CN116284465A - 一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 - Google Patents
一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116284465A CN116284465A CN202210940035.8A CN202210940035A CN116284465A CN 116284465 A CN116284465 A CN 116284465A CN 202210940035 A CN202210940035 A CN 202210940035A CN 116284465 A CN116284465 A CN 116284465A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- eucommia
- eucommia ulmoides
- solution
- phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 156
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 152
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 152
- 241000208689 Eucommia ulmoides Species 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 241000208688 Eucommia Species 0.000 claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 33
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000007267 depressive like behavior Effects 0.000 abstract description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 9
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 abstract description 6
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007529 anxiety like behavior Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 abstract description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 8
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 8
- 238000012048 forced swim test Methods 0.000 description 8
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000012346 open field test Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 4
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 238000003236 bicinchoninic acid assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000005493 Chloridazon (aka pyrazone) Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 206010012374 Depressed mood Diseases 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000010909 Monoamine Oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062431 Monoamine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000634205 Mus musculus Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010042458 Suicidal ideation Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037326 chronic stress Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000024714 major depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000013386 optimize process Methods 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 210000004515 ventral tegmental area Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/46—Eucommiaceae (Eucommia family), e.g. hardy rubber tree
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种杜仲多糖制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用。杜仲多糖提取和纯化方式为水浸提‑醇沉法和三相分离法，对影响提取率、回收率和蛋白质清除率的料液比、(NH4)2SO4质量浓度、pH值和提取液与叔丁醇体积比四个主要因素进行了单因素实验，以此获得高得率、高回收率和高纯度的多糖制备工艺。动物试验表明，杜仲多糖改善了慢性不可预知应激诱发的小鼠抑郁和焦虑样行为。与此同时，补充杜仲多糖增加模型小鼠脑内神经递质和脑源性神经营养因子的含量，说明杜仲多糖具有明显的抗抑郁活性。本发明对杜仲资源开发利用具有重要的实践意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及通过三相分离技术高效分离纯化杜仲活性多糖，及其在抗抑郁中的应用。
背景技术
抑郁症是一种由多因素相互作用危害人类身心健康的复杂的精神疾病，主要表现为情绪持续低落，思维迟钝，意志行为减少，严重者还伴有自杀倾向，严重影响患者的生活质量。抑郁症的治疗方式主要包括药物治疗、心理治疗和物理治疗等。然而，无论哪种治疗方式单用或联合使用，其治疗效果均不能覆盖所有患者。现有抗抑郁药物的开发机制大多基于“单胺假说”，认为单胺类神经递质浓度降低特别是5-羟色胺与重度抑郁症有关。这些药物包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、降解酶（单胺氧化酶）抑制剂及三环类药物，但用药后治疗效果不能持续, 作用谱窄，并且伴随着较强的毒副作用。因此, 开发新型高效低毒的抗抑郁药物尤为重要，尤其是天然抗抑郁药物成为当前该领域的研究热点。
多糖是由单糖连接而成的多聚物，来源广泛且细胞毒性较低，参与和介导细胞的各种生命现象及生理过程的调节，在多糖的研究中，最受研究者关注的就是中药多糖。在中草药复杂多样的活性物质基础中，中药多糖以其低毒安全和丰富的生物学活性成为当前治疗中枢神经系统疾病的热点。
杜仲是我国名贵的中药材之一，其味甘，性温和，有补肝益肾、强筋健骨、调理冲任、固经安胎的功效，是中医临床常用的补肾阳药物。现代医学研究证实，多糖是杜仲的主要活性成分之一，表现出强大的免疫调节功能（中国专利申请公开号：CN107501423A）、抗炎症（Sun P，Theranostics, 2022, 12(8):3637-3655）和抗氧化（JK Xu, ProcessBiochemistry, 2015）等多种生物活性。目前未见杜仲多糖在抗抑郁治疗方面的应用。
初步提取的杜仲粗多糖中通常含有大量蛋白质、色素和小分子物质。一般通过Sevag试剂法、三氟乙酸沉淀法和离子交换色谱法等传统纯化方法除去，但这些方法存在耗时长、能耗高、操作过程繁琐、多糖损失率高以及不符合绿色化学要求等问题。因此，寻求一种高效纯化杜仲活性多糖的绿色方法显得十分必要。三相分离法最早用于蛋白质及酶类的分离纯化，是一种简单，安全，有效的绿色技术。在近几年的研究中才被用到多糖的分离纯化当中，并取得了良好的效果。其原理是通过在粗提液中加入有机溶剂和无机盐充分反应后离心，使其形成三相，其中上相为有机层，主要是脂质，色素等极性较小的物质，中间相为蛋白质层，下相为水层，主要是糖类等极性成分。总体上，可实现脱蛋白、脱脂、脱色和分离多糖等多个步骤的一步完成。目前相关研究未见利用三相分离法联合 (NH4)2SO4沉淀杜仲皮中活性多糖高效分离纯化的报道。
本发明的主要目的是从杜仲皮中高效提取分离纯化杜仲多糖，通过热水浸提-醇沉法和三相分离法进行单因素实验对其提取分离纯化工艺进行优化，得到最优工艺条件组合，并对其抗抑郁症应用进行研究。克服了以往杜仲多糖得率低、纯度低和操作繁琐的不足，填补了杜仲多糖抗抑郁的研究数据。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种杜仲多糖的高效分离纯化方法。
所述的杜仲多糖，杜仲多糖是以杜仲皮为原料提取的多糖类活性成分。
优选地，所述杜仲多糖经热水浸提-醇沉法提取和三相分离法纯化制备而得，包括以下步骤：
（1）水提：取干燥的杜仲树皮，粉碎机粉碎，蒸馏水清洗两遍用以去除杂质，以1:5~1:30（g/mL）的料液比向杜仲粉加入蒸馏水浸泡24h，浸泡后进行煎煮，待液体煎至沸腾后改文火继续煎煮2h，冷却至室温后，取上清液进行过滤，残渣继续重复煎煮提取2次，合并三次煎煮后的滤液，旋转蒸发浓缩，得到浓缩液；
（2）醇沉：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，静置沉淀24h，离心收集沉淀，待风干后冷冻干燥, 将粗多糖重新溶于蒸馏水中得到杜仲粗多糖提取液；
