CN116262782A - 抗菌肽coleoptericin及其原核表达方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗菌肽coleoptericin及其原核表达方法与应用。本发明通过RACE PCR的方法首次扩增出大麦虫coleoptericin完整的CDs序列，采用原核表达载体构建包含抗菌肽coleoptericin的编码基因的重组载体，实现了抗菌肽coleoptericin的原核表达，获得的重组抗菌肽在纯化后具有明显的体外抑菌效果，且在高浓度情况下无溶血性和细胞毒性，安全性良好。抗菌肽coleoptericin还可有效抑制小鼠乳腺炎模型中肺炎克雷伯菌的繁殖，对肺炎克雷伯菌性乳腺炎具有良好的治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及抗菌肽coleoptericin及其原核表达方法与应用。
背景技术
随着全球细菌耐药性、动物源性食品安全问题日益严重以及抗生素使用监管的不断加强，研发新型药物替代抗生素迫在眉睫。
抗菌肽是一类具有跟抗生素相同作用的多肽，它存在于几乎所有的生物体中，是生物体天然免疫的重要组成部分。抗菌肽具有相对分子质量低，抗菌高效和广谱，毒副作用小，免疫原性低，热稳定和水溶性良好，抗菌机理独特和不易产生耐药株等优点，在新型抗菌药物开发领域展现出巨大的潜力。
抗菌肽最早由瑞典斯德哥尔摩大学Boman研究小组从惜古比天蚕中分离得到，并命名为天蚕素。此后，科学家们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人体中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽，打开了新型抗菌物质研究新纪元。昆虫作为种群最大的生物种类，目前已发现超过200种抗菌肽，其中仅在家蚕一种昆虫就获得了40个抗菌肽。目前，以昆虫为主要来源的抗菌肽的开发利用已成为药理学、昆虫学、微生物学等多个领域的研究热点。
由于天然抗菌肽存在来源受限、提取工艺复杂、产量低，药效低等问题，因此采用基因工程技术开发和制备昆虫抗菌肽具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗菌肽coleoptericin及其原核表达方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种来自大麦虫的抗菌肽coleoptericin，所述抗菌肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供编码抗菌肽coleoptericin的核酸分子。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供抗菌肽coleoptericin的原核表达的方法，包括以下步骤：
(1)通过RACE PCR方法从大麦虫中扩增得到抗菌肽coleoptericin的编码基因；
(2)构建重组载体：将所述编码基因插入到原核表达载体中，构建得到包含所述编码基因的重组载体；
(3)表达抗菌肽coleoptericin：用重组载体转化大肠杆菌，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽coleoptericin的细菌。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)和(3)分别为：
(2)构建重组载体：将抗菌肽coleoptericin的编码基因连接到pMD19-T克隆载体中，构建得到重组质粒pMD19-coleoptericin；分别酶切重组质粒pMD19-coleoptericin和原核表达载体pGEX 6p-1，构建得到包含coleoptericin编码基因的重组载体pGEX6p-coleoptericin。
(3)表达抗菌肽coleoptericin：将重组载体pGEX 6p-coleoptericin转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽coleoptericin的细菌。
进一步地，所述方法还包括采用PBS处理细菌悬液，超声破碎后离心并收上清液；采用GST柱亲和层析和Superdex30凝胶过滤层析纯化所述上清液，获得纯化的抗菌肽coleoptericin。
第五方面，本发明提供抗菌肽coleoptericin的以下任一应用：
1)用于抑制细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)；
2)用于制备抑菌剂；
3)用于制备防腐剂；
4)用于制备抗菌药物；
5)预防或治疗细菌性感染。
6)用于治疗由细菌(包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)感染所致疾病。
优选地，所述细菌包括肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)。
第六方面，本发明提供一种抗菌药物或组合物，有效成分为抗菌肽coleoptericin。
第七方面，本发明提供一种抑菌剂或防腐剂，有效成分为抗菌肽coleoptericin。
