挖掘。基于离体枝条和叶盘防治效果，本发明首次提出了黄杆菌F-55菌株在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用。本发明不仅发现了黄杆菌F-55菌株的生防潜力，还弥补了黄杆菌在猕猴桃病害防治的技术空白。

由平板对峙试验、离体枝条和叶盘防治效果试验获知，所述黄杆菌Flavobacterium F-55对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa）表现出良好的抑制活性。F-55菌株可作为生防菌用于防治猕猴桃细菌性溃疡病，并表现出较好的防治效果。

另一方面，所述黄杆菌Flavobacterium F-55菌株对植物具有生长作用。由此，本发明提出保护所述黄杆菌Flavobacterium F-55在植物促生长方面的用途。本领域技术人员可以结合现有技术，将所述黄杆菌Flavobacterium F-55及其发酵产物制备成适宜农业用的植物生长促进剂或植物生长调节组合物。

与现有技术相比，本发明“一种黄杆菌及其在农业上的应用”具有以下有益效果或优点：

1.本发明首次在猕猴桃根际土中分离鉴定得到一株黄杆菌Flavobacterium F-55。该菌株易于获得、培养简单、生长繁殖快，适应能力强，可以为后续研究提供材料基础。

2.由室内抑菌试验获知，该菌株的菌体可以有效地抑制猕猴桃细菌性溃疡病致病菌Psa的生长。由室内离体枝条和叶盘防效试验得出，黄杆菌F-55菌株对猕猴桃细菌性溃疡病具有优异的防治效果。

3.由室内盆栽实验得出，黄杆菌可以促进猕猴桃植株生长。

4.本发明所提供的Flavobacterium F-55可进一步开发成生防菌剂用于防治猕猴桃细菌性溃疡病，利于促进猕猴桃产业健康发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。

图1为本发明所述Flavobacterium F-55的菌落形态图。

图2为本发明所述Flavobacterium F-55的显微结构图。

图3为本发明所述Flavobacterium F-55对猕猴桃细菌性溃疡病菌Psa的抑制效果图。

图4为本发明所述Flavobacterium F-55的系统发育树。

图5为本发明所述Flavobacterium F-55对猕猴桃细菌性溃疡病的离体枝条室内防治效果图。CK表示空白对照；M228表示猕猴桃细菌性溃疡病致病菌；F-55表示Flavobacterium F-55菌株。

图6为本发明所述Flavobacterium F-55对猕猴桃细菌性溃疡病的离体叶盘防治效果图。CK表示空白对照；M228表示猕猴桃细菌性溃疡病致病菌；F-55表示FlavobacteriumF-55菌株。

图7为本发明所述Flavobacterium F-55促进猕猴桃生长效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供了黄杆菌Flavobacterium F-55的分离、纯化过程及鉴定结果。

土壤样品采集于陕西省咸阳市杨凌区刘黄堡村猕猴桃园的海沃德品种根际。取1g根际土样品放入灭菌后的250mL三角瓶中，加入99mL无菌水。在转速为200rpm/min的摇床上振荡10min，静置后得到悬浮液A。

在无菌条件下取1mL悬浮液A与99mL无菌水混匀得到悬浮液B。吸取50μL悬浮液B，在PDA平板上涂布，待长出单菌落后蘸取单菌落纯化培养。

本实施例所用PDA培养基的制备方法为：马铃薯200g去皮切块后煮沸15min，用4层纱布过滤获得马铃薯溶液，加入琼脂15g，葡萄糖20g，加单蒸水定容至1000mL。之后分装到250mL锥形瓶中，每瓶150mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌后培养基分装到培养皿中，制成PDA平板。不加琼脂则获得PDB培养基溶液。

菌种在PDA平板上的菌落形态见图1。由图1可知，菌落呈圆形、黄色、不透明、表面平整边缘整齐。经电子显微镜观察（图2），可见其显微形态呈杆状。

无菌条件下，将上述获得的多个菌株分别接种到PDB培养基中，28℃培养2天后获得菌株的菌液。分别离心后去掉上清培养基溶液，加入无菌水清洗菌体并离心，重复3次，之后将菌体分别用无菌双蒸水稀释至1×108 CFU/mL。猕猴桃溃疡病菌用LB培养基培养，方法同上，稀释至1×1010 CFU/mL。将上述获得的溃疡病菌溶液1mL分别加入到融化后晾至45℃的99mL PDA培养基中，分装到直径9cm的培养皿中。之后滴加10μL上述菌种溶液至直径0.6cm的无菌滤纸片上，分别将滤纸片放置于上述含有猕猴桃溃疡病菌的PDA平板正中。28℃培养3~5天后观察是否有“抑菌圈”，抑菌等级评定标准如下：