（3）三相体系分离：向步骤（2）中得到的杜仲粗多糖提取液中加入15%~40%（W/V）%的 (NH4)2SO4，涡旋振荡仪震荡溶解1min，溶解后调节pH至3.0~8.0，以1:0.5~1:3.0体积比加入有机溶剂叔丁醇，快速混匀，将混合液放置到30℃条件下静置30min，为确保形成澄清的三个相，将混合物 2000 r/min 离心20 min，得到分离好的三相体系，上层相为叔丁醇、脂质和色素物质，中间相为蛋白质，下层相为 (NH4)2SO4和杜仲多糖，分别取出上层相和下层相溶液；
（4）(NH4)2SO4沉淀分离杜仲多糖：将步骤（3）中得到下层相溶液用40%的 (NH4)2SO4沉淀，离心分离，沉淀溶于水，透析，浓缩并冷冻干燥，得到纯化后的杜仲多糖；
（5）将步骤（3）中得到的上层叔丁醇相，减压蒸发，回收叔丁醇；
（6）将步骤（4）中离心分离后的 (NH4)2SO4溶液蒸发结晶，回收 (NH4)2SO4。
优选地，所述杜仲多糖提取和分离纯化的单因素优化的具体步骤：
料液比：1：20（g/mL），(NH4)2SO4的质量浓度为25％，pH值为6.0，提取液和叔丁醇的体积比为1：2.0。
杜仲多糖单因素提取和纯化工艺条件优化：在提取和分离纯化实验过程中，以杜仲多糖的提取率、纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白质清除率为指标，通过控制料液比、(NH4)2SO4质量浓度、pH值、提取液与叔丁醇体积比进行单因素实验，得到最优组合，获得杜仲多糖最高提取率、纯化回收率和蛋白质清除率。
料液比（g/mL）的选择：选择料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，其他条件固定不变，研究料液比对杜仲多糖的提取率的影响。
(NH4)2SO4质量浓度（W/V）%的选择：选择 (NH4)2SO4质量浓度为15%、20%、25%、30%、35%、40%，其他条件固定不变，研究 (NH4)2SO4质量浓度对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
pH值的选择：选择pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件固定不变，研究pH值对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
提取液与叔丁醇体积比（v/v）的选择：选择提取液与叔丁醇的体积比为：1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5、1:3.0，其他条件固定不变，研究提取液与叔丁醇的体积比对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
最终确定最优提取工艺条件：料液比：1：20（g/mL），(NH4)2SO4的质量浓度为25％，pH值为6.0，提取液和叔丁醇的体积比为1：2.0，多糖提取率为10.54%，多糖回收率66.6%，蛋白去除率93.27%。
本发明的另一目的，公开上述杜仲多糖在制备抗抑郁症药物中的应用。
有益效果:
相较于传统杜仲多糖提取和纯化工艺，采用本发明可以显著提高杜仲多糖的提取率、回收率和纯度。本发明使用三相分离的分离纯化方法，分离纯化过程不仅具有绿色、简单和安全的优点，还具有效率高、较大程度保留杜仲多糖生理活性等优势，为杜仲多糖新用途的开发提供技术和物质保障。本发明发现上述杜仲多糖可以显著缓解抑郁小鼠抑郁和焦虑样行为，增加脑部5-羟色胺、多巴胺和脑源性神经营养因子的含量，表明杜仲多糖治疗抑郁症有较好的潜力，即杜仲多糖具有较好的抗抑郁效果。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1为杜仲多糖提取和纯化的单因素实验：
图中，(A) 料液比对多糖提取率的影响；
(B) (NH4)2SO4质量浓度对杜仲多糖回收率与蛋白质清除率的影响；
(C) pH值对杜仲多糖回收率与蛋白质清除率的影响；
(D) 提取液与叔丁醇体积比对杜仲多糖回收率与蛋白质清除率的影响。
图2为糖类标准品和杜仲多糖的洗脱曲线。
图3为杜仲多糖的扫描电子显微镜图 (10000×和20000×)。
图4为杜仲多糖治疗慢性不可预知应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）诱导的抑郁模型小鼠技术路线和行为学检测：
图中，(A) 杜仲多糖治疗CUMS诱导的抑郁模型小鼠技术路线；
(B, C) 强迫游泳实验（Forced swim test, FST）和悬尾实验（Tail suspensiontest, TST）检测CUMS模型建立；
(D-G) FST，TST，高架十字迷宫实验（Elevated plus-maze test, EPM）和旷场实验（Open field test, OFT）检测杜仲多糖对CUMS诱导的模型小鼠抑郁样行为的改善作用。
图5为杜仲多糖增加CUMS诱导的抑郁模型小鼠脑内神经递质含量：
图中，(A) 杜仲多糖增加CUMS诱导的抑郁模型小鼠脑内酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase，TH）阳性细胞密度（间接反映多巴胺含量）；
