CN116284446A - 一种靶向cd200嵌合型抗原受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种靶向CD200嵌合型抗原受体及应用，其中靶向CD200嵌合型抗原受体包括从N端到C端顺次拼接的信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8αhinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4‑1BB、和CD3ζ链；所述单链抗体ScFv特异性识别肿瘤细胞表面的CD200抗原。本发明的嵌合抗原受体在制备治疗急性髓系白血病药物中效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种靶向CD200嵌合型抗原受体及其应用。
背景技术
CAR-T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞，原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3-ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。CAR-T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。
尽管目前在CAR-T治疗肿瘤领域捷报不断，但是CAR-T细胞治疗肿瘤过程中仍然面临着肿瘤的高度异质性导致的脱靶以及靶点的单一性导致治疗等问题。其中肿瘤细胞的高度异质性直接导致了CAR-T疗法在治疗过程中的局限性，而靶点的单一性限制了治疗上的广谱性。因此，选择肿瘤细胞中特异性表达且在不同肿瘤中具有广谱性表达的膜表面标志物成为CAR-T治疗有效性至关重要的一步。
CD200(OX-2)是一种细胞表面糖蛋白，通过其受体CD200R抑制同种免疫和自身免疫反应，主要在包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)在内的许多恶性肿瘤以及癌症干细胞上高表达。治疗AML的主要障碍是清除白血病干细胞(LSCs)，这种具有长期自我更新能力的耐药细胞被认为是复发的来源。专利号为CN114728048A的发明专利公开了CD200受体拮抗剂结合分子可作为治疗实体肿瘤癌、液体肿瘤癌或神经内分泌肿瘤癌的药物。专利号为CN102906115A的发明专利公开抗CD200抗体可作为癌症治疗药物。上述两个专利并未公开以CD200为靶点的嵌合抗原受体可以作为治疗AML药物。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种可以治疗AML的药物以CD200为靶点的嵌合抗原受体。
本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种靶向CD200嵌合型抗原受体，该嵌合抗原受体包括从N端到C端顺次拼接的信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8αhinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB、和CD3ζ链；所述单链抗体ScFv特异性识别肿瘤细胞表面的CD200抗原。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在以上技术方案的基础上，优选的，胞内共刺激域4-1BB的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二，本发明提供了一种以CD200为靶点的嵌合抗原受体在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
第三，本发明提供了一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，以BRD-PTK-EF1α载体为骨架，插入嵌合抗原受体的编码核苷酸序列的慢病毒、逆转录病毒或转座子载体。
第四，本发明提供了一种重组嵌合型抗原受体的基因载体在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
第五，本发明提供了一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，由嵌合抗原受体的编码核苷酸序列或重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到；所述免疫细胞选自脐带血，外周血，IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞中的一种。
第六，本发明提供了一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：将分离得到的免疫细胞激活1天后再利用重组嵌合型抗原受体的基因载体感染免疫细胞从而获得表达嵌合型抗原受体的免疫细胞；对所述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行抗肿瘤活性检测，所选择的细胞系或临床病人样本细胞为细胞膜外高表达或中表达CD200蛋白。
第七，本发明提供了一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
本发明的一种靶向CD200嵌合型抗原受体及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明提供的CD200为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体ScFv，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面CD200阳性的肿瘤的治疗，对急性髓系白血病杀瘤效果显著。
(2)本发明还提供表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的制备方法，是将分离得到的免疫细胞激活2-15天后再感染表达嵌合抗原受体的慢病毒，这样，原有免疫细胞不会影响转染后的表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果，进一步地，表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行体外功能检测时，所选择的细胞系为细胞膜外高表达或中表达CD200靶点的细胞系，这样对表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果评价更为科学。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例中anti-CD200-CAR的DNA片段的示意图；
图2为实施例中BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR的质粒图谱示意图；
图3为Lenti3-anti-CD200-CAR转导293T细胞后CAR阳性细胞比例结果示意图；
图4为Lenti3-anti-CD200-CAR转导T细胞后CAR-T细胞转导效率结果示意图；
图5为MOLM-13、K562-CD200、K562细胞表面CD200表达情况检测结果示意图；
图6为CAR-T细胞对急性髓细胞白血病细胞系MOLM-13的体外杀伤结果示意图；
图7为CAR-T细胞对阴性细胞系K562和过表达细胞系K562-CD200的体外杀伤结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了靶向CD200嵌合型抗原受体CAR、重组嵌合型抗原受体的基因载体和表达嵌合型抗原受体的免疫细胞及其应用，具体如下：
一、嵌合型抗原受体CAR
如图1所示，本发明的嵌合型抗原受体CAR，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8 hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链；所述单链抗体ScFv能够识别肿瘤细胞表面的CD200抗原。
其中信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；strepII的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD8αhinge的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；胞内共刺激域4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；CD3ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
二、重组嵌合型抗原受体的基因载体
重组嵌合型抗原受体的基因载体的制备方法为：以病毒和非病毒表达载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或转座子载体；优选地，以病毒载体BRD-PTK-EF1α为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒载体。
1.BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR质粒的构建
1.1人工合成anti-CD200-CAR片段，其结构如示意图1所示。
1.2采用PCR扩增以anti-CD200-CAR片段为模版，获得带有BRD-PTK-EF1α载体经EcoR I和BamH I酶切后同源臂的相应片段。
其中，信号肽(SP)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，strepII的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，CD8αhinge的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD28TM的核苷酸序列如SEQ IDNO.10，CD28ICD的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
1.3将质粒BRD-PTK-EF1α使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于Eppendorf管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。
1.4将片段以1:2摩尔比加入Eppendorf管加入ExnaseⅡ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5小时；将连接液取出10μL加入100μLDH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL 2YT培养基37℃、220rpm培养2小时；2小时后将Eppendorf管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12小时；在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。
1.5用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR质粒；送北京擎科生物科技有限公司武汉分公司一代测序验证无误后，将含有BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR质粒的大肠杆菌DH5α菌株保种。BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR的完整图谱示意图如图2所示。
2.BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR慢病毒载体的制备与活滴检测
2.1慢病毒载体的制备
将测序正确，且含有BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR质粒的的大肠杆菌进行无内毒素大提，和三种慢病毒包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G)共同转染293T细胞，18-24小时后补液，48-72小时后收取上清。
分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，于30000g，4℃、离心2.5-3h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，100μL/支，做好标记后置于-80℃保存备用。
2.2慢病毒载体活性滴度检测
原理：anti-strepII抗体上标记有荧光素，而anti-strepII抗体能与CAR中strepII特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反映了CAR在293T细胞中的表达情况。
方法：在6孔板中接入5.0×105个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO2培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，如图3所示，并换算得到BRD-PTK-EF1α-anti-CD200-CAR慢病毒浓缩液活性滴度为2.01×108TU/mL，可用于后续的嵌合抗原受体免疫细胞的制备。
计算公式为：活性滴度(TU/mL)＝(5.0×105×阳性细胞比例×1000)/病毒添加量。
三、嵌合型抗原受体的免疫细胞
嵌合型抗原受体的免疫细胞的制备方法为：由上述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或上述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到嵌合型抗原受体的免疫细胞，免疫细胞选自脐带血、外周血或IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞，优选为外周血来源的T细胞，即得到以CD200为靶点治疗广谱性肿瘤的CAR-T细胞，当所述嵌合型抗原受体CAR的单链抗体ScFv结合CD200时，所述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞表现出抗肿瘤活性。
3.1anti-CD200-CART细胞的制备
3.1.1CAR-T细胞制剂制备：
采集健康供试者外周血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3 MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizerTM CTSTM T-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizerTMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每106个细胞加入25ul Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。
24小时后，按MOI＝5加入Lenti3-anti-CD200-CAR慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。
慢病毒转导24小时后将转导后的细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计算得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。
3.1.2anti-CD200-CART细胞转导效率检测
取1.0×106个转导后T细胞，与anti-strepII抗体室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测anti-strepII-APC荧光信号，测量APC阳性细胞比率。
结果如图4所示，图4反映了anti-CD200-CART细胞在总细胞中的比率，anti-CD200-CART细胞转导效率为29.1％。
4.anti-CD200-CAR-T细胞的体外杀伤功能检测
采用钙黄绿素检测法分别对T、anti-CD200-CAR T细胞进行体外杀瘤功能检测。
靶细胞选择高表达CD200的急性髓细胞白血病细胞系MOLM-13和过表达CD200的K562细胞，实验组阴性靶细胞为K562，这三种细胞表达CD200的情况如图5所示。
由图5可知，高表达CD200的急性髓细胞白血病细胞系MOLM-13和过表达CD200的K562细胞的体外杀伤力较高。
取适量的靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×105/mL，96孔板中每孔加入0.5×105/mL个细胞，按25:1、5：1、1：1的效靶比分别加入T、anti-CD200-CART细胞，37℃孵育2.5～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。
anti-CD200-CAR T细胞对CD200高表达急性髓细胞白血病细胞系MOLM-13的体外杀伤裂解结果如图6所示，对CD200不表达的K562和CD200过表达细胞系K562-CD200的体外杀伤裂解结果如图7所示。
结果显示，anti-CD200-CAR T细胞对CD200阳性细胞系的裂解能力与T细胞相比均有提高，但是对阴性细胞系K562无裂解能力，说明其特异性识别CD200，预示着其对急性髓细胞白血病有很好的治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向CD200嵌合型抗原受体，其特征在于：该嵌合抗原受体包括从N端到C端顺次拼接的信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8αhinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB、和CD3ζ链；所述单链抗体ScFv特异性识别肿瘤细胞表面的CD200抗原。
2.如权利要求1所述的一种靶向CD200嵌合型抗原受体，其特征在于：所述单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的一种靶向CD200嵌合型抗原受体，其特征在于：所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的一种靶向CD200嵌合型抗原受体，其特征在于：所述胞内共刺激域4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种靶向CD200嵌合型抗原受体在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
6.一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，其特征在于：以BRD-PTK-EF1α载体为骨架，插入权利要求1-4任一项所述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列的慢病毒、逆转录病毒或转座子载体。
7.如权利要求6所述的一种重组嵌合型抗原受体的基因载体在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
8.一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于：由权利要求1-4任一项所述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或权利要求5所述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到；所述免疫细胞选自脐带血，外周血，IPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞中的一种。
9.如权利要求8所述的一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将分离得到的免疫细胞激活1天后再利用权利要求6所述的重组嵌合型抗原受体的基因载体感染免疫细胞从而获得表达嵌合型抗原受体的免疫细胞；对所述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行抗肿瘤活性检测，所选择的细胞系或临床病人样本细胞为细胞膜外高表达或中表达CD200蛋白。
10.如权利要求8所述的一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
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