Ⅰ级：抑菌圈明显且透明；

Ⅱ级：抑菌圈可见；

Ⅲ级：抑菌圈不可见。

挑选抑菌效果最明显的菌株（图3），标记为F-55，可见平板上有明显的抑菌圈，抑菌等级为Ⅰ级。

基于16S rRNA基因测序对上述进行分类鉴定，16S rRNA基因PCR扩增引物为：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反应条件：98℃预变性5min，98℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行32个循环，72℃延伸3min。

将PCR扩增产物测序（上海生工生物科技有限公司），将所得序列与GENBANK中已有的16S rRNA基因序列进行BLAST对比分析，通过Cluster进行多重序列比对，采用MEGA软件中的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树，用iTOL在线网站进行进化树美化，系统发育树呈现见图4。

通过PCR扩增以及基因序列比对，该菌株与黄杆菌Flavobacteriumgyeongancense亲缘关系最近，故将其命名为黄杆菌Flavobacterium F-55。

实施例2

本实施例提供了黄杆菌Flavobacterium F-55通过离体枝条接种法对猕猴桃细菌性溃疡病的抑制情况。

采集猕猴桃品种红阳的健康植株1~2年生枝条，剪成20cm的小段，用自来水清洗后，再用含有0.6%有效氯的次氯酸钠水溶液表面消毒15min，最后用无菌水冲洗3次，晾干。将晾干枝条两端用熔融的石蜡密封，在枝条中间横向切破枝条韧皮部0.1cm形成伤口备用。

黄杆菌（Flavobacterium）F-55（制备方法同实施例1）20μL接种于猕猴桃枝条伤口，以无菌水接种为对照，干燥后接种浓度为1×108 CFU/mL猕猴桃细菌性溃疡病菌菌液。待菌液完全被伤口吸收后放入盛有少量水的托盘中，置于人工气候箱中，16℃培养20d，测量枝条的病斑长度。接种黄杆菌Flavobacterium F-55、未接种组和空白对照（无菌水）组的发病率见表1和图5。

表1，F-55对离体枝条Psa抑制情况

由表1和图5可知，黄杆菌（Flavobacterium）F-55菌株显著缩小了猕猴桃细菌性溃疡病菌引起的病斑。

实施例3

本实施例提供了黄杆菌Flavobacterium F-55通过叶盘法对猕猴桃细菌性溃疡病的抑制情况。

采集猕猴桃“红阳”的健康嫩叶，在含有0.6%有效氯的次氯酸钠水溶液中进行表面消毒6min，用无菌双蒸水清洗3次，每次30s。之后用打孔器避开叶片上的主叶脉取直径1cm的叶盘。将20片叶盘装入含有20mL无菌双蒸水的50mL离心管中。在离心管中共同接种黄杆菌Flavobacterium F-55和猕猴桃细菌性溃疡病菌（Psa），同时设置单独接种猕猴桃细菌性溃疡病菌（Psa）、空白对照（无菌水），接种浓度均为104 CFU/mL。封口膜封闭离心管口用无菌牙签扎若干孔，之后将离心管放入真空泵抽至叶背面浸湿即可。之后将叶盘平铺到含0.8%琼脂的水琼脂平板上，18℃培养3~5天用软件imageJ统计叶盘病斑面积。叶盘发病面积如表2和图6。

表2，F-55对离体叶盘Psa抑制情况

由表2和图6可知，接种黄杆菌Flavobacterium F-55菌株能够显著缩小溃疡病的发病面积。

实施例4

本实施例提供了黄杆菌Flavobacterium F-55对猕猴桃植株生长促进情况。

在长势相同猕猴桃幼苗的土壤中接种1×108 CFU/mL的黄杆菌菌液20mL，设置无菌水作为对照，于25℃培养1个月，评价猕猴桃植株生长情况，结果见表3和图7。

表3，F-55对猕猴桃苗生长促进情况

由表3和图7可知，向长势相同猕猴桃幼苗上施用黄杆菌Flavobacterium F-55发酵液，可以促进猕猴桃幼苗生长。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种黄杆菌Flavobacterium F-55，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26998，其对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种具有抑制作用，对植物具有促进生长的作用。

2.一种生防菌剂，其含有权利要求1所述黄杆菌Flavobacterium F-55。

3.权利要求1所述黄杆菌Flavobacterium F-55在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用。

4.权利要求2所述生防菌剂在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用。

5.权利要求1所述黄杆菌Flavobacterium F-55菌株在促进植物生长方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为猕猴桃。

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