(B) 杜仲多糖增加CUMS诱导的抑郁模型小鼠脑内5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量。
图6为杜仲多糖增加CUMS诱导的抑郁模型小鼠脑内脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白含量。
图7为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 测定杜仲多糖含量和蛋白质含量
1. 测定杜仲多糖含量
采用苯酚硫酸法测定杜仲多糖含量。本实验以100μg/mL葡萄糖为标准液，将0mL、1mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL葡萄糖溶液和10mL（1mg/mL）的杜仲多糖分别移入10mL和50mL容量瓶中，分别加入5%的苯酚溶液5mL，浓硫酸10mL，充分混合后，摇匀。将上述溶液置于沸水中显色15min。溶液冷却后，进行紫外可见吸收光谱分析，得出质量-吸光度的线性曲线。根据线性曲线和吸光度测得多糖含量。
多糖的提取率公式为：
式中，N为杜仲多糖提取率（%）；M1为粗提液中多糖质量（g）；M2为杜仲质量（g）。
多糖纯化后回收率公式为：
式中，Z为纯化后杜仲多糖回收率（%）；b1为纯化后多糖含量（g）；b2为粗提液中多糖含量（g）。
2. 测定杜仲多糖中蛋白质含量
采用BCA (Bicinchoninic Acid Assay) 法检测杜仲多糖样品中蛋白质的含量。
多糖中蛋白质的清除率公式为：
式中，W为纯化后蛋白质清除率（%）；Y1为纯化后蛋白质含量（g）；Y2为粗提液中蛋白质含量（g）。
实施例2 杜仲多糖提取和纯化的单因素实验设计
1. 料液比（g/mL）的选择：选择料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，其他条件固定不变，研究料液比对杜仲多糖的提取率的影响。
从图1A中可以观察到，随着料液比的变化，杜仲多糖在粗提液中提取率的趋势。当料液比从1:5增加到1:20时，杜仲多糖的提取率逐渐增加，由7.25%增加至10.54%。而当料液比从1:20增加到1:30时，多糖提取率逐渐下降。因此，应选择料液比1:20提取杜仲多糖。
2. (NH4)2SO4质量浓度（W/V）%的选择：选择 (NH4)2SO4质量浓度为15%、20%、25%、30%、35%、40%，其他条件固定不变，研究 (NH4)2SO4质量浓度对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
从图1B中可以观察到，当 (NH4)2SO4质量浓度由15%增加到40%时，纯化后的杜仲多糖的回收率和蛋白质清除率都呈现增加后减少的趋势，当 (NH4)2SO4质量浓度由25%增加至30%时，多糖的回收率略微下降，但是蛋白质的清除率明显下降。因此，选用质量浓度为25%的 (NH4)2SO4纯化多糖效果最佳。
3. pH值的选择：选择pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件固定不变，研究pH值对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
如图1C所示，当pH值由3.0上升至6.0时，杜仲多糖回收率也从44.56%增至64.63%。而pH值继续由6.0增加至8.0时，多糖回收率呈下降趋势。同样，在pH值上升的过程中，蛋白质清除率呈现出先增加后减少的趋势。因此，纯化杜仲多糖时，将反应体系pH值调至6.0最为合适。
4. 提取液与叔丁醇体积比（v/v）的选择：选择提取与叔丁醇的体积比为：1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0、1:2.5、1:3.0，其他条件固定不变，研究提取液与叔丁醇的体积比对纯化后杜仲多糖的回收率和蛋白清除率的影响。
由图1D可知，在1:0.5~1:3.0内，杜仲多糖回收率与蛋白质清除率基本上都有增加至某一值后又开始减少的趋势。当提取液与叔丁醇体积比达到1:2.0时，多糖回收率达到最大值64.83%，蛋白质清除率为91.5%。而体积比在1:1.5时，蛋白质清除率达到最大值93.35%，多糖回收率为61.68%。所以在1:1.5~1:2.0内，杜仲多糖回收率与蛋白质清除率结果较优。因此，选择提取液与叔丁醇体积比1:2.0纯化效果最好。
实施例3 杜仲多糖的制备
取干燥杜仲树皮100g，粉碎机粉碎，加入2000mL蒸馏水浸泡24h，煎至沸腾后改文火煎煮2h，上清液过滤，连续重复3次，合并3次滤液，旋转蒸发以进行浓缩。向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，静置沉淀24h，离心收集沉淀，待风干后冷冻干燥后，将粗多糖重新溶于蒸馏水中得到杜仲粗多糖提取液。
取1000mL杜仲粗多糖液，加入250g (NH4)2SO4，在涡旋振荡仪震荡溶解1min，溶解后调节pH至6.0。向提取液中加入2000mL叔丁醇，混匀后放置到30℃条件下静置30min，2000r/min 离心20 min，得到分离好的三相体系，收集下层相1000mL溶液，加入150g(NH4)2SO4，使溶液中(NH4)2SO4质量浓度为40％，离心分离后，将沉淀溶于蒸馏水，透析，浓缩并冷冻干燥，得到纯化的杜仲多糖。
