CN116249542A - 用于预防或治疗阿尔茨海默痴呆症的肽组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的肽组合物。根据本发明的肽或其盐替代物表现出诸如抑制LPS介导的细胞因子产生、抑制LPS诱导的神经炎症、改善认知障碍、抑制β淀粉样蛋白或tau蛋白聚集和抑制神经元损失的效果。该多肽或其盐替代物可渗透血脑屏障，因此，有望有效地用于预防或治疗阿尔茨海默氏症痴呆症。

Description

用于预防或治疗阿尔茨海默痴呆症的肽组合物

技术领域

本发明涉及一种用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的肽组合物。

本申请要求2020年8月27日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号No.10-2020-0108861的优先权和权益，该申请的说明书和附图中公开的所有内容均并入本申请。

背景技术

痴呆是一种应该区别于正常衰老的病理现象，根据其病因可分类为阿尔茨海默氏痴呆、血管性痴呆和其他因酗酒、外伤或帕金森病后遗症等类型的痴呆。

其中，阿尔茨海默氏痴呆症的发病机制尚不清楚，但已提出β-淀粉样蛋白的毒性是一个重要原因，这是一种神经毒性蛋白。已知这种物质是由一种淀粉样前体蛋白(APP)的不正确代谢产生的，据报道，APP的正常代谢产物具有神经保护作用。最近使用基因工程方法的研究发现，有毒的蛋白质，如β-淀粉样蛋白，在细胞和血管中积累，这对神经细胞是有毒的，导致大脑功能受损。

尽管由于人口老龄化，阿尔茨海默氏痴呆症患者的数量明显增加，该疾病也迅速成为一个有待解决的社会问题，但几乎没有能够有效预防或治疗该疾病的食品原料或药物。痴呆症是一种困扰10％或更多的65岁以上老年人口的神经系统疾病，据报道，50％或更多的痴呆症是阿尔茨海默氏症，并且2017年，老年人口比例超过700万，占总人口的14％，预计2060年将迅速增加到41.0％。此外，截至2017年，痴呆症患者人数已达72.4万，随着人口老龄化的发展，预计2040年将增至168万，2050年将增至212.7万或更多。

然而，目前对痴呆症的治疗方法不是为了解决根本原因而采取的措施，而只是为了缓解症状，需要开发一种抑制、延缓或治疗痴呆症发病的材料。

发明内容

【技术问题】

由于为了开发预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药剂的研究，本发明人开发了一种肽，其表现出诸如抑制脂多糖(LPS)介导的细胞因子产生、抑制神经炎症、改善认知障碍、抑制β-淀粉样蛋白或Tau蛋白和抑制神经元损失等作用，从而在此基础上完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防、治疗或改善阿尔茨海默病痴呆症的肽组合物。

然而，本发明旨在解决的技术问题并不限于上述提到的技术问题，其他没有提到的技术问题将由本发明所属领域的普通技术人员从以下描述中清楚地了解。

【技术方案】

为了达到上述目的，本发明提供了一种预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物组合物，其包含由以下序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分：

[通式]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

在通式中，

n是0或1；

L是亮氨酸；

V是缬氨酸；

R是精氨酸；

X1是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；

X2是甘氨酸(G)或精氨酸(R)；

X3是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；

X4是丙氨酸(A)或亮氨酸(L)；

X5是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)；

X6是酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)；以及

X7是天冬氨酸(D)或精氨酸(R)，

前提条件是在通式中，不包括由K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D的序列代表的多肽。

此外，本发明还提供了一种用于预防或改善阿尔茨海默氏痴呆症的食品组合物，其包括由以下序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分：

[通式]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

在通式中，

n是0或1；

L是亮氨酸；

V是缬氨酸；

R是精氨酸；

X1是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；

X2是甘氨酸(G)或精氨酸(R)；

X3是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；

X4是丙氨酸(A)或亮氨酸(L)；

X5是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)；

X6是酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)；以及

X7是天冬氨酸(D)或精氨酸(R)，

前提条件是在通式中，不包括由K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D的序列代表的多肽。

作为本发明的一个示例性实施方案，该食品组合物可以是健康功能食品组合物，但不限于此。

作为本发明的一个示例性实施方案，该多肽可以是由以下氨基酸组成的多肽，但不限于此。

在通式中，

n是0；

X1是赖氨酸(K)；

X2是精氨酸(R)；

X3是赖氨酸(K)；

X4是亮氨酸(L)；

X5是精氨酸(R)；

X6是酪氨酸(Y)，以及

X7是精氨酸(R)。

作为本发明的另一个示例性实施方案，该多肽可以是L-型、D-型、拟肽(包括类肽)或非天然氨基酸，但不限于此。

作为本发明的另一个示例性实施方案，该多肽的末端可以被烷基化、PEG化或酰胺化，但不限于此。

作为本发明的又一个示例性实施方案，该多肽可具有添加到C端的胺基(NH₂)，但不限于此。

作为本发明的又一示例性实施方案，该多肽的盐替代物可以是乙酸盐替代物，但不限于此。

作为本发明的又一示例性实施方案，该多肽或其盐替代物可具有以下特征中的一个或多个特征，但不限于此：

抑制脂多糖(LPS)介导的细胞因子产生；

抑制神经炎症；

改善认知障碍；

抑制β-淀粉样蛋白或Tau蛋白的聚集；以及

抑制神经元损失。

作为本发明的又一示例性实施方案，该多肽或其盐替代物可通过血脑屏障，但不限于此。

此外，本发明提供了一种预防或治疗阿尔茨海默氏症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用包括该多肽或其盐替代物作为活性成分的组合物。

此外，本发明提供了一种包括该多肽或其盐替代物的组合物作为活性成分用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的用途。

此外，本发明提供了一种该多肽或其盐替代物用于制备治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物的用途。

【有益效果】

根据本发明的肽或其盐替代物表现出诸如抑制LPS介导的细胞因子产生，抑制LPS诱导的神经炎症，改善认知障碍，抑制β淀粉样蛋白或Tau蛋白聚集，以及抑制神经元损失的效果。该多肽或其盐取代物可通过血脑屏障，因此有望有效地用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症。

附图说明

图1A是示出根据本发明的一个示例性实施方案通过免疫组织化学染色确认患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠大脑半球中LPS(+)区域的结果的一组视图。

图1B是示出根据本发明的一个示例性实施方案通过免疫组织化学染色确认，LPS在患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠大脑二级运动皮层(M2)中的表达的结果的视图。

图1C是根据本发明的一个示例性实施方案通过免疫组化染色确认LPS在阿尔茨海默氏痴呆症小鼠海马体中的表达的结果的视图。

图2是根据本发明的一个示例性实施方案，按临床阶段确认阿尔茨海默氏症患者的血液和脑脊液(CSF)样本中的LPS水平的视图。

图3是根据本发明的一个示例性实施方案，通过施用DD-S052肽来确认IL-1β和TNF-α的mRNA表达的视图。

图4A是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认DD-S052肽对野生型小鼠大脑中LPS诱导的神经炎症的效果的实验过程的视图。

图4B是示出根据本发明的一个示例性实施方案，对Iba-1进行免疫组织化学染色以便确认野生型小鼠海马体中的小胶质细胞的结果的视图。

图4C是示出根据本发明的一个示例性实施方案，对野生型小鼠海马体中Iba-1阳性细胞数量进行量化的视图。

图4D是示出根据本发明的一个示例性实施方案，对Iba-1进行免疫组织化学染色以确认野生型小鼠大脑中脑黑质致密部的小胶质细胞的结果的视图。

图5A是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认DD-S052肽对阿尔茨海默氏痴呆症小鼠大脑中LPS诱导的神经炎症的效果的实验过程的视图。