第八方面，本发明提供抗菌肽coleoptericin在制备用于治疗或减轻由肺炎克雷伯菌导致的乳腺炎的药物中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过RACE PCR的方法首次扩增出大麦虫coleoptericin完整的CDs序列，采用原核表达载体构建包含抗菌肽coleoptericin的编码基因的重组载体，实现了抗菌肽coleoptericin的原核表达，获得的重组抗菌肽在纯化后具有明显的体外抑菌效果，且在高浓度情况下无溶血性和细胞毒性，安全性良好。抗菌肽coleoptericin还可有效抑制小鼠乳腺炎模型中肺炎克雷伯菌的粘附和增殖，对肺炎克雷伯菌性乳腺炎具有良好的治疗作用。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中coleoptericin基因扩增；其中，(a)简并引物保守基因序列扩增；(b)coleoptericin 5’RACE扩增；(c)coleoptericin 3’RACE扩增；(d)coleoptericin完整CDs区扩增。
图2为本发明较佳实施例中重组质粒pGEX 6p-coleoptericin菌液PCR鉴定结果。
图3为本发明较佳实施例中重组抗菌肽coleoptericin SDS-PAGE凝胶电泳(a-b)与Western blot验证(c)：(a)M:Marker 180KD-10KD；1：Rosetta全菌；2：pGEX 6p-1空载；3：pGEX 6p-coleoptericin上清；4：pGEX 6p-coleoptericin沉淀；(b)M:Marker180KD-10KD；1：pGEX 6p-coleoptericin上清；2：纯化后重组coleoptericin蛋白；3：重组coleoptericin蛋白经Prescission Protease柱上切割后洗脱的GST标签；(c)M:Marker 180KD-10KD；1：纯化后重组coleoptericin蛋白；2：重组coleoptericin蛋白经Prescission Protease柱上切割后洗脱的GST标签。
图4为本发明较佳实施例中抗菌肽coleoptericin纯化(a)与质谱鉴定(b)结果。
图5为本发明较佳实施例中抗菌肽coleoptericin抗菌活性检测结果。
图6为本发明较佳实施例中抗菌肽coleoptericin细胞毒性检测(a)和溶血性(b)检测结果。
图7为本发明较佳实施例中抗菌肽coleoptericin在小鼠细菌性感染模型中的应用；其中，(a)小鼠乳腺炎模型中，给予coleoptericin治疗后乳腺组织载菌量的变化；(b)小鼠乳腺炎模型中，给予coleoptericin治疗后乳腺组织病理学变化。
具体实施方式
本发明提供一种抗菌肽及其原核表达方法和应用。本发明制备的抗菌肽是一种新型抗菌肽，具有明显的体外抑菌效果，且安全性良好。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种抗菌肽coleoptericin的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，对所述表达载体进行PCR扩增的引物序列为8条(5′-3′)：
P1:TCYCTCCARGGTGGWGCYCC
P2:GTTCCWCCMACRTGCCAAGTRGG
P3:CAATTTCCCTCAACCTTCCCAGCAAAATGGTG
P4:AAATGGTGGGTGGAAGGTGAGC
P5:CGAATAACCTTTCCCCATCCAG
P6:TAACCTTTCCCCATCCAGCATT
P7:CGGGATCCTCTCTTCAAGGAGGAGCTCCCA
P8:TAAAGCGGCCGCTCACCACCTGTAGGTTCCTC
本发明还提供一种抗菌肽coleoptericin的重组载体，该重组载体包含如SEQ IDNO:2所示的coleoptericin的编码基因。
本发明还提供一种抗菌肽coleoptericin，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种抗菌肽coleoptericin原核表达的方法，该方法包括以下步骤：
(1)获取抗菌肽coleoptericin的编码基因：提取大麦虫RNA，通过RACE PCR方法扩增coleoptericin基因的3’端和5’端，拼接后获得coleoptericin CDs全长序列。
(2)构建重组载体：将抗菌肽coleoptericin编码基因的PCR扩增产物纯化后连接到pMD19-T克隆载体中，构建得到重组质粒pMD19-coleoptericin；分别酶切重组质粒pMD19-coleoptericin和原核表达载体pGEX 6p-1，构建得到包含coleoptericin编码基因的重组载体pGEX 6p-coleoptericin；
(3)表达抗菌肽coleoptericin：将重组载体pGEX 6p-coleoptericin转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，加入IPTG诱导后收集包含抗菌肽coleoptericin的细菌。采用PBS重悬细菌，超声破碎后离心并收集上清液；采用GST柱亲和层析法纯化所述上清液，获得纯化后的重组抗菌肽coleoptericin。重组抗菌肽coleoptericin经PrescissionProtease酶切，Superdex 30分离纯化后获得抗菌肽coleoptericin。
本发明还提供抗菌肽coleoptericin在抑制细菌生长，预防或治疗细菌性感染的应用。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的菌种、质粒及主要试剂：
DH5αChemically Competent Cell(北京全式金生物技术有限公司)、Rosetta(DE3)Chemically Competent Cell(北京索莱宝科技有限公司)；pMD19-T Vector(TaKaRa公司)；pGEX 6p-1载体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均来自中国农业大学动物医学院。
SMARTer RACE 5’/3’Kit、Taq酶、琼脂糖凝胶电泳10×Loading Buffer、DL2000DNA Marker、限制性核酸内切酶NotⅠ和BamHⅠ、质粒连接DNA Ligation Kit均为TaKaRa公司产品；DNA质粒小量提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品，BCA蛋白定量试剂盒为Thermo公司产品；纯化蛋白所用GSTrap FF以及Superdex 30为GE Healthcare公司产品。
实施例1重组抗菌肽coleoptericin原核表达与纯化
1、coleoptericin基因扩增
提取大麦虫总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(with gDNA Eraser)说明书反转录成cDNA，根据大麦虫coleoptericin保守氨基酸序列设计简并引物，扩增保守区，PCR反应体系如下：2×Tap PCR Master Mix 25μL；10μmol/L上、下游引物各2μL；ddH2O 19μL；cDNA 2μL。PCR反应条件如下：65℃-55℃30s(每个循环降2℃，每个温度2个循环)，72℃30s；95℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环；72℃10min；将PCR扩增产物通过胶回收进行纯化，纯化的目的基因克隆到pMD19-T载体中送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序。根据测序结果获得大麦虫coleoptericin基因保守序列，设计特异性引物，并根据SMARTer RACE 5’/3’Kit说明书扩增coleoptericin基因的3’端和5’端，随后将PCR扩增产物纯化后克隆到pMD19-T载体，并进行测序；将测序结果进行拼接获得coleoptericin完整的序列(图1)。
PCR扩增引物序列如下(5′-3′)：
P1:TCYCTCCARGGTGGWGCYCC
P2:GTTCCWCCMACRTGCCAAGTRGG
P3:CAATTTCCCTCAACCTTCCCAGCAAAATGGTG
P4:AAATGGTGGGTGGAAGGTGAGC
P5:CGAATAACCTTTCCCCATCCAG
P6:TAACCTTTCCCCATCCAGCATT
2、重组质粒的构建
以大麦虫cDNA为模板，PCR扩增coleoptericin蛋白的基因序列；其中PCR反应体系如下：2×Tap PCR Master Mix 25μL；10μmol/L上、下游引物各2μL；ddH2O 19μL；cDNA 2μL。PCR反应条件如下：95℃10min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min；采用Cycle-Pure Kit纯化PCR产物，用BamHⅠ、NotⅠ双酶切coleoptericin基因与原核表达载体pGEX 6p-1，将双酶切产物胶回收后，经T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物用转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在100μg/mL氨苄抗性的LB平板上培养16h，挑取大小均一合适的单菌落，提取质粒，PCR扩增coleoptericin基因验证质粒，将阳性质粒送往生工生物工程(上海)有限公司进行测序，鉴定正确的重组质粒命名为pGEX 6p-coleoptericin(图2)。
PCR扩增引物序列如下(5′-3′)：
P7:CGGGATCCTCTCTTCAAGGAGGAGCTCCCA
P8:TAAAGCGGCCGCTCACCACCTGTAGGTTCCTC
3、重组coleoptericin蛋白的表达
将pGEX 6p-coleoptericin质粒加入Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰浴静置30min后，置于42℃水浴锅中热激90s，并立即插入冰浴中静置2min。加入400μL不含抗生素的无菌LB培养基，37℃、150rpm振摇培养40min。吸取100μL菌液均匀涂布到含氨苄西林的固体LB培养基表面，置37℃培养箱中培养14-16h。挑取阳性转化子接种于LB培养基，37℃、200rpm振摇培养过夜，取50μL菌液接种于500mL液体LB培养基中，37℃、230rpm振摇培养至OD600＝0.6，加入IPTG至终浓度为0.8mM，16℃诱导表达20h。将转化有pGEX 6p-1空载体质粒的Rosetta(DE3)为对照。诱导表达结束后，4℃、8000g离心10min离心收集菌体，用预冷的0.01M PBS液重悬菌体后超声破碎(4℃，功率200W，超声4s、停4s，共30min)，4℃、8000g离心15min，收集上清(图3)。抗菌肽coleoptericin的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4、重组coleoptericin蛋白的纯化与鉴定
取上述上清液，采用GST亲和层析柱纯化目的蛋白，具体步骤如下：(1)使用10mL结合缓冲液润洗纯化柱(流速1mL/min)；(2)加入30mL重组蛋白上清，设置流速1mL/min，使得蛋白与GST柱充分结合，同时收集过柱后的液体；(3)加入20mL结合缓冲液洗去未结合的杂蛋白；(4)加入1mL Prescission Protease工作液，4℃孵育16h去掉GST标签；(5)加入0.01MPBS缓冲液，设置流速0.8mL/min，充分收集切下来的目的蛋白。(6)加入10mL洗脱液，设置流速0.8mL/min，洗脱亲和层析柱残留的蛋白。纯化的目的coleoptericin蛋白经Superdex 30进一步纯化后，通过质谱进行鉴定，验证蛋白表达(图4)。
实施例2抗菌肽coleoptericin抗菌活性测定
使用琼脂糖平板扩散法进行抗菌活性鉴定，具体步骤如下：(1)将K.PneumoniaeATCC700603在液体LB培养基中培养至对数生长期(OD600＝0.6)；(2)将菌液分别稀释至0.5麦氏标准单位(1.5×108CFU/mL)，取20μL菌液分别均匀涂布在LB平板上；(3)使用无菌打孔器在上述平皿上打孔，加入50μL(约500μg)纯化的coleoptericin蛋白。同时设置阳性对照血淋巴粗提物(1000μg/孔)和庆大霉素(40μg/孔)以及阴性对照(生理盐水)，37℃培养14-16h后观察抑菌效果。试验结果表明抗菌肽coleoptericin对肺炎克雷伯菌具有良好的抑菌效果(图5)。
实施例3抗菌肽coleoptericin抗菌谱及最小抑菌浓度测定
采取肉汤稀释法(CLSI)对coleoptericin抗菌谱及最小抑菌浓度进行测定，测定菌株为大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌CVCC1450、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肺炎克雷伯菌ATCC700603、溶血葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC33591，测定温度为37℃，pH为7.0。结果表明，coleoptericin对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和溶血葡萄球菌均有良好的抑制作用，最小抑菌浓度为0.5mg/mL；对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌无抑菌活性。结果如表1所示。
表1重组抗菌肽coleoptericin抗菌谱(MIC，mg/mL)
| 细菌名称 | MIC |
| E.coli ATCC25922 | 0.5 |
| E.coli CVCC1450 | 0.5 |
| S.aureus ATCC29213 | 1.0 |
| K.pneumoniae ATCC700603 | 0.5 |
| S.haepolyticus | 0.5 |
| MRSA ATCC33591 | NA |
注：NA表示无抗菌活性。
实施例4抗菌肽coleoptericin安全性评价
1、细胞毒性
在96孔板中每孔加入104个MAC-T细胞，培养细胞长至70％左右，弃去培养基，0.01M PBS清洗3次后，加入含有4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL抗菌肽coleoptericin的无抗培养基，于37℃培养12h(每个浓度重复3个孔)；随后向各孔中加入10μL CCK8溶液，37℃培养继续培养2h，使用酶标仪测定450nm处的吸光度。
2、溶血性
5mL脱纤维羊血3000g离心10min后去除血清，0.01M PBS清洗两次后加入5mL PBS重悬制备成100％红细胞悬浮液，取8μL该悬浮液与9.2mL的PBS混合得到8％红细胞悬浮液，置于4℃备用。96孔板先加入100μL含有4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL coleoptericin的PBS，每种浓度重复3个孔；然后向每孔中加入100μL 8％红细胞悬浮液，37℃孵育1h后，离心，吸取上清液100μL，测定OD576nm。试验同时设置PBS阴性对照(N)和TritonX-100阳性对照(P)，最终溶血率＝(待测液体OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100％。
试验结果表明(图6)，抗菌蛋白coleoptericin在最高浓度2mg/mL的条件下依然没有溶血性和细胞毒性，说明抗菌肽coleoptericin安全性良好。
实施例5抗菌肽coleoptericin稳定性检测
1、热稳定性：将重组coleoptericin溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，分别置于室温、60℃、80℃、100℃的水浴中加热1h，及121℃高温灭菌处理15min后冷却至室温。以E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213为指示菌，利用最小抑菌浓度法检测其抗菌活性。以室温下的样品作为对照，考察不同温度处理后coleoptericin残余的抗菌活性。指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213。试验结果表明抗菌肽coleoptericin在37℃、60℃、80℃中保持良好的抗菌活性，而在100℃和121℃丧失了抗菌活性(表2)。
表2不同温度处理对coleoptericin抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
| 温度 | E.coli ATCC25922 | S.aureus ATCC29213 |
| 37℃ | 0.5 | 1.0 |
| 60℃ | 0.5 | 1.0 |
| 80℃ | 0.5 | 1.0 |
| 100℃ | NA | NA |
| 121℃ | NA | NA |
2、酸碱稳定性：将重组coleoptericin溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，利用HCl和NaOH将其pH调节至2-12，37℃孵育1h后将各管pH调节回pH＝7并定容至相同的体积。以E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213为指示菌，利用最小抑菌浓度法检测其抗菌活性。以未处理的样品作为对照，考察不同酸碱性处理后coleoptericin残余的抗菌活性。试验结果表明抗菌肽coleoptericin在pH＝6-8中依然保持良好的抗菌活性(表3)。
表3不同酸碱度对coleoptericin抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
| pH值 | E.coli ATCC25922 | S.aureus ATCC29213 |
| 2 | 1.0 | 2.0 |
| 3 | 1.0 | 2.0 |
| 4 | 1.0 | 2.0 |
| 5 | 1.0 | 2.0 |
| 6 | 0.5 | 1.0 |
| 7 | 0.5 | 1.0 |
| 8 | 0.5 | 1.0 |
| 9 | 1.0 | 2.0 |
| 10 | 1.0 | 2.0 |
| 11 | 1.0 | 2.0 |
| 12 | NA | NA |
3、蛋白酶稳定性：将重组coleoptericin溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液。平均分成若干份后，分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K，使酶的终浓度为2mg/mL。将混合物至于37℃孵育1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察不同蛋白酶对coleoptericin活性的影响，同时设置蛋白酶单独作用组以及以未处理的样品组作为对照。指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213。试验结果表明抗菌肽coleoptericin在用蛋白酶处理后完全丧失抗菌活性(表4)。
表4不同蛋白酶对coleoptericin抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
| 蛋白酶 | E.coli ATCC25922 | S.aureus ATCC29213 |
| 胃蛋白酶 | NA | NA |
| 胰蛋白酶 | NA | NA |
| 木瓜蛋白酶 | NA | NA |
| α-糜蛋白酶 | NA | NA |
| 蛋白酶K | NA | NA |
4、血清稳定性：将重组coleoptericin溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，加入胎牛血清使其终浓度为10％。将混合物至于37℃孵育1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察血清对coleoptericin活性的影响。以未经血清处理的coleoptericin做对照，指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213。结果表明抗菌肽coleoptericin在血清中依旧保持良好抗菌活性(表5)。
表5血清对coleoptericin抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
| 抗菌肽 | E.coli ATCC25922 | S.aureus ATCC29213 |
| 血清处理组 | 0.5 | 1.0 |
| 未处理组 | 0.5 | 1.0 |
5、紫外照射稳定性：将重组coleoptericin溶于生理盐水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，并置于30W紫外灯下25cm处照射1h，以MIC法测定其抗菌活性，考察紫外照射对coleoptericin活性的影响。以未经过紫外照射处理的coleoptericin做对照，指示菌分别为E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC29213。试验结果表明抗菌肽coleoptericin在紫外照射后依然保持良好抗菌活性(表6)。
表6紫外照射对coleoptericin抗菌活力的影响(MIC，mg/mL)
| 抗菌肽 | E.coli ATCC25922 | S.aureus ATCC29213 |
| 紫外照射组 | 0.5 | 1.0 |
| 未处理组 | 0.5 | 1.0 |
实施例6抗菌肽coleoptericin在治疗小鼠克雷伯菌性乳腺炎中的应用
将32只哺乳3天的CD-1小鼠，平均分成4组，每组8只小鼠。各组分别为：生理盐水组、攻菌组、coleoptericin治疗组、庆大霉素治疗组。小鼠麻醉后，仰卧位固定，第四对乳头消毒后，用眼科剪轻轻减去上面的角质，生理盐水组注射25μL生理盐水，剩余4组注射25μL浓度为4×107CFU/mL的肺炎克雷伯菌ATCC700603悬浮液。3h后，coleoptericin治疗组注射25μL浓度为1mg/L的抗菌肽coleoptericin，庆大霉素治疗组注射25μL浓度为40μg/mL的庆大霉素，攻菌组和生理盐水注射25μL生理盐水。在首次治疗12h后，加强治疗一次。12h后，将所有小鼠安乐死，采取乳腺组织，一部分匀浆、混匀，通过平板计数法计算各组乳腺组织中细菌载量。一部分乳腺在4％甲醛溶液固定后制成组织切片，H.E.染色后观察乳腺组织病理学变化。试验结果表明，抗菌肽coleoptericin能有效的降低小鼠乳腺组织中的细菌数，缓解肺炎克雷伯菌造成的乳腺损伤(图7)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 抗菌肽coleoptericin及其原核表达方法与应用
<130> KHP211124715.4
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 大麦虫(Zophobas atratus)
<400> 1
atgtatgcca aaatcgtaat tctcctagtc gccttagctg ccgtctctgc cataccttac 60
tccgagtacc agtacgaccc cgaagtccaa gacgtttacg aggaattgtc tcccgaagag 120
atctatgaaa tccatcgcat caggcggtct cttcaaggag gagctcccaa tttccctcaa 180
ccttcccagc aaaatggtgg gtggaaggtg agccctgatc tgggaaggga cgataaagga 240
aacaccagag gccaaattga aattcaaaac aaaggaaaag accacgactt taatgctgga 300
tggggaaagg ttattcgagg acccaacaag gccaaaccca cttggcacgt tggaggaacc 360
tacaggtggt ga 372
<210> 2
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcttcaag gaggagctcc caatttccct caaccttccc agcaaaatgg tgggtggaag 60
gtgagccctg atctgggaag ggacgataaa ggaaacacca gaggccaaat tgaaattcaa 120
aacaaaggaa aagaccacga ctttaatgct ggatggggaa aggttattcg aggacccaac 180
aaggccaaac ccacttggca cgttggagga acctacaggt ggtga 225
<210> 3
<211> 74
<212> PRT
<213> 大麦虫(Zophobas atratus)
<400> 3
Ser Leu Gln Gly Gly Ala Pro Asn Phe Pro Gln Pro Ser Gln Gln Asn
1 5 10 15
Gly Gly Trp Lys Val Ser Pro Asp Leu Gly Arg Asp Asp Lys Gly Asn
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Ile Glu Ile Gln Asn Lys Gly Lys Asp His Asp Phe
35 40 45
Asn Ala Gly Trp Gly Lys Val Ile Arg Gly Pro Asn Lys Ala Lys Pro
50 55 60
Thr Trp His Val Gly Gly Thr Tyr Arg Trp
65 70
Claims (10)
1.抗菌肽coleoptericin，其特征在于，所述抗菌肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述抗菌肽的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
4.抗菌肽coleoptericin的原核表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过RACE PCR方法从大麦虫中扩增得到抗菌肽coleoptericin的编码基因；
(2)构建重组载体：将所述编码基因插入到原核表达载体中，构建得到包含所述编码基因的重组载体；
(3)表达抗菌肽coleoptericin：将重组载体转化至大肠杆菌，利用IPTG诱导后收集包含抗菌肽coleoptericin的细菌；
其中，抗菌肽coleoptericin的定义同权利要求1中所述。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用PBS处理细菌悬液，超声破碎后离心并收上清液；采用GST柱亲和层析和Superdex30凝胶过滤层析纯化所述上清液，获得纯化的抗菌肽coleoptericin。
6.权利要求1所述抗菌肽的以下任一应用：
1)用于抑制细菌；
2)用于制备抑菌剂；
3)用于制备防腐剂；
4)用于制备抗菌药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌包括肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)。
8.抗菌药物，其特征在于，有效成分为权利要求1所述的抗菌肽。
9.抑菌剂或防腐剂，其特征在于，有效成分为权利要求1所述的抗菌肽。
10.权利要求1所述抗菌肽在制备用于治疗或减轻由肺炎克雷伯菌导致的乳腺炎的药物中的应用。
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