实施例4
1. 杜仲多糖的理化性质的测定
1.1 采用凝胶渗透色谱法对杜仲多糖进行分子量检测：
上样前，多糖样品和标准样品的浓度分别控制在2%和0.5%（W/V）左右。上样品时，每次进样20μL；流速为0.6 ml/min；温度控制在27~30℃。
1.2 采用高效液相色谱-PMP衍生化对杜仲多糖进行单糖检测：
将8mg的样品与2mL的三氟乙酸共同放到一个密封的管子中，120℃水解2h，冷却并蒸干，蒸干后的样品用2mL的甲醇重新溶解。再次蒸干，用2mL的蒸馏水溶解，过0.22μm滤膜后，待衍生。经处理的样品和单糖标准品（甘露糖、核糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖）用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP）进行衍生处理。使用Diamonsil-plus C18-A柱（4.6 × 250mm），以50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）和乙腈/水（84:16; v/v）为流动相，以1.0 mLmin-1流速进一步测定处理好的样品。
1.3 采用扫描电子显微镜观察杜仲多糖的微观形貌：
应用扫描电子显微镜放大10000~20000倍，观察所制备的杜仲多糖的形态。
2. 实验结果
结果表明，杜仲多糖包含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖（图2A，B），含量分别是1.13%, 2.18%, 3.15%, 82.70%, 0.79%, 2.02% 和1.99%（w/w），在10000倍放大的显微镜下观察到杜仲多糖呈明显的碎片形式，在放大20000倍的显微镜下，多糖表面呈现出粗糙形态（图3）。
实施例5 杜仲多糖抗抑郁作用
1. 动物实验设计
将购自西安交通大学实验动物中心的55只成年雄性ICR小鼠饲养在西北农林科技大学神经生物学实验室动物房，饲养条件为12h光照/12h周期，相对湿度为55-65%，恒温为23±2℃。如图4A，经过一周的适应后，将小鼠随机分为两组，分别是对照组（n=15）和模型组（n=40）。持续4周对模型组小鼠施予7种不同的慢性应激源。造模结束后，通过行为学强迫游泳实验（Forced swim test, FST）和悬尾实验（Tail suspension test, TST）筛选出对CUMS敏感的小鼠。随后，将筛选出的小鼠随机分为以下两组：模型组（Chronicunpredictable mild stress，CUMS，n=11）和杜仲多糖组（Eucommiae cortexpolysaccharides，EPs， n=11）。杜仲多糖组膳食补充杜仲多糖（400mg/kg）2周，对照组和模型组小鼠继续使用标准饮食。在第6周进行TST、FST、高架十字迷宫实验（Elevated plus-maze test, EPM）和旷场实验（Open field test, OFT）。实验结束后，用0.56% (v/v) 戊巴比妥钠 (10mg/ml) 麻醉小鼠，并进行眼球摘除，使用液氮快速收集小鼠脑组织，置于-80℃条件下保存。其他生物样本灌注固定后用于后续实验。
2. 实验方法
2.1 慢性轻度不可预见性应激源（7种）具体操作：冰浴（0℃冰水混合物，5min）；悬尾（15min）；夹尾（5min）；潮湿垫料（24h）；电压刺激（32V，10min）；强迫游泳（24℃，15min）；束缚（30min）。
2.2 行为学测试
TST和FST的不动时间被用来评估小鼠抑郁症样行为。在TST中，将小鼠的尾巴用夹子夹住，单独悬挂在一个木制的围栏里（45cm×35cm×30cm），并记录在4min内的不动时间。在FST中，小鼠被单独放置在一个15cm深的透明水缸中。测试时间为6min，记录后4min内小鼠不动时间。EPM和OFT通常被用于评估小鼠的焦虑样行为。在EPM中，高架十字迷宫是由4个50cm长的臂组成，两个臂是没有阻挡的开放臂，两个臂是有左右围挡的闭合臂，迷宫被放置在离地面70cm的地方。小鼠被放置在中心区域（6cm×6cm），允许其自由探索5min，并记录其在开放臂和闭合臂上花费的总时间。在OFT中，小鼠被放置在一个由黑盒子（75cm×75cm×60cm）组成的开放场地的中心，记录小鼠在15min内活动距离和轨迹。
2.3 免疫荧光
将小鼠冠状脑切片（50μm）放在0.1M PB（pH 7.4）缓冲液中冲洗三次，然后置于含0.3% Triton X-100、2%牛血清白蛋白和1%山羊血清的封闭液中室温封闭2h，封闭后，加入一抗（rabbit anti-TH，1：1000）（酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是多巴胺合成的限速酶）4℃孵育过夜，0.1M PB冲洗三次，然后在室温下与荧光基团结合的二抗孵育3h，0.1M PB冲洗三次后，用防荧光淬灭剂Dako进行封片，共聚焦激光扫描显微镜采集图像。在采集到图像后，对显微镜图片中海马齿状回内的TH阳性细胞（TH+细胞）进行计数，用以评估多巴胺含量。
2.4 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