图5B是示出根据本发明的一个示例性实施方案，对Iba-1进行免疫组织化学染色，以便确认阿尔茨海默氏痴呆症小鼠大脑中的小胶质细胞的结果的视图。

图6A是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认DD-S052肽对阿尔茨海默氏痴呆症小鼠的认知障碍和阿尔茨海默氏痴呆症相关病理的效果的实验过程的视图。

图6B是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认通过在患有阿尔茨海默氏症痴呆症的小鼠中施用DD-S052肽进行自发交替(左视图)和全臂进入(右视图)的一组视图。

图6C是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认通过在患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠中施用DD-S052肽抑制β-淀粉样蛋白积累的效果的一组视图。

图6D是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认通过在患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠中施用DD-S052肽抑制小胶质增生的效果的一组视图。

图6E是示出根据本发明的一个示例性实施方案，确认通过在患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠中施用DD-S052肽抑制神经元损失的效果的一组视图。

图7是根据本发明的一个示例性实施方案，确认通过在患有阿尔茨海默氏痴呆症的小鼠施用DD-S052和PEG化的DD-S052肽抑制Tau蛋白聚集的效果的一组视图。

图8A是示出根据本发明的一个示例性实施方案，通过液相色谱-质谱法分析DD-S052肽的结果的视图。

图8B是示出根据本发明一个实施方案，通过液相色谱-质谱法用DD-S052肽分析人工膜渗透试验的结果的一组视图。

图8C是示出根据本发明的一个示例性实施方案，DD-S052的血管-脑屏障渗透程度的视图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物组合物，其包括由以下序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分：

[通式]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

在通式中，

n是0或1；

L是亮氨酸；

V是缬氨酸；

R是精氨酸；

X1是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；

X2是甘氨酸(G)或精氨酸(R)；

X3是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；

X4是丙氨酸(A)或亮氨酸(L)；

X5是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)；

X6是酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)；以及

X7是天冬氨酸(D)或精氨酸(R)，

前提条件是在通式中，不包括由K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D的序列代表的多肽。

另外，本发明提供了一种用于预防或改善阿尔茨海默氏痴呆症的食品组合物，其包括由上述序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分。

另外，本发明提供了一种预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的方法，该方法包括将包括该多肽或其盐替代物作为活性成分的组合物施用于对其有需要的受试者。

此外，本发明提供了一种包括该多肽或其盐替代物作为活性成分的组合物用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的用途。

此外，本发明提供了一种该多肽或其盐替代物用于制备治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物的用途。

根据本发明的一个示例性实施方案，该多肽可以是由以下氨基酸组成的多肽，但不限于此。

在通式中，

n是0；

X1是赖氨酸(K)；

X2是精氨酸(R)；

X3是赖氨酸(K)；

X4是亮氨酸(L)；

X5是精氨酸(R)；

X6是酪氨酸(Y)，以及

X7是精氨酸(R)。

如本文所用，“多肽”是指通过肽键使氨基酸残基彼此键合而形成的直链分子。本发明的多肽可以通过本领域已知的化学合成方法(例如，固相合成技术)以及分子生物学方法(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,et al.,Solid PhasePeptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co:Rockford,111(1984))来制备。

此外，本发明的多肽的范围可包括具有生物功能的等效物，其氨基酸序列的变化可发挥与本发明的多肽相当的生物活性。氨基酸序列的这种变化可以基于氨基酸的侧链取代基在诸如疏水性、亲水性、电荷和尺寸等方面的相对的相似性。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析表明，精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小相似；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形状相似。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被认为是生物功能上的等效物。

在引入变化时，可以考虑氨基酸的疏水性指数。根据其疏水性和电荷，每个氨基酸都指定一个疏水性指数。此外，众所周知具有相似亲水性值的氨基酸之间的替换导致肽具有等效生物活性。

肽中不完全改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最通常发生交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间的交换。

在考虑到具有上述生物等效活性的变体时，本发明的多肽也被解释为包括显示显著同一性的序列。上述显著同一性可指与本发明的序列不同的随机序列，并且当它被比对以尽可能地对应于本发明的序列，并使用本领域通常使用的算法分析该比对序列时，与本发明的序列具有至少80％的同源性、90％的同源性或95％的同源性。用于序列比较的比对方法在本领域是已知的(Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；Pearson etal.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994))。

在本发明的一个示例性实施方案中，该多肽可以是L-型、D-型、包括类肽的拟肽，或非天然氨基酸。

该D-型多肽是指作为具有与L-型多肽相同氨基酸序列的对映体的异构型多肽。

在本发明的一个示例性实施方案中，根据本发明的序列通式所代表的多肽可具有添加C端的胺基(NH₂)，但不限于此。

将胺基(NH₂)添加到多肽的C端可根据本领域已知的各种方法。

此外，其盐(或盐替代物)可包括在本发明多肽的范围内。

该盐包括，例如，由游离酸和药学上可接受的金属盐形成的酸加成盐。

合适的酸的示例包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、甘醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、葡萄糖酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等等。酸加成盐可通过典型的方法制备，例如，将化合物溶解在过量的酸水溶液中，并使用水溶性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈沉淀该盐。此外，酸加成盐可以通过在水中加热等摩尔量的化合物和酸或酒精，然后蒸发该混合物以干燥该混合物，或吸滤沉淀的盐来制备。

衍生自合适的碱的盐可以包括碱金属，如钠和钾，碱土金属，如镁，铵等，但不限于此。碱金属盐或碱土金属盐可以通过以下方式获得，例如，将化合物溶解在过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤不溶性化合物盐，蒸发滤液，并干燥所得产品。在这种情况下，从制药的角度来看，特别适合制备钠盐、钾盐或钙盐作为金属盐，并且相应的银盐也可以通过碱金属盐或碱土金属盐与合适的银盐(例如硝酸银)反应得到。

作为上述多肽的盐的一部分，本发明提供了该多肽的乙酸盐。

更具体地说，提供的是根据本发明的多肽的三氟乙酸(TFA)的乙酸盐替代物。

根据本发明的一个示例性实施方案，本发明的肽(KLRVKLRRYLR-NH₂(AcOH)，SEQID NO：1，以下简称DD-S052)作为具有与FP13-NH₂(SEQ ID NO：5)相同氨基酸序列的异构型多肽提供，该多肽基于FP3和LPS结合模型设计，以增加FP3(SEQ ID NO：4)的残基序列的LPS的相互作用，其中在FP1(SEQ ID NO：3)中具有点突变，加强与S的相互作用，并且在本发明的肽DD-S052中，(AcOH)是指在距离该肽N端的第九个氨基酸处的三氟乙酸(TFA)被乙酸盐取代(见实施例2)。

在本发明中，根据本发明的序列通式代表的多肽的末端可以被烷基化、PEG化或酰胺化，但不限于此。

在本发明的一个示例性实施方案中，DD-S052P(SEQ ID NO：2)是通过将根据本发明的多肽中的DD-S052(SEQ ID NO：1)的N端PEG化提供的。尽管不限于此，但根据本发明的多肽可以与Fmoc-NH-PEG2-CH₂COOH反应进行PEG化，在这种情况下，聚乙二醇的分子量(Mw)为385.4Da。

