CN116240208A - 针对滑液囊支原体ms病原的分子阻断剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂及其制备方法。一种针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂，其核酸序列为SEQ ID NO.1，命名为MS‑PDHB‑In6，该分子阻断剂是围绕coregenome序列筛选到的，针对滑液囊支原体的特异性结合的具有结合并沉默相关酶蛋白转录和表达的小分子序列；能够有效抑制滑液囊支原体生长，从而达到防治滑液囊支原体疾病的效果。

Description

针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂及其制备方法。
背景技术
分子阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。利用分子阻断剂来预防和治疗禽滑液囊支原体还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是目前利用分子阻断剂来预防和治疗禽滑液囊支原体还未见报道。
为解决上述问题，本发明提供了一种针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6，能够有效抑制滑液囊支原体生长，从而达到防治滑液囊支原体疾病的效果。
为达到上述目的，本发明主要通过以下技术手段实现：一种针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂，其核酸序列为SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO.1：
GCTGCTATGGCAGGGCTTCATCCAATTATCGAAATGCAATTCCAAGGGTTTTCATACGCTTCTTTCCAACAAATGTTTACTCACGCTGCAAGAATTAGAAACCGTTCAAGAGGAAGATTCACTTCGCCACTAGTTTTAAGAATGCCAATGGGTGGAGGAGTTAGAGCGCTAGAGCATCACTCTGAAGCTATCGAAGCTTTATTTGCTCACATTCCAGGGATTAAAGTAGTTATGCCAGCCTTTCCTTACGATACTAAAGGATTGCTATTGG
本发明依据滑液囊支原体全基因组序列进行比较分析，得到滑液囊支原体的coregenome，经滑液囊支原体全基因组序列比对以及毒力基因数据库筛选分析，获得滑液囊支原体相关致病因子。其中，pdhB基因属于P97/P102paralogfamily，主要与滑液囊支原体在宿主细胞的表面定植与侵入有关，属于滑液囊支原体感染早期重要毒力因子。在支原体发病早期进行药物等有效干预是预防和治疗禽滑液囊支原体的关键节点。采用生物信息学预测获得9个针对pdhB基因的阻断剂分子，全部经人工合成和修饰后经体外实验筛选到一个可有效抑制滑液囊支原体生长的阻断剂分子(核酸序列SEQ ID NO.1)，命名为MS-PDHB-In6，该分子阻断剂是围绕coregenome序列筛选到的，针对滑液囊支原体的特异性结合的具有结合并沉默相关酶蛋白转录和表达的小分子序列。该小分子阻断剂进入宿主机体后，随血液循环进入全身，到达病灶,迅速与滑液囊支原体病原的表面表达蛋白结合，或者与病原体pdhB基因转录本mRNA结合形成双链RNA，阻滞mRNA进一步翻译成功能蛋白而启动分子阻断剂的功能。
附图1为分子阻断剂MS-PDHB-In6的分子结构,该阻断剂通过分子亲和力(表面静电吸引力)先与滑液囊支原体病原的黏蛋白进行可逆性吸附，然后与滑液囊支原体病原的表面表达蛋白进行特异性结合，使滑液囊支原体表面空间发生结构变化，从而形成了与宿主细胞受体蛋白空间上的隔离，使滑液囊支原体表面表达蛋白不能与宿主细胞受体蛋白进行结合；分子阻断剂MS-PDHB-In6没有宿主细胞质膜结构，不能引起宿主细胞质膜的构像样变化，相关酶蛋白转录和表达处于沉默状态而无法启动。
附图2为pdhB基因序列情况，与图1相对应，标注处分子阻断剂中所存在的内环结构、阻断部位、外环结构及发卡结构。
进一步的，上述针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂的应用，可用于滑液囊支原体病的预防及治疗药品的研制。
进一步的，上述针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6基因克隆；