按照小鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）/脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）酶联免疫检测试剂盒的说明书方法（竞争法）进行实验。使用前先将试剂盒在室温下平衡半小时，在标准品孔和样品孔中分别加入50μL稀释好的标准品和血清样品，然后分别加入50μL辣根过氧化物酶试剂，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。孵育后，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。洗涤后，每孔先后分别加入50μL显色剂A 和显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。显色结束后，每孔加50μL终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）。在450nm波长处依序测量各孔的吸光度（OD值）（测定在加终止液后10分钟以内进行）。使用ELISAcal软件绘制标准曲线，批量计算5-HT和BDNF浓度。
2.5 统计学方法
实验数据使用SPSS 25.0软件统计分析，用平均值±标准误差值表示；对于两组间比较采用非配对的双尾t检验。对于多重比较采用单因素方差分析结合Dunnet’s事后分析；P<0.05被认为具有统计学显著差异性。
3. 实验结果
3.1 杜仲多糖对CUMS小鼠抑郁样行为的改善作用
为了检测小鼠抑郁症样行为的发展，我们在第4周测试了CUMS模型小鼠的行为表型，如图4A所示，与对照组相比，CUMS小鼠的不动时间明显增加（图4B, C），说明经CUMS诱导后，模型组小鼠表现出抑郁样行为。而在膳食补充杜仲多糖两周后，我们发现杜仲多糖减轻了CUMS诱导的抑郁样行为，主要表现在悬尾和强迫游泳的不动时间明显减少（图4D, E）。此外，如图4F, G所示，与模型组相比，在OFT实验中，杜仲多糖组小鼠进入中间区域时间增加，表现出更强的探索性。在EPM实验中，杜仲多糖组小鼠在开放臂探索时间也有增加的趋势。这些结果表明，在补充杜仲多糖后，经慢性应激的小鼠处于绝望状态的时间显著减少，对开放空间以及高空环境的探索欲望显著增加，行为学表现恢复到正常水平，即小鼠抑郁和焦虑样行为得到明显改善。
3.2 杜仲多糖增加CUMS小鼠脑中与抑郁有关的神经递质的含量
多巴胺和5-HT是抑郁症发病机制中起关键作用的神经递质。腹侧被盖区（ventraltegmental area, VTA）在动机和奖赏处理中具有核心作用。VTA区多巴胺能神经元的功能障碍与几种常发的神经精神疾病有关，包括成瘾和抑郁症。TH是多巴胺生物合成的限速酶，可间接反映多巴胺的含量。与上述抑郁和焦虑样行为的改善相一致，与模型组相比，补充杜仲多糖的CUMS小鼠脑内VTA区多巴胺细胞的密度显著增加（图5A）。此外，ELISA结果显示，5-HT在CUMS小鼠海马中明显减少，而补充杜仲多糖后，海马中5-HT的含量明显升高（图5B）。这说明杜仲多糖可明显增加抑郁小鼠脑内神经递质含量。
3.3 杜仲多糖增加CUMS小鼠神经营养因子的蛋白含量
BDNF在哺乳动物的大脑中广泛表达，参与大脑发育、学习记忆和神经发生等过程，被证明在抑郁症的病理生理学中起重要作用。由图6所示，与对照组相比，CUMS小鼠海马BDNF蛋白含量显著降低，补充杜仲多糖后亦逆转上述异常。
综上所述，本发明的关于杜仲多糖提取和分离纯化的优化工艺条件具有提取率高，回收率高，纯度高和绿色简便等特点，同时也具有较好的抗抑郁功效。本发明对杜仲资源的开发利用具有重要的实践意义和应用价值。
在最后，我们需要强调，上述的实施例的描述目的是阐明该发明的技术路线而并不是限定对发明的保护范围。从事该领域的相关科研人员及技术人员，在按照上面所描述的方法和技术概念的基础上，仍可以做出其他形式方面的变化和改动，受制于变化方式的多样，这里不再进行穷举式的描述。但是应当明确：凡是与该发明的设计准则及技术概念进行各样式的变化、修改、替换和变型，仍属于该发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）水提：取干燥的杜仲树皮，粉碎机粉碎，蒸馏水清洗用以去除杂质，以1:5~1:30（g/mL）料液比向杜仲粉中加入蒸馏水浸泡24h，浸泡后进行煎煮，待液体煎至沸腾后改文火继续煎煮2h，冷却后过滤上清液，残渣继续重复煎煮提取2次，合并三次煎煮后的滤液，旋转蒸发浓缩，得到浓缩液；
（2）醇沉：向步骤（1）得到的浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，静置沉淀24h，离心收集沉淀，待风干后冷冻干燥，将粗多糖重新溶于蒸馏水中得到杜仲粗多糖提取液；
（3）三相体系分离：向步骤（2）中得到的杜仲粗多糖提取液中加入质量浓度为15%~40%的 (NH4)2SO4溶液，涡旋振荡仪震荡溶解1min，溶解后调节pH至3.0~8.0，以1:0.5~1:3.0体积比加入有机溶剂叔丁醇，快速混匀，将混合液放置到30℃条件下静置30min，为确保形成澄清的三个相，将混合物 2000 r/min 离心20 min，得到分离好的三相体系，上层相为叔丁醇、脂质和色素物质，中间相为蛋白质，下层相为(NH4)2SO4和杜仲多糖，分别取出上层相和下层相溶液；
