CN116284145A - 一种光释放钌配合物制备及其抗耐药肿瘤的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药化学技术领域，涉及光化疗医药领域，具体涉及一种光释放钌配合物制备及其抗耐药肿瘤的应用。本发明公开了一种新型的光释放钌配合物(具有以下的结构式)，该配合物在光照条件下其可以释放配体并形成内过氧化合物暴露出金属中心，对人非小细胞肺癌耐药细胞株具有较强的光化疗效果，且在光照条件下对人非小细胞肺癌耐药细胞具有很强的生长增殖抑制能力。对于研究新型的光释放钌配合物抗耐药肿瘤具有重要的意义，为临床开发光化疗抗耐药肿瘤药物或抗肿瘤金属光敏剂提供一条新思路。

Description

一种光释放钌配合物制备及其抗耐药肿瘤的应用

技术领域

本发明属于医药化学技术领域，涉及光化疗医药领域，具体涉及一种光释放钌配合物制备及其抗耐药肿瘤的应用。

背景技术

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。据统计，美国每年死于肺癌的人数比死于结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的人数加起来还要多，5年肺癌生存率仅为18.4。其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的非小细胞肺癌患者发现时已处于中晚期。因此，非小细胞肺癌药物的开发一直以来都是研究的热点。

药物治疗是癌症患者最重要的治疗方法之一。随着药物的使用，肿瘤细胞获得了抵抗药物作用的能力。然而，几乎所有的药物在治疗过程中都无法避免耐药的产生。近年来，靶向药物的应用取得了良好的治疗效果。其中分子靶向药物主要针对肿瘤异常信号通路，具有高选择性、低毒性、高治疗指数等特点，已成为新型抗肿瘤药物开发的主要方向。然而，耐药性问题在很大程度上限制了其临床应用的潜力。

光动力疗法(PDT)是一种无/微创的癌症治疗方法，由于具有高选择性、毒副作用小、耐药性低等优点而在肿瘤治疗领域备受关注。光动力疗法的原理是在激光照射下利用光敏剂(PSs)产生活性氧(ROS)，进而通过抑制肿瘤细胞的生长增殖而致使其死亡。但许多具有侵袭性和耐药性的癌症都具有缺氧的特点，肿瘤缺氧严重限制着PDT的应用。目前出现了一种替代性的光动力治疗手段，即光化疗，其可以通过自限性的不依赖氧的光化学计量反应产生活性中间体以及产物，最终在缺氧下诱导肿瘤细胞死亡。其经典机制就是通过金属中心激发三重态进行光取代反应。因此，提供一种新型光释放钌配合物具有重要的应用前景。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种新型光释放钌配合物。

本发明的第二个目的是提供上述光释放钌配合物的制备方法。本发明采用铃木偶联反应制备得到光释放钌配合物。

本发明的第三个目的是提供上述光释放钌配合物的应用。该配合物对人非小细胞肺癌耐药细胞株具有较强的光化疗效果，可用于制备光化疗抗耐药肿瘤药物或抗耐药肿瘤金属光敏剂。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种光释放钌配合物，所述光释放钌配合物的结构如下所示：

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

第一个发明目的所述的光释放钌配合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、在惰性气体保护下将9-蒽硼酸、5-溴-2，2′-联吡啶四(三苯基膦)钯和无水碳酸钾溶于有机溶剂中，通过加热回流反应后经萃取、纯化制得bpy-en配体；

S2、在惰性气体保护下将氯化钌(Ⅲ)水合物、氯化锂和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉溶于有机溶剂中，通过回流反应后经富集沉淀和沉淀洗涤后制得Ru(dmp)₂Cl₂前体；

S3、将前体Ru(dmp)₂Cl₂和tpy-en配体溶于有机溶剂中，通过加热反应后再加入六氟磷酸铵饱和水溶液，经搅拌反应后即得光释放钌配合物。

优选地，步骤S1中，所述9-蒽硼酸、5-溴-2，2′-联吡啶和无水碳酸钾的摩尔比为1:1:3，所述四(三苯基膦)钯的用量为3mol％。

优选地，步骤S1中，所述加热回流反应为100～115℃加热回流反应8～15h。更优选地，所述加热回流反应为115℃加热回流反应12h。

优选地，步骤S2中，所述回流反应的时间为8～15h。更优选地，所述回流反应的时间为12h。

优选地，步骤S2中，所述氯化钌(Ⅲ)水合物、氯化锂和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉(2,9-dmp)的摩尔比为3:8.9:6。

优选地，步骤S3中，所述tpy-en配体与RuCl₂(2,9-dmp)₂前体的摩尔比为1:1。

优选地，步骤S3中，所述加热反应为80～85℃加热反应8～15h。更优选地，所述加热反应为80℃反应12h。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：

第一个发明目的所述的光释放钌配合物在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

优选地，所述抗耐药肿瘤药物为抗非小细胞肺癌耐药的药物。更优选地，所述抗耐药肿瘤药物为抗非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药的药物。

经研究发现，本发明提供的钌配合物对人非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药细胞(A549/5-FU细胞)具有较强的光化疗效果，在光照条件下对人非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药细胞具有很强的生长增殖抑制能力(IC₅₀为0.66mM)，在黑暗条件下其IC₅₀为67.17，PI高达102，有望应用于制备光化疗抗耐药肿瘤药物或抗肿瘤金属光敏剂。

本发明还提供了一种光化疗抗耐药肿瘤药物或抗肿瘤金属光敏剂，该药物或光敏剂以第一个发明目的所述的光释放钌配合物为主要活性成分。

优选地，所述药物或光敏剂还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即所述药物或光敏剂以双核金属钌配合物作为主要活性成分，与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型。

进一步地，所述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂以及其他一些药用基质。

进一步地，所述载体是药物领域中可接受的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。

进一步地，本发明对上述药物或光敏剂的剂型没有特殊的限制，可以制成本领域技术人员熟知的片剂、胶囊剂、栓剂和粉针剂等。所制备的制剂可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种新型光释放钌配合物，该配合物结构新颖，在光活化后具有产生新物质的能力，在光照条件下可以释放配体并形成内过氧化合物暴露出金属中心(光照后可产生配体2,9-dmp、bpy-en以及内过氧化的bpy-en)，且对人非小细胞肺癌耐药细胞具有较强的光化疗效果。在光照条件下对人非小细胞肺癌耐药细胞具有很强的生长增殖抑制能力，对于研究新型的光释放钌配合物抗耐药肿瘤具有重要的意义，为临床开发光化疗抗耐药肿瘤药物或抗肿瘤金属光敏剂提供了新的思路。

附图说明

图1为bpy-en配体的核磁氢谱图；

图2为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂的核磁氢谱图；

图3为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂的ESI-MS图；

图4为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂在不同溶剂中的紫外吸收度；

图5为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂光照后紫外吸收光谱的变化情况；

图6为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂光照后的质谱分析结果；

图7为光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂对人非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药细胞的光化疗效果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1光释放钌配合物及其制备方法

所述光释放钌配合物的结构式如下所示；

所述光释放钌配合物的合成方法具体包括以下步骤：

(1)由9-蒽硼酸与5-溴-2，2′-联吡啶反应生成5-(9-蒽基)-2，2′-联吡啶(bpy-en)配体：

在N₂保护下将9-蒽硼酸(1.11g,5mmol)、5-溴-2，2′-联吡啶(1.17g,5mmol)、四(三苯基膦)钯(3mol％)和无水碳酸钾(2.07g,15mmol)置于甲苯/水(15mL/3mL)中115℃加热回流12h，反应结束后恢复至室温，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，得到粗产品。使用氧化铝柱(洗脱液:石油醚/乙酸乙酯＝30/1)纯化，进一步干燥得白色粉末，得到5-(9-蒽基)-2，2′-联吡啶(bpy-en)配体，产率0.98g(49.5％)。

产物的核磁氢谱(图1)为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.78(d,J＝6.2Hz,2H),8.73(d,J＝1.9Hz,1H),8.68(d,J＝8.1Hz,1H),8.55(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝8.4Hz,2H),8.04(ddd,J＝14.0,7.9,2.1Hz,2H),7.66–7.51(m,5H),7.51–7.44(m,2H)。

上述化学反应方程式如下所示：

(2)氯化钌(Ⅲ)水合物和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉(2,9-dmp)反应生成RuCl₂(2,9-dmp)₂前体：

在N₂保护下，将氯化钌(Ⅲ)水合物(0.62g,3mmol)、氯化锂(0.38g,8.9mmol)和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉(2,9-dmp)(1.25g,6mmol)加入圆底烧瓶中，并加入20mLN,N-二甲基甲酰胺，然后加热回流8小时，将反应物冷却至室温后，加入30mL丙酮，放入冰箱静置过夜，抽滤得到紫黑色沉淀物，用冷水和丙酮交替洗涤沉淀得Ru(dmp)₂Cl₂前体，产率为24.3％。

上述化学反应方程式如下所示：

(3)RuCl₂(2,9-dmp)₂前体与bpy-en配体反应后再与六氟磷酸铵进行离子置换即得光释放钌配合物：

将前体Ru(dmp)₂Cl₂(0.29g,0.5mmol)和5-(9-蒽基)-2,2′-联吡啶(tpy-en)(0.17g,0.5mmol)溶于乙二醇(25mL)中，80℃下加热过夜。然后将混合物冷却至室温，再加入六氟磷酸铵饱和水溶液搅拌，搅拌1小时，得到目标光释放钌配合物([Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂)，将得到的粗品经中性氧化铝柱色谱(溶剂：二氯甲烷/乙腈＝3/1，V:V)纯化，得到光释放钌配合物[Ru(2,9-dmp)₂(bpy-en)](PF₆)₂，为红色固体，产率为22.3％。

产物的核磁氢谱(图2)为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.87(dd,J＝8.3,3.7Hz,2H),8.81(d,J＝8.3Hz,1H),8.71(s,1H),8.70(d,J＝4.0Hz,1H),8.58(d,J＝8.3Hz,1H),8.40(d,J＝8.8Hz,1H),8.35(d,J＝8.3Hz,1H),8.27(d,J＝9.1Hz,1H),8.15(d,J＝7.8Hz,2H),8.10–7.99(m,3H),7.92(d,J＝8.3Hz,1H),7.78(t,J＝8.0Hz,2H),7.69(d,J＝8.4Hz,1H),7.62(t,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝8.3Hz,1H),7.54(t,J＝8.0Hz,1H),7.49–7.41(m,2H),7.23–7.10(m,4H),5.80(d,J＝8.6Hz,1H),2.25(s,3H),2.01(s,3H),1.82(s,3H),1.73(s,3H)。

产物的ESI-MS(图3)为:[M-2PF₆]²⁺Found[C₅₂H₄₀N₆Ru]²⁺:425.1180。

上述化学反应方程式如下所示：

实验例1光释放钌配合物的特性及性能测试

(1)光释放钌配合物在不同溶剂中的紫外吸收性质

将含光释放钌配合物(10mM)的不同溶剂溶液(ACN、DCM、DMF、DMSO、EA、EG、EtOH、H₂O、MeOH、PBS)的石英比色皿分别放在紫外分光光度计中检测溶液的吸光度，结果如图4所示。说明光释放钌配合物在不同溶剂中均具有相似的紫外吸收性质。

(2)光释放钌配合物光照后的紫外可见吸收光谱变化情况

将含光释放钌配合物(10mM)的PBS溶液的石英比色皿放在白光光源下照射(总光剂量为11.6J/cm²)，每隔60s检测溶液的紫外吸收光谱的变化情况。结果如图5所示，光释放的钌配合物在465nm光照后紫外吸收光谱发生红移并有等吸点出现，说明该钌配合物在光活化后具有产生新物质的能力。

(3)光释放钌配合物光照后的质谱

将光释放钌配合物溶解于色谱级甲醇中后放置在白光光源下照射(光剂量为11.6J/cm²)，将光照后的溶液进行质谱分析。结果如图6所示，发现其光照后产生了配体2,9-dmp、bpy-en以及内过氧化的bpy-en，说明该钌配合物在光活化后具有释放配体暴露出金属中心并产生内过氧化合物的能力。

(4)光释放钌配合物对人非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药细胞的光化疗活性

利用MTT比色法来分析光释放钌配合物对不同肿瘤细胞的抗增殖效应。MTT，中文名叫噻唑蓝，是一种四唑盐，在活细胞中，线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将MTT还原，生成一种蓝紫色产物-甲臜(可溶于DMSO)，且该产物在595nm处有吸收峰，故可用A_595nm来分析细胞的增殖情况。

MTT实验包括以下步骤：

1)先复苏1管A549/5-FU肿瘤细胞，用新鲜培养液(DMEM培养基+10％胎牛血清+1％盘尼西林和链霉素)于37℃下培养，传代2次后使用。

2)待细胞到达对数生长期时，以10000个/孔的细胞密度接种至2块96孔板中(每孔用100μL培养液培养细胞，一板为光照组，另一板为黑暗组)，送入恒温箱(310K,5％CO₂)中于37℃下培养。

3)待其贴壁后，吸出原有培养基，每孔分别加入100μL不同浓度(0.01、0.1、1、10、50、100μM)的钌配合物(Ru)和100μL 5-氟尿嘧啶(5-FU)的新鲜培养液，轻轻晃匀，在恒温箱中37℃避光孵育。

4)孵育16h后，将光照组的细胞培养板置于白光灯下光照5min(光剂量为11.6J/cm²)，黑暗对照组的细胞则一直置于温箱中避光培养，光照结束后，放回培养箱继续避光孵育。

5)孵育32h后，在每孔中加入10μL MTT(5mg/mL)，于37℃温箱中继续孵育3h后，吸去上清液，每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪检测A_{595 nm}，计算细胞增殖抑制率，求出IC₅₀值(抑制率等于50％的时候的药物浓度)。

如图7的MTT检测结果所示，不同浓度的光释放钌配合物和5-FU在黑暗与光照处理条件下对A549/5-FU的杀伤作用效果不同。钌配合物在无光照情况下，对A549/5-FU几乎没有毒性，但是在光照条件下对A549/5-FU肿瘤细胞株具有很强的生长抑制能力(IC₅₀＝0.66mM)，而化疗药物5-FU(IC₅₀>200mM)在相同实验条件下对肿瘤细胞的生长抑制能力远远不如本发明的光释放配合物，证明本发明的光释放钌配合物具有开发成为高效低毒的光化疗药物的巨大潜力。

综上可见，本发明提供的光释放钌配合物可以应用于光化疗抗非小细胞肺癌耐药领域，在光照条件下对人非小细胞肺癌5-氟尿嘧啶耐药细胞具有很强的生长增殖抑制能力(IC₅₀为0.66mM)，且在光照条件下该钌配合物可以释放配体并形成内过氧化合物，进而暴露出金属中心，这对于研究新型的光释放钌配合物来抗耐药肿瘤具有重要的意义，为临床开发光化疗抗耐药肿瘤药物或抗耐药肿瘤金属光敏剂提供了新的思路。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种光释放钌配合物，其特征在于，所述光释放钌配合物的结构如下所示：

2.权利要求1所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在惰性气体保护下将9-蒽硼酸、5-溴-2，2'-联吡啶四(三苯基膦)钯和无水碳酸钾溶于有机溶剂中，通过加热回流反应后经萃取、纯化制得bpy-en配体；

S2、在惰性气体保护下将氯化钌(Ⅲ)水合物、氯化锂和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉溶于有机溶剂中，通过回流反应后经富集沉淀和沉淀洗涤后制得Ru(dmp)₂Cl₂前体；

S3、将前体Ru(dmp)₂Cl₂和tpy-en配体溶于有机溶剂中，通过加热反应后再加入六氟磷酸铵饱和水溶液，经搅拌反应后即得光释放钌配合物。

3.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述9-蒽硼酸、5-溴-2，2'-联吡啶和无水碳酸钾的摩尔比为1:1:3，所述四(三苯基膦)钯的用量为3mol％。

4.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述加热回流反应为100～115℃加热回流反应8～15h。

5.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述回流反应的时间为8～15h。

6.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述氯化钌(Ⅲ)水合物、氯化锂和2，9-二甲基-1，10-菲咯啉(2,9-dmp)的摩尔比为3:8.9:6。

7.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述tpy-en配体与RuCl₂(2,9-dmp)₂前体的摩尔比为1:1。

8.根据权利要求2所述的光释放钌配合物的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述加热反应为80～85℃加热反应8～15h。

9.权利要求1所述的光释放钌配合物在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

10.一种光化疗抗耐药肿瘤药物或抗肿瘤金属光敏剂，其特征在于，所述药物或光敏剂以权利要求1所述的光释放钌配合物为主要活性成分。

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