本领域的技术人员可以根据所选多肽调整PEG化的条件，并且PEG化的方法可根据本领域已知的各种方法。

对于烷基化或酰胺化，本领域技术人员也可根据所选多肽调整烷基化或酰胺化的条件，并且烷基化或酰胺化的方法可根据本领域已知的各种方法。

如上所述，本发明提供了：由序列通式代表的多肽；为L型、D型、包括类肽的拟肽，或非天然氨基酸的多肽；具有添加到C端加的胺基(NH₂)的多肽的乙酸盐；或末端被烷基化、PEG化或氨基化的多肽。

在本发明中，该多肽或其盐替代物可具有以下特征中的一个或多个特征，但不限于此：

抑制脂多糖(LPS)介导的细胞因子产生；

抑制神经炎症；

改善认知障碍；

抑制β-淀粉样蛋白或Tau蛋白的聚集；以及

抑制神经元损失。

在本发明的一个示例性实施方案中，证实脂多糖(LPS)阳性细胞在阿尔茨海默氏痴呆症小鼠模型的大脑中随年龄增长而增加，并证实LPS在3个月和5.5个月龄小鼠的小胶质细胞中表达，以及在11个月龄小鼠的神经元中表达。此外，证实LPS(+)细胞在大脑二级运动皮层中大量表达，并主要分布在海马体中齿状回的多形层中(见实施例1)。

在本发明的一个示例性实施方案中，由于按临床阶段确认了阿尔茨海默氏痴呆症患者的血液和脑脊液(CSF)样本中的LPS水平，证实了随着阿尔茨海默氏痴呆症的进展，测得的LPS水平更高(见实施例2)。

在本发明的一个示例性实施方案中，确认了根据本发明的多肽的以下特征，但不限于这些特征。

在本发明的一个示例性实施方案中，证实了根据本发明的多肽抑制由脂多糖(LPS)诱导的细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达(见实施例4)。

在本发明的一个示例性实施方案中，通过免疫组织化学方法证实，根据本发明的多肽抑制了LPS诱导的野生型小鼠大脑海马体和中脑黑质致密部的小胶质增生，从而表现出对神经炎症的抑制作用(见实施例5)。

在本发明的一个示例性实施方案中，通过免疫组织化学方法证实，根据本发明的多肽对阿尔茨海默氏痴呆症小鼠大脑中由LPS诱导的神经炎症表现出抑制作用(见实施例6)。

在本发明的一个示例性实施方案中，通过细胞免疫荧光染色证实，根据本发明的多肽改善了认知障碍并抑制了阿尔茨海默氏痴呆症相关的病变，如β-淀粉样蛋白积累、小胶质增生和神经元损失(见实施例7)。

在本发明的一个示例性实施方案中，证实根据本发明的多肽和PEG化的多肽表现出抑制Tau蛋白聚集的作用(见实施例8)。

在本发明的一个示例性实施方案中，证实了根据本发明的多肽穿透血脑屏障，并且此时的渗透性对应于中值(见实施例9)。

在本发明中，"阿尔茨海默氏痴呆症"是一种退行性脑部疾病，其特征在于主要在65岁以上的老年人中逐渐丧失记忆和认知障碍。在病理层面，β-淀粉样蛋白沉积和神经纤维Tau蛋白的缠结被公认为典型的病因。阿尔茨海默氏痴呆症在其发展过程中常伴有心理行为症状，如人格改变、激动、抑郁、妄想、幻觉、攻击性增加和睡眠障碍，以及认知能力下降，在阿尔茨海默氏痴呆症末期，出现神经系统障碍，如僵硬和步态异常，以及生理上并发症，如肠和膀胱失禁、感染和褥疮。在显微镜下检查阿尔茨海默氏痴呆症患者的脑组织时，可以观察到神经元斑块和神经纤维缠结等特征性病变，在可视观察中可以看到由于神经元损失而导致的整体脑萎缩。这样的脑部病理结果在疾病早期主要局限于海马和内嗅皮层区域，这是负责记忆的主要脑区，但逐渐通过顶叶、额叶等扩散到整个大脑。根据受累脑部病理部位的进展，记忆力下降主要出现在早期阶段，随着阿尔茨海默氏痴呆症的发展，临床症状变化并且越来越严重，同时呈现出渐进的过程。

如本文所用，“小胶质细胞”是指在中枢神经系统中执行初级免疫功能的细胞，当从外部引入或内部产生的毒素存在，同时保持细长的分支和薄的细胞主体的形状时，小胶质细胞转变为具有粗短分支和厚细胞主体的活化形状，以便保护神经细胞免受这些毒素的伤害。与正常状态下的小胶质细胞不同，活化的小胶质细胞激活吞噬作用，增殖细胞，并通过表达基因(诸如TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子、趋化因子、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2))产生炎症介质。虽然小胶质细胞的激活有去除受损细胞和保护神经细胞免受外界细菌和病毒入侵的一面，但也有另一面，即由iNOS产生的一氧化氮和由COX-2、TNF-α等产生的前列腺素对神经细胞表现出毒性，所以小胶质细胞的激活会加剧对神经细胞的损害。

在本发明中，“神经炎症”包括一系列复杂的细胞反应，涉及小胶质细胞和星形胶质细胞以及细胞因子、趋化因子、补体蛋白、急性阶段蛋白、氧化损伤和相关分子过程的激活，并且这些事件可能对神经元功能产生不利影响，导致神经元损伤、额外的胶质激活，并最终导致神经变性。

在本发明中，“脂多糖(LPS)”由脂质A、核心多糖、O型多糖侧链组成。脂多糖具有热稳定性并表现出很强的抗原性。脂多糖形成多个复合体，其基本单元的分子量为10kDa，大小不一，最高可达10,000kDa，并且在化学上是一种两亲复合物。脂多糖引起动物的炎症反应，并且大多存在于例如沙门氏菌和大肠杆菌的革兰氏阴性细菌的外膜。在脂多糖中，引起这种炎症反应的有毒部分是脂质部分，并被称为内毒素。当这种内毒素进入人体时，会出现发烧、白细胞计数的改变、血管凝集、肿瘤坏死、低血压、休克等现象，此外，内毒素还会引起各种细胞因子的产生，如IL-1、IL-6、IL-8和TNF，激活免疫系统补体，激活血液凝固作用等，并充当B细胞的有丝分裂剂来增加多克隆性分化和B细胞增殖，以及产生IgM和IgG抗体。

本发明的药物组合物还可包括适当的载体、赋形剂和稀释剂，它们通常用于制备药物组合物。例如，赋形剂可以是选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、涂膜材料和控释添加剂组成的组中的一者或多者。

根据本发明的药物组合物可以通过配制成外部制剂的形式使用，如粉末、颗粒、缓释颗粒、肠溶颗粒、液体、洗眼液、口服液、乳剂、悬浮液、酊剂、含片、芳香水、柠檬饮品、片剂、缓释片、肠溶片、舌下片、硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、肠溶胶囊、丸剂、滴剂、软性提取剂、干性提取剂、液体提取剂、注射剂、胶囊、灌注液、贴剂、洗剂、膏剂、喷雾剂、吸入剂、贴片、灭菌注射液或气雾剂，而外用制剂可以有诸如乳膏、凝胶、贴片、喷雾剂、软膏、贴剂、洗剂、油膏、膏剂或敷料的配方。

可包括在根据本发明的组合物中的载体、赋形剂或稀释剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、刺槐橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