（4）(NH4)2SO4沉淀分离杜仲多糖：将步骤（3）中得到下层相溶液用40%的 (NH4)2SO4沉淀，离心分离，沉淀溶于水，透析，浓缩并冷冻干燥，得到纯化后的杜仲多糖；
（5）将步骤（3）中得到的上层叔丁醇相，减压蒸发，回收叔丁醇；
（6）将步骤（4）中离心分离后的 (NH4)2SO4溶液蒸发结晶，回收 (NH4)2SO4。
2.根据权利要求1所述的杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于，所述的杜仲多糖包含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，含量分别是1.13%, 2.18%, 3.15%, 82.70%, 0.79%, 2.02% 和1.99%（w/w），在放大10000倍的电子显微镜下，杜仲多糖呈明显的碎片形式，在放大20000倍的显微镜下，多糖表面呈现出粗糙形态。
3.根据权利要求1所述的杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于：步骤（1）中杜仲树皮粉末和蒸馏水料液比为1：20（g/mL）。
4.根据权利要求1所述的杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中向杜仲粗多糖提取液加入质量浓度为25％的 (NH4)2SO4。
5.根据权利要求1所述的杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中向杜仲粗多糖提取液加入(NH4)2SO4溶解后，调整pH值为6.0。
6.根据权利要求1所述的杜仲多糖的提取和分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中提取液和叔丁醇的体积比为1：2.0（v/v）。
7.根据权利要求1-2之一所述的杜仲多糖在制备抗抑郁药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210940035.8A CN116284465A (zh) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210940035.8A CN116284465A (zh) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116284465A true CN116284465A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86785648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210940035.8A Pending CN116284465A (zh) | 2022-08-05 | 2022-08-05 | 一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116284465A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101095716A (zh) * | 2007-07-05 | 2008-01-02 | 复旦大学 | 杜仲总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途 |
| CN110664863A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-01-10 | 黔南民族师范学院 | 一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法 |
| CN110885384A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-03-17 | 江苏大学 | 一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法 |
| CN111499771A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-08-07 | 东北农业大学 | 一种通过三相萃取技术同时提取米糠中的油脂、蛋白质和多糖的方法 |
| CN112314770A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-05 | 浙江省农业科学院 | 一种同时从绣球菌中制备多糖和蛋白的方法 |
-
2022
- 2022-08-05 CN CN202210940035.8A patent/CN116284465A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101095716A (zh) * | 2007-07-05 | 2008-01-02 | 复旦大学 | 杜仲总多糖在制备防治系统性红斑狼疮药物中的用途 |
| CN110885384A (zh) * | 2019-11-11 | 2020-03-17 | 江苏大学 | 一种从新鲜秋葵中高效分离活性多糖的方法 |