(2)大肠杆菌重组表达载体的构建；
(3)基因重组MS病原的分子阻断剂大肠杆菌Rosetta基因工程菌的构建Rosetta感受态细胞的制备；
(4)滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6的制备。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种人工合成的分子阻断剂MS-PDHB-In6。
(2)该阻断剂MS-PDHB-In6的制备过程中，包括总RNA的提取、反转录得到cDNA、设计引物、PCR扩增、基因克隆、重组表达质粒构建、转化Rosetta、重组基因诱导表达和重组蛋白纯化等步骤，能得到产量和纯度较高的阻断剂MS-PDHB-In6，具有低成本、周期短、易于操作的特点。
(3)本发明的阻断剂MS-PDHB-In6能够抑制滑液囊支原体MS感染鸡胚细胞。
(4)本发明利用原核表达系统制备人工合成的分子阻断剂MS-PDHB-In6，其抑制滑液囊支原体MS感染鸡胚细胞，可利用其作为阻断剂，开发防治滑液囊支原体MS感染的药物，从而为滑液囊支原体MS的研究和防治提供一个新思路，对于实际生产有着极为重要的意义。
附图说明
图1是本发明分子阻断剂的二级结构图。
图2是本发明分子阻断剂的核酸序列及关节结构的标注。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6的制备
(1)MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6基因克隆
1-1)无菌采取发病鸡关节液或渗出物；
1-2)使用0.22μm的滤膜对所采样本进行过滤，转接于改良Frey液体培养基，在恒温培养箱中进行37℃振荡培养1周；
1-3)取5mL已培养好的培养液进行离心2min，转速为12000r/min，弃上清，留取培养液沉淀；
1-4)使用天根细菌基因组提取试剂盒DP302-02，按照说明书提取细菌基因组；
1-5)依据目的片段设计扩增引物：F:5'—GCTGCTATGGCAGGGCTTCATCCAATTATC—3'；R：5'—CCAATAGCAATCCTTTAGTATCGTAA—3'。以提取细菌全基因组为模板，进行基因PCR扩增，以获得具有活性的重组MS病原分子阻断剂，扩增结束后进行凝胶电泳，选择目的片段大小在270bp左右的结果进行测序，根据测序结果选取完全符合pdhB基因序列的扩增结果，并以此为模板进行大量扩增。
(2)大肠杆菌重组表达载体的构建
将上述重组载体经QuickCutBamHI和QuickCutHindIII双酶切后，电泳，割胶回收MS病原的分子阻断剂基因片段，用T4连接酶将其与表达载体pET-28a于16℃连接过夜，得到重组载体。将重组载体转化E.coliDH5。感受态细胞，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基(1升培养基含胰蛋白陈l0g、酵母提取物5g、氯化钠l0g、琼脂15g,pH7.5)，挑选阳性克隆接种于5mLLB培养基中，37℃,200rpm培养过夜，提取表达重组质粒备用。
(3)基因重组MS病原的分子阻断剂大肠杆菌Rosetta基因工程菌的构建Rosetta感受态细胞的制备过程如下:
3-1)Rosetta大肠杆菌的活化:取实验室保藏菌一管，于冰上化冻，以划线的方式接种到LB固体培养基上；
3-2)从上述LB平板中挑取Rosetta大肠杆菌单菌落接种到100mL含43ug/mL氯霉素的LB培养基中，37℃,200rpm振荡培养至OD600值为0.35左右，停止培养，并将菌液置于冰中冷却；
3-3)5000rpm离心l0min收集菌体；
3-4)菌体沉淀用40mL预冷的0.1MMgSO4溶液悬浮，混合均匀后静置l0min；
3-5)5000rpm离心l0min收集菌体；
3-6)菌体沉淀40mL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮，混匀后静置l0min；
3-7)5000rpm离心l0min收集菌体；
3-8)菌体沉淀用含15％甘油的1MCaCl2溶液轻轻悬浮，以100uL/管的规格分装，冻存于-80℃冰箱备用，使用时取出并置于冰上化冻。
3-9)将上述步骤2中制备的重组表达质粒转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，涂布于含有34ug/mL氯霉素和50ug/mL卡那霉素的LB平板，用F和R引物对菌落做PCR阳性鉴定，对阳性菌落中的插入片段进行测序确认，即得到载有MS病原的分子阻断剂基因片段的大肠杆菌基因工程菌。