在制备药物组合物时，使用稀释剂或赋形剂，如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。

作为根据本发明的片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂和含片的添加剂，可以使用赋形剂诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、D-甘露醇、沉淀碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸一氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、纯羊毛脂、微晶纤维素、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、高岭土、尿素、胶体硅胶、羟丙基淀粉、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMC 1928、HPMC 2208、HPMC 2906、HPMC 2910、丙二醇、酪蛋白、乳酸钙以及Primojel；和粘合剂，如明胶、阿拉伯胶、乙醇、琼脂粉、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、葡萄糖、纯水、酪蛋白酸钠、甘油、硬脂酸、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素钠、甲基纤维素、微晶纤维素、糊精、羟纤维素、羟丙基淀粉、羟甲基纤维素、精制贝壳粉、淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，并且可使用崩解剂，诸如羟丙基甲基纤维素、玉米淀粉、琼脂粉、甲基纤维素、膨润土、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙、柠檬酸钙、月桂醇硫酸钠、硅酸酐、1-羟丙基纤维素、葡聚糖、离子交换树脂、聚醋酸乙烯、经甲醛处理的酪蛋白和明胶、海藻酸、淀粉、瓜尔胶、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、胶凝淀粉、阿拉伯胶、直链淀粉、果胶、聚磷酸钠、乙基纤维素、蔗糖、硅酸铝镁、D-山梨醇溶液和轻质无水硅酸；和润滑剂，如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、氢化植物油、滑石粉、狼毒粉、高岭土、凡士林、硬脂酸钠、可可脂、水杨酸钠、水杨酸镁、聚乙二醇(PEG)4000、PEG6000、液体石蜡、氢化大豆油(Lubriwax)、硬脂酸铝、硬脂酸锌、月桂醇硫酸钠、氧化镁、Macrogol、合成硅酸铝、硅酸酐、高级脂肪酸、高级醇、硅油、石蜡油、聚乙二醇脂肪酸醚、淀粉、氯化钠、醋酸钠、油酸钠、DL-亮氨酸和轻质无水硅酸。

作为根据本发明的液体制剂的添加剂，可以使用水、稀盐酸、稀硫酸、柠檬酸钠、单硬脂酸蔗糖、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温酯)、聚氧乙烯单烷基醚、羊毛脂醚、羊毛脂酯、乙酸、盐酸、氨水、碳酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、丙胺、聚乙烯基吡咯烷酮、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠等。

在根据本发明的糖浆中，可以使用蔗糖、其他糖或甜味剂等的溶液，根据需要还可以使用香料、着色剂、防腐剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂、增稠剂等。

根据本发明的乳剂可使用纯水，根据需要可使用乳化剂、防腐剂、稳定剂、香料等。

在根据本发明的悬浮剂中，可以使用悬浮剂，诸如阿拉伯胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMC1828、HPMC 2906和HPMC 2910等，并且根据需要，可以使用表面活性剂、防腐剂、着色剂和香料。

根据本发明的注射液可包括：溶剂，如注射用蒸馏水、0.9％氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖+氯化钠注射液、PEG、乳酸林格氏注射液、乙醇、丙二醇、非挥发性油-芝麻油、棉籽油、花生油、玉米油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苯；增溶助剂，如苯甲酸钠、水杨酸钠、乙酸钠、尿素、尿烷、单乙基乙酰胺、丁唑醇、丙二醇、吐温、尼古丁烟酰胺、己胺和二甲基乙酰胺；缓冲剂，如弱酸及其盐(乙酸和乙酸钠)、弱碱及其盐(氨和乙酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨和树胶；等渗剂，如氯化钠；稳定剂，如亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、二氧化碳气体、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸钠(Na₂SO₃)、氮气(N₂)和乙二胺四乙酸；硫酸化剂，如0.1％的亚硫酸氢钠、甲醛磺酸钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠和丙酮亚硫酸氢钠；镇痛剂，如苯甲醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖和葡萄糖酸钙；以及悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、吐温80和单硬脂酸铝。

在根据本发明的栓剂中，可以使用基质，如可可油脂、羊毛脂、Witepsol、聚乙二醇、甘油明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸和油酸的混合物、Subanal、棉籽油、花生油、棕榈油、可可油脂+胆固醇、卵磷脂、蜡质、甘油单硬脂酸酯、吐温或Span、Imhausen、monolen(单硬脂酸丙二醇酯)、甘油、Adeps solidus、Butyrum Tego-G、Cebes Pharma 16、Hexalide Base95、Cotomar、Hydroxote SP、S-70-XXA、S-70-XX75(S-70-XX95)、Hydrokote25、Hydrokote 711、idropostal、Massa estrarium(A、AS、B、C、D、E、I、T)、Massa-MF、Masupol、Masupol-15、Neosupostal-ene、Paramound-B、Suposhiro(OSI、OSIX、A、B、C、D、H、L)、IV型栓剂基质(AB、B、A、BC、BBG、E、BGF、C、D、299)、Supostal(N、Es)、Wecobee(W、R、S、M、Fs)和tegester甘油三酯基质(TG-95、MA、57)。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等，并且固体制剂通过将至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等与提取物混合来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。

用于口服给药的液体制剂对应于悬浮液、内服液体、乳剂、糖浆等，液体制剂除了水和液体石蜡这些简单的常用稀释剂外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香味剂、防腐剂等。用于肠外给药的制剂的示例包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。

根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理有益效果/风险比来治疗疾病的量，有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物等因素以及医学领域公知的其它因素来确定。

根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂联合给药，可以与相关领域中的治疗剂依次或同时给药，可以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以能获得最大效果且无任何副作用的最小量施用该组合物，该量可由本发明所属领域的普通技术人员容易地确定。

本发明的药物组合物可以通过各种途径施用于对其有需要的受试者。所有的给药方法都可以预期，但药物组合物可以通过例如口服给药、皮下注射、腹膜给药、静脉注射、肌肉注射、脊柱旁空间(硬膜内)注射、舌下给药、口腔给药、直肠内插入、阴道内注射、眼部给药、耳部给药、鼻腔给药、吸入、经口或鼻喷洒、皮肤给药、经皮给药等方式给药。

本发明的药物组合物由作为活性成分的药物类型以及各种相关因素决定，如要治疗的疾病、给药途径、病人的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度。

当本发明的多肽或其盐替代物作为食品添加剂使用时，多肽可按原样加入，或与另一种食品或其他食品成分一起使用，并可根据典型方法适当使用。混合的活性成分的量可根据使用目的(预防、保健或治疗性处理)适当地确定。一般来说，在制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的多肽的添加量可以为的15重量％或更少，或10重量％或更少。然而，在出于健康和卫生的目的或出于控制健康的目的而长期摄入的情况下，该量可以等于或小于上述范围，由于在安全方面没有问题，有效成分的使用量可以等于或大于上述范围。

食品的类型没有特别限制。可以添加该材料的食品的例子包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糕点、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、乳制品包括冰淇淋、各种汤、饮料、茶、饮料、酒精饮料、复合维生素等，并包括典型意义上的所有健康功能食品。

根据本发明的健康饮料组合物可以包含各种风味剂或天然碳水化合物等，作为典型饮料的附加成分。上述天然碳水化合物可以是单糖，如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇。作为甜味剂，可以使用天然甜味剂如索马甜和甜叶菊提取物，合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜等等。天然碳水化合物的比例一般为每100毫升本发明的组合物约0.01g至0.20g，或约0.04g至0.10g。

除上述成分外，本发明组合物还可含有各种营养素、维生素、电解质、香料、着色剂、果胶酸及其盐类、藻酸及其盐类、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸剂等。此外，本发明的组合物可包含用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用，也可以组合使用。这些添加剂的比例不是很重要，但一般在每100重量份本发明组合物0.01重量份至0.20重量份的范围内选择。

如本文所用，受试者是指需要治疗阿尔茨海默氏痴呆症的受试者，更具体地说，是指哺乳动物，如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。

本文所用的，“施用”是指通过任何合适的方法向对其有需要的受试者提供本发明的预定组合物。

如本文所用，“预防”是指所有抑制或推迟阿尔茨海默氏痴呆症发病的行动。“治疗”是指所有通过施用根据本发明的药物组合物改善或有利地改变阿尔茨海默氏痴呆症的行动。“改善”是指所有通过施用根据本发明的组合物减少阿尔茨海默氏痴呆症和相关参数，例如，症状的严重程度的行动。

下面，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例只是为了使本发明更容易理解，本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例1.证实LPS在阿尔茨海默氏痴呆症小鼠模型中的表达与年龄有关

1.1.实验动物模型

将3、5.5和11个月大的5XFAD阿尔茨海默氏痴呆症小鼠模型(n＝3至5)用作实验动物模型，并将11个月大的野生型小鼠用作对照。

作为5XFAD阿尔茨海默氏痴呆症小鼠，使用雌性杂合5XFAD转基因小鼠(背景B6SJL/小鼠；6个月龄；购自Junbiotech公司，韩国)。通过基因型分析证实5XFAD小鼠，并将5XFAD小鼠的野生型(WT)同胞作为对照。

1.2.免疫组织化学化染色

通过用4％多聚甲醛(PFA)进行心脏灌注固定取出小鼠大脑后，将取出的小鼠大脑在含有4％PFA的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.4)中固定过夜，然后浸泡在含有30％蔗糖溶液的50mM PBS中。之后，冷冻小鼠大脑，切成30μm厚的片，并在4℃下储存在储存液(含30％乙二醇和30％甘油的DW)中。

免疫组织化学染色是通过以下方法进行的。

将切片在1％的H₂O₂中孵育15分钟，然后放入小鼠抗大肠杆菌LPS抗体(Abcam，ab35654)以1∶400稀释的溶液中，并在4℃下孵育过夜。在室温下用生物素标记的二抗(1∶200稀释，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA，USA)孵育1小时后，将切片用亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(1∶100稀释，Vector)孵育1小时。此后，0.02％的3，3′-二氨基联苯胺和0.01％的H₂O₂反应约3分钟。在每个孵化阶段后，用PBS清洗切片三次。最后，将切片置于在涂有明胶的载玻片上，在增加酒精浓度时进行脱水处理，并在二甲苯中清理。

1.3.验证LPS(+)细胞在小鼠大脑中的分布

对野生型(WT)小鼠和3、5.5和11个月大的5XFAD小鼠进行脂多糖(LPS)的免疫组织化学染色。

由于验证5XFAD小鼠大脑半球中的LPS(+)区域的图像，如图1A所示，在野生型(WT)小鼠的大脑中没有观察到LPS的表达，而在5XFAD小鼠的大脑中，LPS(+)细胞和信号显示出随年龄增长而增加的趋势，由于确认了5XFAD小鼠大脑中LPS(+)细胞的分布，如以下表1所示，证实LPS(+)细胞大量分布在二级运动皮层(对应于图1A的顶视图中M2)，并主要分布在海马体齿状回的多形层中。

[表1]

1.4.验证小鼠大脑二级运动皮层(M2)中的LPS(+)细胞

作为进行免疫组织化学染色以便确认LPS在11个月大的野生型小鼠和3、5.5和11个月大的5XFAD小鼠大脑二级运动皮层(M2)中的表达的结果，如图1B所示，证实与野生型小鼠相比，5XFAD小鼠的LPS(+)细胞有增加的趋势，并且证实5XFAD小鼠的LPS(+)细胞表现出随年龄增加的趋势。

在这种情况下，证实LPS定位在细胞核周围(核周定位)，表达LPS的细胞根据5XFAD小鼠的年龄而变化。在3个月和5.5个月大的5XFAD小鼠的情况下，推测LPS主要在小胶质细胞中表达，而在11个月大的5XFAD小鼠的情况下，LPS的表达也可以在神经元中得到证实。

1.5.验证小鼠大脑海马区的LPS(+)细胞

作为进行免疫组织化学染色以便确认LPS在3、5.5和11个月大的5XFAD小鼠海马中的表达的结果，，如图1C所示，观察到与野生型小鼠相比，5XFAD小鼠海马体中的LPS(+)细胞呈现出随年龄增加的趋势，并且确认LPS(+)细胞主要在海马体齿状回的多形层中表达。

实施例2.确认阿尔茨海默患者样本中的LPS水平

每个临床阶段的阿尔茨海默患者样本中的LPS水平都是通过鲎试剂(limulusamebocyte lysate，LAL)测试确认的。

具体来说，将样本分为四组：正常组(n＝10)、无症状患者(n＝10)、有阿尔茨海默氏痴呆症前兆的患者(n＝10)和阿尔茨海默氏痴呆症患者(n＝10)，然后对其血液和脑脊液(CSF)样本中的LPS水平进行测量。

使用LAL测试测量LPS水平，提前在室温下准备好要用的试剂和平板，在37℃下准备好加热块后，将10μl每个样品放入96孔板中。然后，向其中加入10μl的LAL试剂，将平板放在其底部并摇动，在确认所产生的混合物被充分混合后，将反应物在37℃下反应10分钟。此后，向每个孔中加入20μl底物，将孔置于其底部，摇动并在37℃下反应6分钟，向每个孔中加入20μl终止液并轻轻摇动，然后在405nm处测量吸光度。

结果，每个样品中显示的LPS含量如以下表2(血液样品)、表3(脑脊液样品)和图2所示。

[表2]

EU/mL	平均值	标准差
			正常组	20.199	10.813
无症状AD	54.631	21.128
			前兆症状AD	94.015	3.235
阿尔茨海默氏痴呆症	102.392	3.612

[表3]

EU/mL	平均值	标准差
			正常组	18.565	11.806
无症状AD	44.498	13.039
			前兆症状AD	105.120	8.998
阿尔茨海默氏痴呆症	128.995	7.303

如上所述，随着阿尔茨海默氏痴呆症的发展，血液和脑脊液(CSF)中的LPS浓度更高，证实了LPS与阿尔茨海默氏痴呆症之间的高度相关性。因此，在治疗阿尔茨海默氏痴呆症方面，预期与LPS结合良好的肽将会有效。

实施例3.肽的制备

FP1(KLGVEAKRYLD，SEQ ID NO：3)被表示为野生型(WT)，并制备了在WT中发生点突变的FP3(KLGVEAKRYLR，SEQ ID NO：4)肽。为了加强FP3的残基序列与LPS的相互作用，根据FP3和LPS的结合模型设计了FP13-NH₂(KLRRYLR-NH₂，SEQ ID NO：5)肽，并且本发明的肽(KLRVKLRRYLR-NH₂(AcOH)，SEQ ID NO：1，下文称为DD-S052)通过额外引入非天然氨基酸和氨基酸异构体(异构D-型氨基酸(全d-型))来设计。此外，还由ANYGEN有限公司另外设计、合成并提供了N端PEG化的肽(EG-KLRVKLRRYLR-NH₂(AcOH)，SEQ ID NO：2，下文称为DD-S052P)。

本发明的肽DD-S052中的(AcOH)是指从该肽的N端开始的第九个氨基酸末端的三氟乙酸(TFA)被乙酸盐取代。

实施例4.肽对LPS介导的细胞因子产生的影响

用根据本发明的20μg/ml的肽(DD-S052)和2ng/ml的LPS共同处理小胶质细胞系BV-2细胞并培养6小时。随后，使用定量实时聚合酶链式反应(PCR)测量促炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。

具体来说，根据制造商的指南，使用RNA纯化试剂盒(Gene All，Seoul，Korea)从BV-2细胞中提取总RNA。使用反转录辅助第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)合成cDNA，并使用SYBR Green PCR预混液(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)进行qRT-PCR分析。IL-1β和TNF-α的基因特异性引物序列示于下表4中，IL-1β和TNF-α的mRNA水平相对于对照样本量计算。

[表4]

结果，如图3所示，证实DD-S052处理抑制了LPS诱导的BV-2细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表达。

数据代表平均值±SEM，***表示对照组与LPS处理的BV-2细胞的p＜0.001，##和##分别表示LPS处理的BV-2细胞与LPS+DD-S052处理的BV-2细胞的p＜0.01和p＜0.001。

实施例5.野生型小鼠大脑中肽对LPS诱导的神经炎症的影响

5.1.野生型小鼠海马体中肽对LPS诱导的小胶质增生的影响

实验如图4A所示设计，以确认野生型小鼠大脑中的小胶质细胞，使用山羊-抗Iba-1抗体(Ab5076，1∶500)进行免疫组织化学染色，抗Iba-1是小胶质细胞的标志物。三个月大的野生型小鼠腹腔注射(i.p.)LPS(30mg/kg/天)+载体(Hartmann地塞米松)或DD-S052(30mg/kg/天)+LPS(30mg/kg/天)，并在最后一次注射LPS的6小时后处死。在这种情况下，LPS和DD-S052分别装在独立的注射器中，并分别注射到左右腹部，并施用LPS，大约1分钟后再施用DD-S052。LPS在小鼠血液中的半衰期约为2分钟至4分钟。施用LPS和DD-S052的6小时后，通过心脏灌流固定(4％PFA)取出小鼠大脑。此后，取出的小鼠大脑在4％PFA中二次固定20小时，然后浸泡在30％的蔗糖溶液中。随后，将小鼠大脑冷冻并切片成厚度为30μm。

此后，通过实施例1.2所述的方法对Iba-1进行免疫组织化学染色，以确认小鼠海马体中的小胶质细胞，结果显示在图4B。图4B中的放大图像显示，在对照组小鼠(载体(PBS)+载体(Hartmann地塞米松)和LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理的小鼠中，激活的小胶质细胞分别从棱角分明形状变为阿米巴形状。相反，LPS+DD-S052处理的小鼠的小胶质形态显示出从阿米巴形状转变为棱角分明形状的趋势。

此外，当对Iba-1阳性细胞的数量进行量化时，如图4C所示，与对照组小鼠相比，LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理的小鼠海马体中Iba-1阳性细胞的数量明显增加，而与LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理的小鼠相比，LPS+DD-S052处理的小鼠Iba-1阳性细胞的数量明显减少。

数据代表平均值±SEM，***表示对照组有明显差异(P＜0.001)，##表示LPS+载体组有明显差异(P＜0.001)。比例尺＝200μm(海马体)，100μm(齿状回)，10μm(小胶质细胞的放大图像)。

5.2.在野生型小鼠大脑中脑黑质致密部中肽对LPS诱导的小胶质增生的影响

通过对Iba-1进行免疫组织化学染色，确认中脑黑质致密部(SNc)的小胶质细胞。以与实施例5.1相同的方式用LPS和DD—S052处理野生型小鼠。

图4D显示了进行免疫组织化学染色以确认大脑的中脑黑质致密部的小胶质细胞的结果。图4D中的放大图像显示，在对照组小鼠和LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理的小鼠中，激活的小胶质细胞分别从棱角分明状变成了阿米巴状。相反，LPS+DD-S052处理的小鼠的小胶质细胞形态显示出从阿米巴状转变为棱角分明状的趋势。经证实，虽然与对照组小鼠相比，LPS+载体处理的小鼠SNc中Iba-1(+)小胶质细胞有增加的趋势，但与LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理的小鼠相比，LPS+DD-S052处理的小鼠SNc中Iba-1(+)小胶质细胞有下降的趋势。比例尺＝200μm，100μm(SNc)和10μm(小胶质细胞的放大图像)。

实施例6.阿尔茨海默氏痴呆症小鼠大脑中肽对LPS诱导的神经炎症的影响

为了验证LPS和DD-S052对5XFAD小鼠(其为β淀粉样蛋白(Aβ)过度表达的阿尔茨海默氏痴呆症的动物模型)的神经炎症和细胞死亡的改变，如图5A所示对实验进行设计，对3个月大的5XFAD小鼠(n＝5)施用LPS和DD-S052，这些小鼠表现出炎症和细胞死亡，从而通过免疫组织化学染色法分析小胶质细胞。

由于LPS会引起不同程度的炎症反应，这取决于被施用的动物品系、LPS来源等，因此对动物共同施用单剂量的3mg/kg的LPS和10mg/kg的DD-S052，然后在48小时后处死，5XFAD小鼠基于LPS的LD50(1mg/kg至25mg/kg)，用3mg/kg的LPS进行处理，这通过用3mg/kg的LPS处理5XFAD小鼠来确认死亡率的参考文献(Barton，S.M.；Janve，V.A.；McClure，R.；Anderson，A.；Matsubara，J.A.；Gore，J.C.；Pham，W.，Lipopolysaccharide InducedOpening of the Blood Brain Barrier on Aging 5XFAD Mouse Model.J AlzheimersDis 2019，67，(2)，503-513.)，和确认小胶质增生从施用LPS后第2天开始达到最大值的参考文献(Kondo，S.；Kohsaka，S.；Okabe，S.，Long-term changes of spine dynamics andmicroglia after transient peripheral immune response triggered by LPS invivo.Mol Brain 2011，4，27)，来进行。施用LPS和DD-S05248小时后，通过心脏灌流固定(4％PFA)取出小鼠大脑。此后，取出的小鼠大脑在4％PFA中二次固定20小时，然后浸泡在30％的蔗糖溶液中。随后，小鼠大脑被冷冻并被切成30μm厚的切片。

此后，作为进行免疫组织化学染色以便确认5XFAD小鼠大脑中的小胶质细胞的结果，如图5B所示，证实在LPS+载体(Hartmann地塞米松)处理期间，大脑皮层和海马体的所有Iba-1(+)小胶质细胞增加，但与LPS+溶媒(Hartmann氏地塞米松)处理组相比，LPS+DD-S052处理期间Iba-1(+)小胶质细胞减少。观察到的深棕色的细胞(阳性细胞)是染色的小胶质细胞，小胶质细胞的变化可以通过阳性细胞的数量或形状的变化来确认。

实施例7.肽对阿尔茨海默氏痴呆症小鼠中认知障碍和阿尔茨海默氏痴呆症相关 病理影响

7.1.确认自发交替和全臂进入

为了证实DD-S052治疗对5XFAD小鼠(即阿尔茨海默氏痴呆症动物模型)认知功能损害和阿尔茨海默氏痴呆症相关病理的影响，设计了如图6A所示的实验，对5.5个月大的5XFAD小鼠以2mg/kg隔日给药，连续4周腹腔注射共计30mg/kg(n＝5～8)。然后，对每只小鼠进行认知功能实验，再通过心脏灌流固定法对小鼠大脑进行固定。此后，将取出的小鼠大脑在4％PFA溶液中二次固定20小时，然后浸泡在30％的蔗糖溶液中。随后，将小鼠大脑冷冻并切片，厚度为30μm。

认知功能实验是基于啮齿动物具有探索新环境意愿的本能行为的新型实验，是评价小鼠在迷宫中选择与小鼠之前立即选择的路径不同的空间感知能力的实验，得分是用自发交替(选择与之前立即选择的路径不同的路径的比率)除以通过的总通道数(全臂进入)。除了空间感知能力之外，实验过程中的全臂进入量是评估所有组别是否具有类似的运动能力以及实验是否正常进行的指标。

DD-S052处理的5XFAD小鼠、溶媒(Hartmann地塞米松)处理的5XFAD小鼠(n＝8)和载体(Hartmann地塞米松)处理的野生型小鼠(n＝5)出现了认知障碍的结果，如图6B所示。证明与野生型小鼠相比，载体处理的5XFAD小鼠(n＝8)的自发交替减少，而与载体处理的5XFAD小鼠相比，DD-S052处理的5XFAD小鼠的自发交替增加。

此外，证实了在8分钟的治疗过程中，与载体处理的5XFAD相比，DD—S052处理的5XFAD小鼠的全臂进入增加。

从上述情况可以看出，在载体和DD-S052处理的小鼠中，存在着全臂进入增加的趋势，但三组中的群体具有相似的运动能力，由于组间无显著性，行为实验正常进行。

7.2.对阿尔茨海默氏痴呆症相关病理的影响

使用免疫荧光染色法验证DD-S052对β-淀粉样蛋白积累、小胶质增生和神经元损失的影响。

具体来说，在免疫荧光标记的情况下，根据Paxinos和Franklin的“在立体定向坐标下的小鼠大脑”，在脑室下区(距前囟1.18mm和0.02mm)和海马体形成区(距前囟-1.58mm和-3.80mm)获得4至5个冠状切片。在Titramax 101轨道振动器(Heidolph，Schwabach，Germany)中使用自由漂浮法用PBS清洗脑组织，并将切片与包含0.3％Triton X-100的PBS、0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和如下一抗一起在4℃下孵育过夜：小鼠抗4G8抗体(1：2,000；目录号800701，BioLegend，USA)，小鼠抗NeuN抗体(1：100；目录号MAB377，Merck KGaA，Darmstadt，Germany)，和山羊抗Iba-1抗体(1：500；目录号ab5076，Abcam，Cambridge，UK)。

在与抗4G8抗体孵育之前，脑切片与70％的甲酸以孵育进行抗原修复20分钟，用PBS洗三次，每次5分钟，然后与二抗在室温下孵育50分钟，并观察荧光信号。使用了以下抗体作为二抗：驴Alexa488缀合的抗鼠IgG(1：200；目录号A21202，Thermo FisherScientific Inc.)，驴Alexa 488缀合的抗山羊IgG(1：200；目录号A11055，Thermo FisherScientific Inc.)，和驴Alexa 594缀合的抗大鼠IgG(1∶200；目录号A21209，ThermoFisher Scientific Inc.)。所有的抗体都用包含0.3％Triton X-100的PBS稀释。

7.2.1.对β-淀粉样蛋白积累的影响

如图6C所示，作为验证在5XFAD小鼠(阿尔茨海默氏痴呆症动物模型)中施用DD-S052后的β-淀粉样蛋白积累的结果，由于确认4G8(+)区域(其为β-淀粉样蛋白特异性抗体)通过施用DD-S052减少，所以可以看出DD—S052表现出抑制β-淀粉样蛋白积累的作用。

7.2.2.对小胶质增生的影响

如图6D所示，作为验证在DD-S052对5XFAD小鼠(阿尔茨海默氏痴呆症动物模型)中小胶质增生的影响的结果，由于验证了通过5XFAD小鼠中施用DD-S052，Iba-1(+)细胞的数量减少，所以可以看出DD-S052表现出抑制小胶质增生的作用。

7-2-3.对神经元损失的影响

如图6D所示，作为验证DD-S052对5XFAD小鼠(阿尔茨海默氏痴呆症动物模型)中神经元损失的影响的结果，由于验证了通过施用DD-S052，NeuN(+)细胞的数量增加，可以看出DD-S052表现出抑制神经元损失的作用。

实施例8.DD-S052和PEG化DD-S052的Tau蛋白聚集抑制作用

进行硫黄素T(ThT)试验来研究DD-S052和PEG化DD-S052对Tau蛋白聚集的影响。已知ThT与富含β-折叠的蛋白质聚集物结合产生荧光。合成的tau K18溶解在PBS(pH 7.4)中，以便诱导tau聚集。通过制备包括PBS(pH7.4)、0.5mg/mL tau K18、0.1mg/mL肝素和100μMDTT的溶液，诱导tau蛋白的聚合。将不同浓度的DD-S052(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL和1000μg/mL)、100μM亚甲基蓝(MB)溶液(阳性对照)和PEG化DD-S052与聚集混合物一起孵育21小时。孵育后，将ThT溶液(50mM甘氨酸缓冲液中15μM，pH8.9)加入到含有样品和聚集混合物的96孔板中，并将所得混合物孵育3小时。使用SpectraMax iD3多模式读微孔板器(Molecular Devices，San Jose，CA，USA)在440nm和484nm的激发和发射波长处测量ThT的荧光强度并量化。

如图7所示，作为验证DD-S052和PEG化DD-S052对tau K18的影响的结果，证实在DD-S052(左视图)和PEG化DD-S052(DD-S052P)中，作为荧光染料的硫黄素T(ThT)的荧光强度降低。统计学意义由单因素分析和Tukey多重比较检验确定(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

实施例9.验证DD-S052通过血脑屏障的渗透性

9.1.体外血脑屏障的渗透试验

为了确认本发明的多肽DD-S052是否通过血脑屏障(BBB)，使用平行人工膜渗透性检测试剂盒(PAMPA-096；BioAssay Systems)进行模拟血脑屏障的人工膜渗透试验。

分析条件见下表5，并通过液相色谱-质谱法(LC-MS)进行分析。

[表5]

膜涂层	4％瘦素
		孵育时间	18小时，64800秒
孵育温度	室温
		缓冲液	PBS(磷酸盐缓冲液)

9.2.定量分析

定量分析采用电喷雾电离结合傅里叶变换离子回旋共振质谱法(ESI-FT-ICR-MS)进行，分析条件见下表6。

[表6]

进样体积	150μl
		尺寸	1M
平均扫描次数	16
		Accum(s)	0.200
雾化气体流量	1.2bar
		干燥气体	4.0
干燥温度	200℃
		碰撞电压	-3.0V
直流提取偏压	1.3
		飞行时间	0.9ms
频率	4MHz
		RF振幅	350.0Vpp
毛细管出口	220.0V
		偏转板	220.0V
气体流量	30.0％
		传输出口透镜	-20.0V
分析器入口	-20.0V
		侧向电场	3.0V
侧向电场偏移	-1.6V
		正阱板	1.500V
后阱板	1.500V
		后阱板淬火	-22.0V
实验总时间	10.0682秒
		流速	12.0μl/h
校准ESI	校准混合物

9.3.分析标准

根据现有文献(Evaluation of the reproducibility of Parallel ArtificialMembrane Permeation Assays PAMPA，Sigma Aldrich)中描述的Log Pe函数，使用测试材料对应的峰的强度值，并且通过参考现有文献(Brian.J et al.Predicting a Drug′sMembrane Permeability：A Computational Model Validated With in VitroPermeability Assay Data.J Phys Chem B.2017May25；121(20)：5228-5237)用由Log Pe函数计算的值来预测渗透程度。

9.4.测试结果

考虑到DD-S052肽分析结果的分析灵敏度和重复性，选择375.3m/z和500.9m/z处的峰并进行分析，如图8A所示，并加入100pg/ml的DD-S052肽进行人工膜渗透试验。

用液相色谱-质谱法(LC-MS)分析人工膜渗透试验结果，如图8B所示，经DD-S052处理后，人工膜上层和下层的峰相似，经质谱法对相应峰的强度进行量化分析，375m/z和512m/z处的强度值见下表7和表8。

[表7]

之前	1829478400
		贡献量	909677952
接受量	717305173
		Log Pe	-5.40519559

[表8]

之前	1667509760
		贡献量	867968256
接受量	717488192
		Log Pe	-5.362403774

根据上述结果，渗透程度根据范围进行分类，并在图8C中显示。作为对照，使用了替莫唑胺(TMZ)和PteleifilisinC。如图8C所示，证实DD—S052的血脑屏障渗透性具有中间的log Pe值。

上述对本发明的描述是为了说明问题而提供的，本发明所属领域的技术人员将理解，本发明可以很容易地修改成其他具体形式，而不改变本发明的技术精神或基本特征。因此，应该理解的是，上述实施例只是在所有方面进行说明，而不是限制性的。

【工业实用性】

根据本发明的肽或其盐替代物表现出如抑制LPS介导的细胞因子产生，抑制神经炎症，改善认知障碍，抑制β淀粉样蛋白或tau蛋白聚集，以及抑制神经元损失的效果。该多肽或其盐替代物有望被有益地用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症。

<110> HLB科学株式会社

<120> 用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的肽组合物

<130> MPCT21-086

<150> KR 10-2020-0108861

<151> 2020-08-27

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DD-S052

<220>

<221> 结合

<222> (11)

<223> 在多肽的C端加入胺基（NH2）

<220>

<221> 位点

<222> (9)

<223> 肽的N端第9个氨基酸的末端的三氟乙酸（TFA）被乙酸盐取代

<400> 1

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DD-S052P

<220>

<221> 结合

<222> (11)

<223> 在多肽的C端加入胺基（NH2）

<220>

<221> 位点

<222> (9)

<223> 肽的N端第9个氨基酸的末端的三氟乙酸（TFA）被乙酸盐取代

<220>

<221> 位点

<222> (1)

<223> 肽的N端PEG化

<400> 2

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FP1 (WT)

<400> 3

Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FP3

<400> 4

Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FP13-NH2

<220>

<221> 结合

<222> (11)

<223> 在多肽的C端加入胺基（NH2）

<400> 5

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-1β 正向引物

<400> 6

ccttccagga tgaggacatg a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> IL-1β 反向引物

<400> 7

tgagtcacag aggatgggct c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TNF-α 正向引物

<400> 8

tcgtagcaaa ccaccaagtg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TNF-α 反向引物

<400> 9

atatagcaaa tcggctgacg 20

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 权利要求1或9的多肽

<220>

<221> 变体

<222> (1)

<223> /置换=""

<220>

<221> 变体

<222> (2)

<223> /置换="Arg"

<220>

<221> 变体

<222> (4)

<223> /置换="Arg"

<220>

<221> 变体

<222> (6)

<223> /置换="Lys"

<220>

<221> 变体

<222> (7)

<223> /置换="Leu"

<220>

<221> 变体

<222> (8)

<223> /置换="Arg"/replace="Leu"

<220>

<221> 变体

<222> (10)

<223> /置换="Ala"/置换="Trp"/置换="Lys"/置换="Asp"

<220>

<221> 变体

<222> (12)

<223> /置换="Arg"

<400> 10

Leu Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp

1 5 10

Claims (13)

1.一种用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物组合物，其包括由以下序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分：

[通式]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

其中，在通式中，

n是0或1；

L是亮氨酸；

V是缬氨酸；

R是精氨酸；

X1是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；

X2是甘氨酸(G)或精氨酸(R)；

X3是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；

X4是丙氨酸(A)或亮氨酸(L)；

X5是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)；

X6是酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)；以及

X7是天冬氨酸(D)或精氨酸(R)，

前提条件是在通式中，不包括由K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D的序列代表的多肽。

2.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽是由以下氨基酸组成的多肽：在通式中，

n是0；

X1是赖氨酸(K)；

X2是精氨酸(R)；

X3是赖氨酸(K)；

X4是亮氨酸(L)；

X5是精氨酸(R)；

X6是酪氨酸(Y)，以及

X7是精氨酸(R)。

3.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽是L型、D型、包含类肽的拟肽，或非天然氨基酸。

4.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽的一端被烷基化、PEG化或酰胺化。

5.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽具有添加到C端的胺基(NH₂)。

6.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽的所述盐替代物是乙酸盐替代物。

7.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽或所述其盐替代物具有以下特征中的一个或多个特征：

抑制脂多糖(LPS)介导的细胞因子产生；

抑制神经炎症；

改善认知障碍；

抑制β-淀粉样蛋白或Tau蛋白的聚集；以及

抑制神经元损失。

8.根据权利要求1的所述组合物，其中所述多肽或所述其盐替代物通过血脑屏障。

9.一种用于预防或改善阿尔茨海默氏痴呆症的食品组合物，其包含由以下序列通式代表的多肽或其盐替代物作为活性成分：

[通式]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

其中，在通式中，

n是0或1；

L是亮氨酸；

V是缬氨酸；

R是精氨酸；

X1是赖氨酸(K)或精氨酸(R)；

X2是甘氨酸(G)或精氨酸(R)；

X3是谷氨酸(E)或赖氨酸(K)；

X4是丙氨酸(A)或亮氨酸(L)；

X5是赖氨酸(K)、精氨酸(R)或亮氨酸(L)；

X6是酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或天冬氨酸(D)；以及

X7是天冬氨酸(D)或精氨酸(R)，

前提条件是在通式中，不包括由K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D的序列代表的多肽。

10.根据权利要求9的所述组合物，其中所述多肽是由以下氨基酸组成的多肽：在通式中，

n是0；

X1是赖氨酸(K)；

X2是精氨酸(R)；

X3是赖氨酸(K)；

X4是亮氨酸(L)；

X5是精氨酸(R)；

X6是酪氨酸(Y)，和

X7是精氨酸(R)。

11.一种预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的方法，该方法包括将包含根据权利要求1所述的多肽或其盐替代物作为活性成分的组合物施用于对其有需要的受试者。

12.一种包含根据权利要求1所述的多肽或其盐替代物的组合物作为活性成分用于预防或治疗阿尔茨海默氏痴呆症的用途。

13.一种根据权利要求1所述的多肽或其盐替代物用于制备治疗阿尔茨海默氏痴呆症的药物的用途。

Images