| CN110664863A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-01-10 | 黔南民族师范学院 | 一种基于杜仲叶活性物提取与分离于一体的三相分配方法 |
| CN111499771A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-08-07 | 东北农业大学 | 一种通过三相萃取技术同时提取米糠中的油脂、蛋白质和多糖的方法 |
| CN112314770A (zh) * | 2020-10-09 | 2021-02-05 | 浙江省农业科学院 | 一种同时从绣球菌中制备多糖和蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张涛涛: "大孔树脂纯化杜仲多糖工艺 及抗运动性疲劳研究", 化学工程师, no. 04, 25 April 2020 (2020-04-25), pages 84 - 88 * |
| 李卓妮: "杜仲水提物对慢性温和不可预知刺激致郁小鼠海马神经保护作用及机制研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技, 15 April 2022 (2022-04-15), pages 1 - 66 * |
| 辛晓明;张庆柱;王浩;冯蕾;: "杜仲总多糖的提取及其对环磷酰胺致肝损伤小鼠的保护作用", 中华中医药学刊, no. 09, 10 September 2007 (2007-09-10), pages 1896 - 1897 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108434231B (zh) | 一种抗醉解酒的药食同源中药组合物及其制备方法 | |
| AU2004200624B2 (en) | Medicinal preparation containing phenylethanoid glycosides extracted from herbaceous plant, cistanche tubulosa (schenk.) wight, process of making the same, and uses of the same | |
| CN112618614B (zh) | 一种具有抗抑郁症的刺梨活性提取物及应用 | |
| Lampe | Toxic fungi | |
| CN112843086B (zh) | 一种具有抗抑郁作用的多糖冻干粉及其制备方法和应用 | |
| CN111773273A (zh) | 粗壮女贞总黄酮、制备方法和应用 | |
| CN114177218A (zh) | 一种富含1-脱氧野尻霉素的桑叶提取物及其制备方法 | |
| JP3334725B2 (ja) | 体内アルコール、その代謝物の低下促進剤及び口中清涼剤 | |
| CN116284465A (zh) | 一种杜仲多糖的制备方法及其制备的杜仲多糖在抗抑郁中的应用 | |
| CN110664860B (zh) | 一种增强免疫力的组合物及其制备方法 | |
| CN114832006B (zh) | 人参皂苷Rh4在制备用于抑制睡眠的药物中的用途 | |
| CN1947736A (zh) | 一种灯盏细辛注射制剂的制备方法及其应用 | |
| CN114699424B (zh) | 脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖或/和改性的两性离子荚膜多糖的新应用 | |
| CN1188406C (zh) | 蒲黄提取物及其制备方法和用途 | |
| JPH05271063A (ja) | 活性酸素消去・除去剤 | |
| AU2021101429A4 (en) | Method for extracting flavonoids as active substances from honey | |
| CN110183522B (zh) | 一种具有抗抑郁功能的糖肽及其制备方法与应用 | |
| CN102526157B (zh) | 红花提取物在预防或治疗神经退行性疾病中的用途 | |
| CN112007092A (zh) | 一种解酒组合物及其制备方法 | |
| CN114377050A (zh) | 一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物 | |
| Takubo et al. | Effects of hop extracts on nasal rubbing and sneezing in BALB/c mice | |
| CN113354748A (zh) | 一种铁皮石斛叶多糖及其制备和应用 | |
| CN108403873A (zh) | 一种神经细胞损伤修复有效部位的提取纯化技术 | |
| CN108676834A (zh) | 一种大蒜抗肿瘤活性多肽 | |
| CN108720013A (zh) | 一组由果糖和茶叶提取物组成的醒酒护肝的保健食品的配方及生产工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |