CN116270543A - 脂质纳米颗粒在制备通过雾吸或鼻滴给药递送核酸的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂质纳米颗粒在制备通过雾吸或鼻滴给药递送核酸的药物中的用途。具体地，涉及一种式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、包含其的脂质载体或核酸脂质纳米颗粒组合物在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途。该核酸脂质纳米颗粒组合物具备足够的稳定性，能够在雾化之后仍保持结构和功能稳定，并且经过雾吸给药后到达肺部并发挥药物疗效，或者经过鼻滴给药后刺激机体产生黏膜免疫，并且到达肺部发挥药物疗效。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可电离脂质分子和脂质纳米颗粒在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途。
背景技术
近年来，核酸药物（包括DNA和RNA药物）作为新型制药技术，短时间内在传染性疾病及肿瘤治疗领域取得了突破性进展。然而，如何将核酸分子安全、高效地递送到特定靶细胞并保护其免于降解是目前开发核酸药物及疫苗面临的主要挑战之一。
理想的递送载体必须是安全的、稳定的和器官特异性的。脂质纳米颗粒（LNP）是临床上最先进的核酸载体。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性好和较大的mRNA有效载荷容量。
遗憾的是，肌肉注射mRNA疫苗后普遍会导致出现局部疼痛、全身酸痛、发烧等症状，副作用持续时间不一。因此，开发新型给药方式，简化给药流程，降低局部副作用，将是未来mRNA疫苗发展的核心之一。
因此，开发使用雾化吸入或者鼻滴等给药方式进行疫苗接种具有重大意义。雾化吸入无需注射等侵入性操作，疫苗经呼吸直接进入肺部，并在肺部表达中和抗体或者病毒抗原以应对病毒入侵。而鼻滴给药将刺激机体产生强大的黏膜免疫，同时疫苗也可通过呼吸道到达肺部，起到防护作用。此外，雾吸和鼻滴给药的mRNA递送系统还可以广泛应用于各类肺部疾病，如对肺癌、肺炎、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、肺血栓栓塞症和肺血管炎等进行预防或治疗。因此，开发雾吸和鼻滴给药的mRNA递送系统具有十分重要的意义。
发明内容
本发明通过使用特定的可电离脂质分子（式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐），制备出能够通过雾化吸入和鼻滴给药的核酸递送系统，该系统具备足够的稳定性，能够在雾化之后仍保持结构和功能稳定，并且经过雾吸给药后到达肺部并发挥药物疗效，或者经过鼻滴给药后刺激机体产生黏膜免疫，并且到达肺部发挥药物疗效。
[可电离脂质分子-式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐]
本发明提供一种式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途，
其中，
R1和R2独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基；
L1、L2、L3和L4独立地选自单键、C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NR5-、-S-、-O-、-NR5C(=O)O-、-OC(=O)NR5-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-SC(=O)-、-C(=O)S-、-OC(=O)O-、-NR5C(=O)NR5-、-C(=O)NR5-或-NR5C(=O)-；
每个R5独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
X选自N或CR6；
R6选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、-(C1-10亚烷基)-S-(C1-10亚烷基)-NR7R8或-(C1-10亚烷基)-O-(C1-10亚烷基)-NR7R8，所述烷基、烯基或亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R3和R4独立地选自C1-30烷基、C2-30烯基或C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个OH、NH2、卤素、-OC1-10烷基、-SC1-10烷基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基取代。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基或5-8元杂环基，所述烷基、烯基、环烷基或杂环基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-10烷基或C2-10烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自C1-10烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH或NH2取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH或NH2取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自C1-3烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH或NH2取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
在一些实施方案中，R1和R2独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、
或
；
或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成
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在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4独立地选自单键或C1-10亚烷基，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4独立地选自单键或C1-6亚烷基，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4独立地选自单键、-CH2-、-CH2CH2-、
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在一些实施方案中，G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NR5-、-S-、-O-、-NR5C(=O)O-、-OC(=O)NR5-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NR5-或-NR5C(=O)-；
每个R5独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基或5-8元杂环基，所述烷基、烯基、环烷基或杂环基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NR5-、-S-、-O-、-NR5C(=O)O-、-OC(=O)NR5-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NR5-或-NR5C(=O)-；
每个R5独立地选自H或C1-10烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，每个R5独立地选自H或C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，每个R5独立地选自H或C1-3烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，每个R5独立地为H。
在一些实施方案中，G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NH-、-S-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)-。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H、C1-10烷基、C2-10烯基或-(C1-10亚烷基)-S-(C1-10亚烷基)-NR7R8，所述烷基、烯基或亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基或5-8元杂环基，所述烷基、烯基、环烷基或杂环基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H、C1-10烷基或-(C1-10亚烷基)-S-(C1-10亚烷基)-NR7R8，所述烷基或亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H或C1-10烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H、C1-6烷基或-(C1-6亚烷基)-S-(C1-6亚烷基)-NR7R8，所述烷基或亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H或C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H或-(C1-6亚烷基)-S-(C1-6亚烷基)-NR7R8，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H或C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H或-(C1-3亚烷基)-S-(C1-3亚烷基)-NR7R8，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H或C1-3烷基，所述烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
在一些实施方案中，X选自N或CR6；R6选自H或
。
在一些实施方案中，R3和R4独立地选自C1-30烷基或C2-30烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH2、卤素、-OC1-10烷基、-SC1-10烷基、C3-8环烷基或5-8元杂环基取代。
在一些实施方案中，R3和R4独立地选自C1-20烷基或C2-20烯基，所述烷基或烯基任选地被一个或多个OH、NH2、卤素、-OC1-10烷基或-SC1-10烷基取代。
在一些实施方案中，R3和R4独立地选自
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在一些实施方案中，所述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐选自如下化合物或其药学上可接受的盐：
。
[脂质载体]
本发明提供一种脂质载体在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途，其中，所述脂质载体包含上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐（作为可电离脂质分子）、甾族脂质分子、聚乙二醇脂质（Lipid-PEG）分子和辅助脂质分子。
在一些实施方案中，所述甾族脂质分子选自下述至少一种：
燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。
在一些实施方案中，甾族脂质分子选自下述至少一种：胆固醇、胆甾烷醇、麦角骨化醇、二氢胆固醇、海藻甾醇、牛磺胆酸和脱氧胆酸。
在一些实施方案中，甾族脂质分子选自胆固醇、胆甾烷醇、二氢胆固醇、海藻甾醇和脱氧胆酸中的至少一种。
在一些实施方案中，甾族脂质分子选自胆固醇和二氢胆固醇中的至少一种。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：
2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)和PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基和PEG-二硬脂基。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子选自2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子选自中性辅助脂质分子和阳离子辅助脂质分子中的至少一种。
在一些实施方案中，所述中性辅助脂质分子选自下述至少一种：
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油) (DOPG)、油酰磷脂酰胆碱（POPC）和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺（POPE）。
在一些实施方案中，所述中性辅助脂质分子选自下述至少一种：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE)。
在一些实施方案中，所述中性辅助脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述阳离子辅助脂质分子选自下述至少一种：
在一些实施方案中，所述阳离子辅助脂质分子选自下述至少一种：Y1-1、溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）、氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA）和双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)。
在一些实施方案中，所述阳离子辅助脂质分子选自Y1-1和溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）中的至少一种。
在一些实施方案中，以摩尔百分含量计，所述脂质载体包含10%-70%的上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐（可电离脂质分子）、5%-60%的甾族脂质分子、1%-60%的聚乙二醇脂质（Lipid-PEG）分子和1%-30%的辅助脂质分子。
在一些实施方案中，所述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐的摩尔百分含量为20%-60%。
在一些实施方案中，所述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐的摩尔百分含量为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。
在一些实施方案中，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为10%-50%。
在一些实施方案中，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为20%-40%。
在一些实施方案中，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、38%、40%、43%、45%或50%。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1%-20%。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为5%-15%。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为30%-60%。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为40%-60%。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为5%-30%。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为5%-15%。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为5%、10%、15%、20%或30%。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子为DSPC或DOPE，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为2%-15%。
在一些实施方案中，所述辅助脂质分子为Y1-1或DOTAP，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为40%-60%。
[核酸脂质纳米颗粒组合物]
本发明提供一种核酸脂质纳米颗粒组合物在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途，其中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物包括上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐或上述脂质载体、以及核酸。
在一些实施方案中，所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种。
在一些实施方案中，所述核酸为mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸为萤火虫荧光素酶mRNA或绿色荧光蛋白（GFP）mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物中脂质载体与核酸的质量比为5:1-50:1。
在一些实施方案中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物中脂质载体与核酸的质量比为10:1-30:1。
在一些实施方案中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物中脂质载体与核酸的质量比为5:1、10:1、15:1、20:1、25:1或30:1。
在一些实施方案中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物的粒径为30~500nm。
在一些实施方案中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物的粒径为30~200nm。
在一些实施方案中，粒径可以为30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm等。
在一些实施方案中，核酸在所述核酸脂质纳米颗粒组合物中的包封率大于50%。示例性地，包封率可以为55%、60%、65%、70%、75%、79%、80%、85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%等。
[核酸脂质纳米颗粒制剂]
本发明提供一种核酸脂质纳米颗粒制剂在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途，其中，所述核酸脂质纳米颗粒制剂包括上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、上述脂质载体或上述核酸脂质纳米颗粒组合物、以及药学上可接受的辅料。
在一些实施方案中，当通过鼻滴给药时，所述核酸脂质纳米颗粒制剂进一步包括壳聚糖。
本发明还提供上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、上述脂质载体、上述核酸脂质纳米颗粒组合物在制备雾化吸入制剂或者鼻滴制剂中的用途。
本发明还提供上述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、上述脂质载体、上述核酸脂质纳米颗粒组合物用于雾化吸入制剂或者鼻滴制剂的用途。
本发明还提供用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸药物或基因疫苗的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述核酸脂质纳米颗粒制剂。
本发明还提供通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸来治疗或预防受试者体内的疾病（例如炎性疾病、病毒感染以及癌症）或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述核酸脂质纳米颗粒组合物或上述核酸脂质纳米颗粒制剂。
术语“炎性疾病”包括自身免疫性病症、过敏性病症和炎性病症，例如选自关节炎，强直性脊柱炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，胃炎，胰腺炎，克罗恩氏病，乳糜泻，多发性硬化，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，风湿热，痛风，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同种异体移植物排斥，贝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癣，皮炎，特异性皮炎，皮肌炎，重症肌无力，格雷夫氏病，桥本甲状腺炎，斯耶格伦综合征，和起泡病症(例如寻常天疱疮)，抗体介导的脉管炎综合征，包括ANCA-相关的血管炎，紫癜，和免疫复合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述过敏性病症可选自接触性皮炎，乳糜泻，哮喘，对屋尘螨的超敏性，花粉和相关的过敏原，铍中毒。
术语“病毒感染”包括但不限于逆转录病毒感染、肝炎病毒感染、COVID-19新冠病毒感染，寨卡病毒感染，登革病毒感染等。
术语“癌症”包括但不限于原发性肺癌（包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌），转移性肺癌（肝癌肺转移、乳腺癌肺转移、结肠癌肺转移、黑色素瘤肺转移等）以及机体其他部位癌症。
[包载核酸的脂质纳米颗粒的制备方法]
本发明提供包载核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其包括下述步骤：
（A1）将所述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、辅助脂质分子、聚乙二醇脂质分子和甾族脂质分子按上述记载的比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；
（A2）将核酸用适当pH的缓冲溶液溶解，得到水相核酸溶液；
（A3）将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸溶液按照上述记载的质量比和一定的体积比，用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸的脂质纳米颗粒溶液；和
任选地，（A4）当用于鼻滴给药时，在（A3）步骤中制得的包载核酸的脂质纳米颗粒溶液中添加一定量的壳聚糖。
在一些实施方案中，步骤（A1）中用于溶解脂质分子的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。
在一些实施方案中，步骤（A1）中的所述溶剂为乙醇、四氢呋喃或丙酮。
在一些实施方案中，步骤（A1）中的所述溶剂为乙醇。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠溶液。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的pH为3-9。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的pH为4-6。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的pH为5。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的浓度为1 mM-1 M。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的浓度为20 mM-500 mM。
在一些实施方案中，步骤（A2）中的所述缓冲溶液的浓度为100 mM。
在一些实施方案中，步骤（A3）中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:1-1:10。
在一些实施方案中，步骤（A3）中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:1-1:5。
在一些实施方案中，步骤（A3）中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:3。
在一些实施方案中，步骤（A3）中的所述微流控设备可以为本领域常规使用的微流控设备，例如INano™ L/L+，迈安娜或者NanoAssemblr® BT，Precision NanoSystems。
在一些实施方案中，步骤（A4）中所述壳聚糖的质量相对于包载核酸的脂质纳米颗粒溶液的体积的比例为1%-15%。
在一些实施方案中，步骤（A4）中壳聚糖的比例为2%-10%。
在一些实施方案中，步骤（A4）中壳聚糖的比例为2%-8%。
[给药装置]
本发明的脂质纳米颗粒组合物可使用多种雾化/鼻滴给药装置进行给药，包括但不限于以下装置。
小鼠给药装置如图1所示，雾吸装置主要包括三个部分：洗耳球（提供气流）、小鼠腔室（固定小鼠）以及雾化液腔室（使药液雾化）。使用时将小鼠固定在小鼠腔室内，将小鼠尾巴置于离心管盖的小孔（鼠尾固定孔）以固定尾部，将小鼠鼻部置于离心管呼吸孔，暴露于雾化液腔室内。将药液加入雾化器（例如鱼跃手持雾化器m105），启动雾化装置后，使用洗耳球提供气流，使雾化后的药液被小鼠吸入。
大动物或人体可使用例如无锡耐思生命科技股份有限公司生产的一次性使用鼻腔给药雾化装置（型号：NSM01，规格：1.0ml），包括以下组成部分：注射器、塑料针头、鼻喷装置以及剂量限位器。
鼻腔雾化给药器可以为本领域常规的医用雾化器和手持雾化器，例如鱼跃手持雾化器m105。
所施用的颗粒的量将取决于核酸与脂质载体的比率、所使用的核酸种类、治疗的疾病或病症、患者的年龄、重量和病状以及临床医生的判断，但是通常将在约0.01mg/Kg体重与约50mg/Kg体重之间，优选地约0.1mg/Kg体重与约5mg/Kg体重之间，或每次施用约108-1010个颗粒。
本发明通过选用特定的可电离脂质分子，制备出能够稳定包载核酸的雾吸/鼻滴递送系统。雾吸递送系统稳定高效，能够经受药液雾化过程中的剪切力，并在吸入后经呼吸道抵达肺部，表达核酸分子。鼻滴递送系统经鼻腔给药后，可刺激黏膜免疫，并经呼吸道到达肺部，发挥疗效。
本发明具有如下有益效果：
1、雾化吸入LNP系统具备足够的稳定性，可经受雾化剪切力仍保持一定结构稳定性，从而保证疗效。
2、鼻滴LNP系统可诱导机体产生黏膜免疫，在呼吸道建立防线，同时也在肺部表达核酸发挥疗效。
3、雾吸/鼻滴给药后，能够实现专一性地富集在肺部，而在其他器官中几乎没有分布。
4、该脂质体适合于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的核酸递送，具有普适性。
5、该雾吸/鼻滴递送系统与其他递送系统（例如肌肉注射等）相比，显著改善了受试者的依从性，能够简化给药流程，降低局部副作用，并且具有优异的递送效果。
附图说明
图1示出了小鼠雾化给药装置。
图2示出了化合物Y1-1的1H NMR谱图。
图3示出了化合物S1-C14的1H NMR谱图。
图4示出了化合物S1-C16的1H NMR谱图。
图5示出了化合物S1-C18的1H NMR谱图。
图6示出了化合物S2-C18的1H NMR谱图。
图7示出了化合物N2-3L的1H NMR谱图。
图8示出了化合物N2-CEC18的1H NMR谱图。
图9示出了化合物N2-OEC18的1H NMR谱图。
图10示出了化合物N2-OHC18的1H NMR谱图。
图11示出了化合物N1-C18的1H NMR谱图。
图12示出了化合物N2-MC14的1H NMR谱图。
图13示出了实施例19制备的四种核酸脂质纳米颗粒LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的TEM照片。
图14示出了实施例19制备的四种LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的化学发光图像，可见四种LNP@mRNAGFP均可在肺部富集，而无其他脏器分布，显示出极好的肺部靶向性。
图15示出了实施例19制备的四种LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的肺部切片荧光图像，可见四种LNP@mRNAGFP均可在肺部表达GFP。
图16示出了实施例20制备的五种LNP@mRNAGFP（S2-C18、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18）的化学发光图像，可见五种LNP@mRNAGFP均可在肺部富集，而无其他脏器分布，显示出极好的肺部靶向性。
图17示出了实施例20制备的五种LNP@mRNAGFP（S2-C18、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18）的肺部切片荧光图像，可见五种LNP@mRNAGFP均可在肺部表达GFP。
图18示出了实施例19制备的四种LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的MTT实验，可见四种LNP@mRNAGFP均无明显的细胞毒性。
图19示出了实施例19制备的四种LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的肝肾功检查结果，可见四种LNP@mRNAGFP均无明显的系统毒性。
图20示出了实施例19制备的四种LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的HE染色结果，可见四种LNP@mRNAGFP均无明显的系统毒性。
具体实施方式
I．定义
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本申请化合物的盐，由本申请发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本申请的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物接触的方式获得碱加成盐。当本申请的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物接触的方式获得酸加成盐。本申请的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
本申请的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本公开的范围之内。
在本公开中，“
”是指取代基键合的位置。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
当数值范围的下限和上限被公开时，落入该范围中的任何数值或任何亚范围都表示被具体公开。特别地，本文中所公开的参数的每一个数值范围(例如，以“约a至b”，或同等的“大约a至b”，或同等的“约a-b”的形式)均应理解为涵盖其中的每一个数值和亚范围。例如，“C1-4”应理解为涵盖其中的任意亚范围以及每一个点值，如C2-4、C3-4、C1-2、C1-3、C1-4等，以及C1、C2、C3、C4等。又例如，“5-10元”应理解为涵盖其中的任意亚范围以及每一个点值，例如5-6元、5-7元、5-8元、5-9元、6-7元、6-8元等，以及5、6、7、8、9、10元等。
当任何变量（例如Rn）在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
术语“取代的”或“取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代基（即=O）时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。取代基可以选自以下的一个、两个或更多个取代基：氘、卤素基团、氰基、硝基、-C(=O)R、-C(=O)OR’、-OC(=O)R”、酰亚胺基、酰胺基、羟基、经取代或未经取代的胺基、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的卤代烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的杂芳基等，但不限于此。
术语“独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y独立地为氢、卤素、羟基、氰基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基。
术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，包括直链的或支链的饱和烃基，所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C1-10烷基”是指具有1至10个碳原子的烷基，包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基，实例包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。烷基可以是任选取代的或未取代的。
术语“亚烷基”是指直链或支链的二价饱和脂肪族烃基，其所连接的两个基团(或片段)既可以连接同一个碳原子，又可以连接不同的碳原子。例如，本文中所使用的术语“C1-10亚烷基”是指具有1-10个碳原子的亚烷基(如亚甲基、1,1-亚乙基、1,2-亚乙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丁基等)。亚烷基可以是任选取代的或未取代的。
术语“烯基”是指一价的直链或支链的烷烃基团，其仅由碳原子和氢原子组成，含有至少一个双键，并且通过一个单键与其它片段连接，包括(但不限于)乙烯基、丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基和异丁烯基等基团。例如“C2-30烯基”指包含2至30个碳原子并且具有至少1个碳碳双键的一价直链或支链烃基。烯基可以是任选取代的或未取代的。
术语“亚烯基”是指二价的直链或支链的烷烃基团，其仅由碳原子和氢原子组成，含有至少一个双键，并且通过两个单键分别与其它片段连接，包括(但不限于)亚乙烯基等。例如，“C2-10亚烯基”指包含2至10个碳原子并且具有至少1个碳碳双键的二价直链或支链烃基。亚烯基可以是任选取代的或未取代的。
术语“炔基”是指一价的直链或支链的烷烃基团，其仅由碳原子和氢原子组成，含有至少一个碳碳三键，并且通过一个单键与其它片段连接，包括(但不限于)乙炔基、丙炔基、丁炔基和戊炔基等基团。例如“C2-30炔基”指包含2至30个碳原子并且具有至少1个碳碳三键的一价直链或支链烃基。炔基可以是任选取代的或未取代的。
术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的、单环或多环(诸如双环，例如：并环、桥环或螺环)的非芳香族烃基。例如，本发明中所使用的术语“C3-8环烷基”是指具有3至8个碳原子的环烷基。实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。环烷基可以是任选取代的或未取代的。
术语“杂环基”是指饱和或部分饱和的、单环或多环(诸如双环，例如：并环、桥环或螺环)的非芳香族基团，其环原子由碳原子以及至少一个选自N、O和S的杂原子构成，其中S原子任选地被取代以形成S(=O)、S(=O)2或S(=O)(=NRx)，Rx独立地选自H或C1-4烷基。如果满足价键要求，杂环基可以通过任意一个环原子与分子的其余部分连接。例如，本发明中所使用的术语“5-8元杂环基”是指具有5至8个环原子的杂环基。常见的杂环基包括(但不限于)环氧乙烷基、氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、咪唑烷基、吡唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、二噻烷基或三噻烷基。本发明中的杂环基任选地被一个或多个本发明所描述的取代基取代。
术语“芳基”是指具有共轭π电子系统的单环或稠合多环的芳香族烃基。例如，本发明中所使用的术语“C6-10芳基”是指具有6至10个碳原子的芳基。常见的芳基包括(但不限于)苯基、萘基、蒽基、菲基、苊基、薁基、芴基、茚基、芘基等。本发明中的芳基任选地被一个或多个本发明所描述的取代基取代。
术语“杂芳基”是指具有共轭π电子系统的单环或稠合多环的芳香族基团，其环原子由碳原子以及至少一个选自N、O和S的杂原子构成。如果满足价键要求，杂芳基可以通过任意一个环原子与分子的其余部分连接。例如，本发明中所使用的术语“5-10元杂芳基”是指具有5至10个环原子的杂芳基。常见的杂芳基包括(但不限于)噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基及其苯并衍生物、吡咯并吡啶基、吡咯并吡嗪基、吡唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、嘌呤基等。本发明中的杂芳基任选地被一个或多个本发明所描述的取代基(如卤素、C1-6烷基等)取代。
术语“药学上可接受的辅料”是指与上述核酸脂质纳米颗粒组合物一同给药的辅料，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。实例包括但不限于：载体、稀释剂、粘合剂、吸收剂、着色剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
II．具体实施例
下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例中所使用的试剂或仪器均为可以通过市购获得的常规产品。未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。本发明中所使用的术语“室温”是指20℃±5℃。在用于修饰某一数值或数值范围时，本发明中所使用的术语“约”是指包括该数值或数值范围以及该数值或数值范围的本领域技术人员可接受的误差范围，例如该误差范围为±10%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%等。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本文中所用的缩写具有以下含义：
1H NMR波谱法采用液体ECZ400S核磁共振波谱仪（JNM-ECZ400S/L1，日本株式会社）(型号AVACE III HD 400 MHz)。
快速柱色谱法使用Biotage快速柱色谱仪。
实施例1：化合物Y1-1的合成方法
将化合物1（2g）与二氯亚砜（1.5g）溶于15ml二氯甲烷中，室温搅拌10分钟后向其中加入3滴DMF，反应4小时。反应完成后旋蒸除去二氯甲烷以及过量的二氯亚砜，得到化合物2，呈粘稠黄色液体。
将化合物3（2g）与化合物2（6.5g）溶于20ml二氯甲烷中，滴加几滴三乙胺于上述体系内，常温反应过夜。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，得到的粗产物通过快速硅胶色谱（二氯甲烷：甲醇=9:1）纯化，得到黄色粘稠液体化合物4。
将化合物4（2g）与过量碘甲烷（3 eq）溶于20ml二氯甲烷中，70℃反应24h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂以及过量的碘甲烷，得到的粗产物通过快速硅胶色谱纯化（二氯甲烷：甲醇=8:2），得到淡黄色粘稠液体化合物Y1-1，1H NMR数据如图2所示。
实施例2：S1-C14的合成方法
将化合物1（2g）与二氯亚砜（1.5g）溶于15ml二氯甲烷中，室温搅拌10分钟后向其中加入3滴DMF，反应4个小时。反应完成后旋蒸除去二氯甲烷以及过量的二氯亚砜，得到化合物2，呈粘稠黄色液体。
将化合物3（2g）与化合物2（3.3g）溶于20ml二氯甲烷中，滴加几滴三乙胺于上述体系内，常温反应过夜。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，得到的粗产物通过快速硅胶色谱（二氯甲烷：甲醇=9:1）纯化，得到化合物4，为黄色粘稠液体。
将化合物5（2g）、化合物6（5.96g）和DMAP（1.5g）溶于50ml THF中，室温下254nm紫外光照射6h，反应完成后通过快速硅胶色谱纯化，得到化合物7，为淡黄色粘稠液体。
将化合物7（1g）和化合物4（0.92g）溶解于DCM(20mL)中，加入EDC(0.98g)和DMAP(35mg)，室温搅拌反应12h。反应混合物用100mL水稀释并用200mL DCM萃取，有机层用100mL盐水洗涤，干燥，过滤并减压浓缩，得到的残余物通过快速硅胶色谱（二氯甲烷）纯化，得到的无色液体即为化合物8。
将化合物8（1g）溶于10 ml二氯甲烷中，加入CDI（2 g），室温搅拌过夜。反应完成后用100mL水稀释并用200mL DCM萃取，有机层用100mL盐水洗涤，干燥，过滤并减压浓缩，得到的无色液体即为化合物9。
将化合物9（1g）溶于10ml二氯甲烷中，加入化合物10（0.23 g），37℃搅拌过夜。反应完成后旋蒸除去溶剂，得到的粗产物通过快速硅胶色谱（二氯甲烷：甲醇=8:2）纯化，得到的无色液体即为化合物S1-C14。
按照S1-C14的合成方法，分别得到化合物S1-C16和S1-C18，S1-C14、S1-C16和S1-C18的1H NMR数据如图3-5所示。
实施例3：化合物S2-C18的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2（1.85 g）。将油酰氯2（2 g）和二溴新戊二醇（0.87 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=9:1）分离纯化，得到油酸二溴新戊二酯3。
将制备得到的油酸二溴新戊二酯3（2 g）在四氢呋喃（20 ml）中与2-二乙氨基乙硫醇（1 g）在室温下反应，经硅胶色谱柱（二氯甲烷洗脱）分离纯化后得到化合物S2-C18，1HNMR数据如图6所示。
实施例4：化合物N2-3L的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2（1.76 g）。
将油酰氯2（2 g）和三乙醇胺（1.05 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇=8:2)。通过控制油酰氯与三乙醇胺的比例，得到单取代油酸三乙醇胺酯3。
将2-己基癸酸4（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（2 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到化合物5。
将单取代油酸三乙醇胺酯3（1 g）和化合物5（0.67 g）溶解在二氯甲烷（15 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经过滤、纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化（二氯甲烷：甲醇=9:1），得到油酸和2-己基癸酸取代的三乙醇胺酯6。
将化合物6（1 g）和N,N'-羰基二咪唑（4倍量）在DCM（10 ml）中常温反应3h，反应结束后水洗三遍，无水硫酸钠干燥后加入N-(3-氨基丙基)二乙醇胺（2倍量），在二氯甲烷中过夜反应，得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化（二氯甲烷：甲醇=8:2），得到化合物N2-3L，1H NMR数据如图7所示。
实施例5：化合物N2-CEC18的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2（1.88 g）。
将油酰氯2（2 g）和2-羟甲基-1,3-丙二醇（0.35 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=9:1）分离纯化。通过控制油酰氯与2-羟甲基-1,3-丙二醇的比例，获得双取代化合物3。
随后将所得到的双取代化合物3（1 g）和N,N'-羰基二咪唑（4倍量）在DCM（15 ml）中常温反应3h，反应结束后水洗三遍，干燥后加入N,N-二乙基乙烷-1,2-氯化二铵（2倍量），在二氯甲烷（15 ml）中室温过夜反应，得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化，得到化合物N2-CEC18，1H NMR数据如图8所示。
实施例6：化合物N2-OEC18的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2（1.69 g）。
将油酰氯2（2 g）和三乙醇胺（0.49 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化。通过控制油酰氯与三乙醇胺的比例，获得双取代油酸三乙醇胺酯3。
随后将所得到的双取代油酸三乙醇胺酯3（1 g）和N,N'-羰基二咪唑（4倍量）在DCM（15 ml）中常温反应3h，反应结束后水洗三遍，干燥后加入N,N-二乙基乙烷-1,2-氯化二铵（2倍量），在二氯甲烷（15 ml）中室温过夜反应，得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化，得到化合物N2-OEC18，1H NMR数据如图9所示。
实施例7：化合物N2-OHC18的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2。
将油酰氯2（2 g）和三(2-氨基乙基)胺（0.48 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=8:2）分离纯化。通过控制油酰氯与三(2-氨基乙基)胺的比例，获得化合物3。
随后将化合物3（1 g）、化合物4（0.5 g）、DMAP（0.1 g）和EDC（0.292 g）共同溶解于二氯甲烷（15 ml）中，室温反应过夜。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱分离纯化，得到化合物N2-OHC18，1H NMR数据如图10所示。
实施例8：化合物N1-C18的合成方法
将油酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯2。
将油酰氯2（2 g）和化合物3（0.636 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱(二氯甲烷洗脱)分离纯化，获得化合物4。
随后将化合物4（2 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，并向其中加入0.3 ml三氟乙酸，室温反应4小时，然后加入过量的饱和碳酸氢钠溶液中和反应，并用水洗3次，旋蒸除去溶剂，获得化合物5。
将化合物5（1 g）与溴乙酸叔丁酯（0.312 g）溶解于四氢呋喃（10 ml）中，在碳酸钾（0.2g）的作用下室温反应12小时，得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱(二氯甲烷洗脱)分离纯化，得到化合物6。
然后，将化合物6（1 g）溶解于二氯甲烷（20 ml），加入三氟乙酸（0.3 ml），室温反应4小时，脱去Boc保护基，得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=9:1）分离纯化，得到化合物7。
随后将化合物7（1 g）与氮卓-1-基乙醇（0.211 g）在EDC（0.291 g）和DMAP（0.1 g）的作用下，在二氯甲烷（10 ml）中室温反应过夜，得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=9:1）分离纯化，获得化合物N1-C18，1H NMR数据如图11所示。
实施例9：化合物N2-MC14的合成方法
将十四酸1（2 g）溶在甲苯（20 ml）中与二氯亚砜（3 g）在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到十四酸酰氯2。
将十四酸酰氯2（2 g）和三(2-氨基乙基)胺（0.593 g）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入三乙胺（0.1 ml），室温过夜反应。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=8:2）分离纯化。通过控制十四酸酰氯与三(2-氨基乙基)胺的比例，获得化合物3。
将化合物3（1 g）与N，N-二甲基-β-丙氨酸（0.206 g）溶于二氯甲烷（10 ml）中，并加入EDC（0.348 g）和DMAP（0.05 mg），室温反应过夜。得到的反应液经纯水洗涤、干燥和浓缩后用硅胶色谱柱（二氯甲烷：甲醇=9:1）分离纯化，得到化合物N2-MC14，1H NMR数据如图12所示。
实施例10：可电离脂质分子S1-C14、S1-C16和S1-C18均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14、S1-C16、S1-C18)、DSPC、胆固醇以及PEG-DSPE按照摩尔比50:10:38:2溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR (DiIC18(7)1,1’-双十八烷基四甲基吲哚三碳菁碘)。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA（Firefly luciferase mRNA），用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒（例如可表示为LNP@mRNALuci）。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表1），基于S1-C14、S1-C16、S1-C18制备的LNP@mRNALuci的水合粒径分别为62.3±10.1 nm、75.5 ± 13.4 nm和89.7± 20.2nm，均符合可用标准。
将三种LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物（荧光素钠盐，D-Luciferin，150mg/kg，Yeasen），随后使用小动物活体荧光成像系统（IVIS® Spectrum，PerkinElmer）进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表1），三种LNP@mRNALuci均可实现肺部富集且三种LNP@mRNALuci在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
LNP@mRNALuci的包封率测定
将上述得到的微白色溶液使用适量体积的PBS溶液透析4h，收集滤液，使用Nanodrop测定滤液中的mRNA含量，通过如下公式计算包封率：
包封率=mRNA总量－mRNA滤液/mRNA总量。
结果显示（表1），所制备的LNP@mRNALuci均具有良好的mRNA包封率。
表1
实施例11：不同比例的可电离脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DSPC、胆固醇和PEG-DSPE按照如表2所示的摩尔比溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液的体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征，结果如表2所示，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表2），所制备的LNP@mRNALuci均可实现肺部富集且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表2
实施例12：不同比例的辅助脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DSPC、胆固醇以及PEG-DSPE按照如表3所示的摩尔比溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征，结果如表3所示，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表3），所制备的LNP@mRNALuci均可实现肺部富集且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表3
实施例13：不同比例的甾族脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DSPC、胆固醇和PEG-DSPE按照如表4所示的摩尔比溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征，结果如表4所示，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表4），所制备的LNP@mRNALuci均可实现肺部富集且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表4
实施例14：以DSPC为辅助脂质分子，不同比例的聚乙二醇脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DSPC、胆固醇和PEG-DSPE按照如表5所示的摩尔比溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表5），选用DSPC为辅助脂质分子时，PEG-DSPE的摩尔比例从2%上升至60%时，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表5），选用DSPC为辅助脂质分子时，所有LNP@mRNALuci均可实现肺部富集，并且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表5
实施例15：以DOPE为辅助脂质分子，不同比例的聚乙二醇脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DOPE、胆固醇和PEG-DSPE按照如表6所示的摩尔比溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表6），选用DOPE为辅助脂质分子时，PEG-DSPE的摩尔比例从2%上升至60%时，所得LNP@mRNALuci水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表6），选用DOPE为辅助脂质分子时，所有LNP@mRNALuci均可实现肺部富集，并且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表6
实施例16：以Y1-1为辅助脂质分子，不同比例的聚乙二醇脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、Y1-1、胆固醇和PEG-DSPE按照如表7所示的摩尔比溶于乙醇中，mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液的体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表7），选用Y1-1为辅助脂质分子时，PEG-DSPE的摩尔比例从2%上升至60%时，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表7），选用Y1-1为辅助脂质分子时，所有的LNP@mRNALuci均可实现肺部富集，并且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表7
实施例17：以DOTAP为辅助脂质分子，不同比例的聚乙二醇脂质分子均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S1-C14)、DOTAP、胆固醇和PEG-DSPE按照如表8所示的摩尔比溶于乙醇中，mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液的体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表8），选用DOTAP为辅助脂质分子时，PEG-DSPE的摩尔比例从2%上升至60%时，所得LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表8），选用DOTAP为辅助脂质分子时，所有的LNP@mRNALuci均可实现肺部富集，并且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
表8
实施例18：可电离脂质分子S2-C18、N1-C16、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18、N2-CEC18和N2-OHC18均可实现通过雾化吸入来递送mRNA
将可电离脂质分子(S2-C18、N1-C16、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18、N2-CEC18、N2-OHC18)、DSPC、胆固醇以及PEG-DSPE按照摩尔比50:5:40:5溶于乙醇中，并添加1%荧光染料DiR。mRNA为萤火虫荧光素酶mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液。随后超滤除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNALuci。
使用动态光散射（DLS）对所获得的LNP@mRNALuci进行粒径分布表征。DLS结果显示（表9），所制备的LNP@mRNALuci的水合粒径均符合可用标准。
将所制备的LNP@mRNALuci和PBS（对照组）按照每只小鼠5ug mRNA或100uL PBS的剂量，对C57BL/6G小鼠进行雾化吸入给药。6小时后向小鼠腹腔注射底物，随后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像和生物发光成像。
结果显示（表9），所有LNP@mRNALuci均可实现肺部富集且在肺部的荧光素酶表达水平均较高（以PBS组的小鼠荧光素酶表达强度为1计算）。
LNP@mRNALuci的包封率测定
将上述得到的微白色溶液使用适量体积的PBS溶液透析4h，收集滤液，使用Nanodrop测定滤液中的mRNA含量，通过如下公式计算包封率：
包封率=mRNA总量－mRNA滤液/mRNA总量。
结果显示（表9），所制备的LNP@mRNALuci均具有良好的mRNA包封率。
表9
实施例19: 鼻滴实验1
将可电离脂质分子(S1-C14)、辅助脂质分子（DOPE、DSPC、Y1-1或DOTAP）、胆固醇和PEG-DSPE按照一定的摩尔比溶于乙醇中（S1-C14：DSPC：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，S1-C14：DOPE：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，S1-C14：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，S1-C14：DOTAP：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2），并添加1%荧光染料DiR。mRNA为绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液，使用生理盐水透析除去乙醇，随后向制备的包载核酸的脂质纳米颗粒溶液中添加2%的壳聚糖（0.02mg壳聚糖/(1uL包载核酸药物的脂质纳米颗粒溶液)）。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNAGFP，共四组（按辅助脂质分子种类和PEG-DSPE含量分别命名为：DSPC-10，DOPE-10，DOTAP-50，Y1-1-50）。
将制备的LNP@mRNAGFP按照每只小鼠5ug mRNA的剂量，对C57BL/6G小鼠进行鼻滴给药。6小时后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像。并将小鼠解剖，取肺部进行包埋、冷冻、切片、染色等操作，在荧光显微镜下观察GFP表达情况。
图13的电镜图片显示四种LNP@mRNAGFP形貌良好，均成类圆形，并且粒径均一约100nm左右。图14和15显示所有的LNP@mRNAGFP均可通过鼻滴给药实现肺部富集和GFP表达。
实施例20: 鼻滴实验2
将可电离脂质分子(S2-C18、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18)、辅助脂质分子（Y1-1）、胆固醇和PEG-DSPE按照一定的摩尔比溶于乙醇中（S2-C18：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，N1-C18：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，N2-MC14：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，N2-3L：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2，N2-OEC18：Y1-1：胆固醇：PEG-DSPE=50:10:38:2），并添加1%荧光染料DiR。mRNA为绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，用pH为5.0的柠檬酸钠（100 mM）缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，脂质载体与mRNA以25:1的质量比混合，得到微白色溶液，随后向制备的包载核酸的脂质纳米颗粒溶液中添加2%的壳聚糖（0.02mg壳聚糖/(1uL包载核酸药物的脂质纳米颗粒溶液)），使用生理盐水透析除去乙醇。得到包载mRNA的脂质纳米颗粒LNP@mRNAGFP，共五组（按可电离脂质分子种类分别命名为：S2-C18、N1-C18、N2-MC14、N2-3L、N2-OEC18）。
将制备的LNP@mRNAGFP按照每只小鼠5ug mRNA的剂量，对C57BL/6G小鼠进行鼻滴给药。6小时后使用小动物活体荧光成像系统进行化学发光成像。并将小鼠解剖，取肺部进行包埋、冷冻、切片、染色等操作，在荧光显微镜下观察GFP表达情况。
结果显示（图16，图17），所有的LNP@mRNAGFP均可通过鼻滴给药实现肺部富集和GFP表达。
实施例21：实施例19中的四组LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50）的细胞毒性实验
将HEK293细胞（1.5×105个/ml）接种在96孔板的DMEM培养基（100μl）（10％胎牛血清和1％青霉素）中。将细胞在37℃下在含有5％CO2的气氛中孵育。细胞孵育24小时后更换新鲜培养基。加入不同浓度的四组LNP@mRNAGFP（1μg RNA/孔），将细胞孵育24小时后，用含有0.5 mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑（MTT）培养基（100 μl）替换原培养基。继续孵育4小时后，除去含有MTT的培养基，用PBS小心洗涤3次。然后，加入DMSO（100μL），在BioTek Synergy H4读数器中测量在570 nm的波长下吸光度，计算得到24 h的细胞存活率，从而得到各组LNP@mRNAGFP的细胞毒性。
由图18可见，孵育24h后的细胞存活率均在90%以上，表明本发明的核酸脂质纳米颗粒具有较低的细胞毒性，展现出了良好的生物安全性能。
实施例22: LNP@mRNAGFP的生物安全性分析
将BALB/c小鼠分为5组，每组3只，BALB/c小鼠(4-6周龄，雌性，体重约18-20g)，分别经尾静脉注射PBS（对照组）和实施例19中的四组LNP@mRNAGFP（DSPC-10、DOPE-10、DOTAP-50、Y1-1-50），注射5天后取小鼠静脉血，离心取上清液，测定肝肾功能各项指标。对注射5天后的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色，观察其是否出现病变。
肝肾功能指标检测结果显示（图19），各组小鼠的各项肝肾功能均未出现明显变化，其指标均与PBS相当。组织切片实验结果显示（图20），经LNP@mRNAGFP处理的小鼠的各主要器官均未出现明显的病变，说明这些LNP@mRNAGFP具有良好的生物安全性。
前述对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择。
Claims (9)
1.一种式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐、包含其的脂质载体或核酸脂质纳米颗粒组合物在制备用于通过雾化吸入或者鼻滴给药递送核酸的药物中的用途，
R1和R2独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基；
L1、L2、L3和L4独立地选自单键、C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NR5-、-S-、-O-、-NR5C(=O)O-、-OC(=O)NR5-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-SC(=O)-、-C(=O)S-、-OC(=O)O-、-NR5C(=O)NR5-、-C(=O)NR5-或-NR5C(=O)-；
每个R5独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
X选自N或CR6；
R6选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、-(C1-10亚烷基)-S-(C1-10亚烷基)-NR7R8或-(C1-10亚烷基)-O-(C1-10亚烷基)-NR7R8，所述烷基、烯基或亚烷基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述烷基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R3和R4独立地选自C1-30烷基、C2-30烯基或C2-30炔基，所述烷基、烯基或炔基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2、卤素、-OC1-10烷基、-SC1-10烷基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基取代。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，
R1和R2独立地选自H、C1-10烷基或C2-10烯基，所述烷基或烯基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；或者，R1和R2与其所连接的N原子一起形成5-8元杂环基。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
L1、L2、L3和L4独立地选自单键或C1-10亚烷基，所述亚烷基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
G1、G2、G3和G4独立地选自单键、-NR5-、-S-、-O-、-NR5C(=O)O-、-OC(=O)NR5-、-OC(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NR5-或-NR5C(=O)-；
每个R5独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基或5-8元杂环基，所述烷基、烯基、环烷基或杂环基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
X选自N或CR6；R6选自H、C1-10烷基、C2-10烯基或-(C1-10亚烷基)-S-(C1-10亚烷基)-NR7R8，所述烷基、烯基或亚烷基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
R7和R8独立地选自H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基或5-8元杂环基，所述烷基、烯基、环烷基或杂环基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
R3和R4独立地选自C1-30烷基或C2-30烯基，所述烷基或烯基是未取代的或者被一个或多个OH、NH2、卤素、-OC1-10烷基、-SC1-10烷基、C3-8环烷基或5-8元杂环基取代。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中，
所述式（1）所示的化合物或其药学上可接受的盐选自如下化合物或其药学上可接受的盐：
8.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述脂质载体进一步包含甾族脂质分子、聚乙二醇脂质分子和辅助脂质分子。
9.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述核酸脂质纳米颗粒组合物进一步包括核酸，所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种。
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