(4)滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6的制备
4-1)挑取上述3获得的阳性菌落接种于含氯霉素和卡那霉素的LB液体培养基中37℃；200rpm培养过夜；取培养过夜的菌液以1:100的比例接种新鲜的培养基，37℃,200rpm进行扩大培养，至OD600的值为0.6-0.7，加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，继续培养4h；5000rpm离心l0min收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(PBS)(1L水溶液中含氯化钠8g,氯化钾0.2g、十二水合磷酸氢二钠0.29g、磷酸二氢钾0.2g,pH7.6)重悬，然后5000rpm离心l0min离心洗涤菌体，重复洗涤菌体一次；最后得到的菌体按每克湿重加入5mLPBS重悬，超声波破碎细胞，破碎条件为:300W，破2S，暂停8S,120个循环。
4-2)将上述破碎后的菌液于常温下12000g离心20min收集沉淀，沉淀用包涵体洗涤缓冲液(含20mmol/LTris-HC1,2mol/L尿素)重悬，12000g离心20min洗涤沉淀，重复洗涤多次，最后得到的沉淀用5-l0mL的尿素缓冲液(含20mMTris-HC1,8M尿素、500mMNaC1,5mM咪唑,pH调至8.0再加入1mMR-琉基乙醇)溶解，溶解后的包涵体蛋白用HisCraviTrap鳌合柱层析纯化、洗脱。
4-3)将洗脱液装入透析袋，放入初始尿素浓度为6M的复性液I(1L水溶液中含0.1MTris-HCl、还原型谷肤甘肤0.614g,氧化型谷肤甘肤0.0122g,6M尿素、甘油100mL、吐温-20100uL)透析4h，用输液管以虹吸的方式将复性液II(1L水溶液中含0.1MTris-HCl、还原型谷肤甘肤0.614g,氧化型谷肤甘肤0.0122g、甘油100mL、吐温-20 100uL)缓慢导入复性液工中，进行透析复性，直至外液尿素浓度低于1M。其中，复性液II添加的流速约为每5分钟2mL。随后，将透析袋放入到0.1MTris-HCl缓冲液中继续透析4h，然后在PBS中透析2h，取出透析袋中的溶液，离心去除沉淀，上清即为复性的重组MS病原的分子阻断剂悬液。该重组MS病原的分子阻断剂分子量为48kDa。
4-4)所述MS病原的分子阻断剂阻断MS感染细胞的效果检测，包括以下步骤和结果:
4-5)异硫氰酸荧光素(FITC)标记STSSSV:FITC粉末用二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解，终浓度为lmg/mL；将其与纯化的STSSSV在室温下孵育1h；4℃下20000g离心20min，收集沉淀，用PBS悬浮沉淀，再次4℃下20000g离心20min收集沉淀；如此洗涤四次后，用0.65％的生理盐水重悬。
4-6)细胞印片和血细胞涂片的制作:取健康肉鸡，用酒精棉涂抹肉鸡颈部消毒，用解剖刀切开软组织，用解剖剪剪断肉鸡颈部静脉血管，将血液滴入盛有抗凝剂的小烧杯中轻轻混匀，500g离心收集细胞，用0.65％的生理盐水重悬，取l0uL悬液涂片，火焰固定；解剖肉鸡，取出肝脏，用镊子轻轻挑开肝脏表面薄膜，取组织块以印片的方式轻轻印在干净的载玻片上，火焰固定。
4-7)重组MS病原的分子阻断剂阻断试验:将FITC标记的STSSSV(FITC-STSSSV)与合成MS病原的分子阻断剂溶液混合，设FITC-STSSSV与0.65％生理盐水混合样作为对照，设0.65％生理盐水作为空白；将其分别覆盖于(4-6)制备的肝细胞印片和血细胞涂片上，置于冰上孵育2小时后，用0.65％的生理盐水反复冲洗玻片l0S，用滤纸吸走残水。
4-8)4'，6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)染色:取出上述玻片，将DAPI加到细胞区域，常温下维持3分钟，用0.65％的生理盐水冲洗玻片，再用蒸馏水快速地冲洗一遍，显微镜下进行荧光观察。结果添加重组MS病原的分子阻断剂的细胞的FITC-MS信号明显弱于只加FITC-MS的细胞，表明重组MS病原的分子阻断剂可以阻断MS感染细胞。
实施例2：本发明分子阻断剂动物实验结果
(1)滑液囊支原体阻断剂对鸡蛋外观品质影响试验
选择滑液囊支原体临床发病产蛋鸡群7500只，采用滑液囊支原体阻断剂10mg/kg饮水3天后，统计鸡群产蛋数量、检查鸡蛋外观品质，确定滑液囊支原体阻断剂对发病鸡应用效果。试验表明，滑液囊支原体阻断剂应用后，鸡群产蛋增加1.88％，脏蛋畸形蛋数量减少1.11个百分点，滑液囊支原体阻断剂具有快速控制疾病的效果。
日期 产蛋个数 脏蛋 畸形蛋 脏蛋畸形蛋合计 占总产蛋数比
5.15 6390 120 60 180 2.82％
5.16 6430 113 56 169 2.63％
5.17 6440 108 50 158 2.45％
5.18 6480 92 54 146 2.25％
5.19 6480 93 49 142 2.19％
5.20 6500 88 52 140 2.15％
5.21 6500 75 49 124 1.91％
5.22 6510 70 31 111 1.71％
(2)滑液囊支原体阻断剂对种蛋孵化影响试验
选同一蛋种鸡场52W第6-7、7天鸡群的3批种蛋，每批8640枚，选择52W7A++级种蛋、52W6-7A+级种蛋各1批，为试验组,孵化10天后鸡胚注射10ug/ml注射滑液囊支原体阻断剂0.2ml，设52W7A++级种蛋1批不注射滑液囊支原体阻断剂，为对照组。各组单独孵化，并进行数据统计分析。由上表可见，注射组2批种蛋受精率、死胚率与对照组相当的情况下，入孵蛋健雏率、受精蛋健雏率均高于对照组3.85、4.62个百分点。试验表明，滑液囊支原体阻断剂可阻断滑液囊支原体在鸡胚繁殖，提高鸡苗的健雏率，可降低疾病垂直传播。
Figure BDA0004045782080000061
(3)滑液囊支原体阻断剂对肉鸡生产性能影响的试验
选取肉鸡养殖场同一批鸡苗80000只，随机分为4个舍饲养，2号、4号舍为试验组，1号、3号舍为对照组。试验组7日龄、20日龄采用滑液囊支原体阻断剂10mg/kg饮水3天，对照组不做处理。各组肉鸡按常规饲养管理。肉鸡饲养38天出栏，分别统计每个重复的各组肉鸡出栏只数、出栏重、耗用饲料数据，计算成活率、只均重、日增重、料肉比、欧洲指数，确定滑液囊支原体阻断剂对肉鸡生产性能的影响。试验表明，试验组成活率分别提高6.28、6.51个百分点，料肉比降低0.052、0.12欧洲指数提高51、72，滑液囊支原体阻断剂可降低肉鸡滑液囊支原体的发生，提高肉鸡出栏率和生产水平。
Figure BDA0004045782080000071
(4)滑液囊支原体阻断剂对肉鸡治疗效果试验
选择一发病肉鸡场25日龄鸡群400只，随机分为4组，每组100只肉鸡，其中1、2组为一个重复，3、4组为一个重复。1组、3组使用滑液囊支原体阻断剂10mg/kg饮水3天,2、4组使用泰妙菌素125mg/L饮水5天，统计各组5天肉鸡死淘情况，对比治疗效果。由下表可见，用药后5天内试验组死淘数量明显低于对照组，滑液囊支原体阻断剂具有很好的防治效果，优于药物。
日龄 1组(试验组) 2组(对照组) 3组(试验组) 4组(对照组)
用药后第一天 5 8 6 9
用药后第二天 2 5 2 7
用药后第三天 3 6 0 3
用药后第四天 2 7 3 6
用药后第五天 2 4 1 4
合计 14 30 12 29

Claims (4)

1.一种针对滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂，其核酸序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1中的分子阻断剂在制备滑液囊支原体病的预防及治疗药品中的应用。
3.权利要求1中分子阻断剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6基因克隆；
(2)大肠杆菌重组表达载体的构建；
(3)基因重组MS病原的分子阻断剂大肠杆菌Rosetta基因工程菌的构建Rosetta感受态细胞的制备；
(4)滑液囊支原体MS病原的分子阻断剂MS-PDHB-In6的制备。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)的扩增引物如下：
F:5'—GCTGCTATGGCAGGGCTTCATCCAATTATC—3'；
R：5'—CCAATAGCAATCCTTTAGTATCGTAA—3'。
CN202310028732.0A 2023-01-09 2023-01-09 针对滑液囊支原体ms病原的分子阻断剂及其制备方法 Pending CN116240208A (zh)

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