CN115850467A - 一种特异性β-葡聚糖纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学及免疫学技术领域，涉及一种特异性β‑葡聚糖纳米抗体及其应用，特异性β‑葡聚糖纳米抗体的制备方法包括3个工艺步骤：纳米抗体噬菌体文本库的复苏、特异性纳米抗体噬菌体的淘选及鉴定，重组pET‑28a质粒表达载体的构建，诱导特异性β‑葡聚糖纳米抗体的表达及纯化；制备的特异性β‑葡聚糖纳米抗体可靶向结合真菌细胞壁的主要成分β‑葡聚糖，并在体内外表现出抗真菌活性和抗炎活性，抑制真菌生长的同时，显著减轻真菌性角膜炎的中模式识别受体和炎症因子的表达，降低炎症评分；β‑葡聚糖纳米抗体的生产工艺简单、成本低、产量高、易保存，结构简单；将β‑葡聚糖纳米抗体应用于真菌性角膜炎治疗，溶解度高、生物利用度高、组织穿透性好、角膜毒性小、抗真菌及抗炎效果好。

Description

一种特异性β-葡聚糖纳米抗体及其应用

技术领域：

本发明属于生物学及免疫学技术领域，涉及一种特异性β-葡聚糖纳米抗体及其应用，主要通过噬菌体淘选及基因工程技术制备一种特异性β-葡聚糖纳米抗体，涉及一种新的特异性β-葡聚糖纳米抗体及其编码序列，并将制备的特异性β-葡聚糖纳米抗体用于真菌性角膜炎的治疗，验证其在真菌性角膜炎中发挥的抗真菌及抗炎作用。

背景技术：

真菌性角膜炎是一种由多种致病真菌感染引起的严重的致盲眼病。我国是农业大国，生产活动中的植物性角膜外伤为真菌性角膜炎的发生提供了机会，并且由于人群中佩戴角膜接触镜的人数增多以及临床上广谱抗生素、糖皮质激素的不规范使用，真菌性角膜炎发病率逐年上升。加之真菌性角膜炎患者多为青壮年，致盲后给家庭和社会造成极大经济负担。

临床上真菌性角膜炎的早期治疗主要是药物治疗。早期及时有效地抗真菌治疗能够限制真菌病原体生长，减少对角膜组织的损伤，有效降低该病的致盲率。但临床常用的抗真菌滴眼液多存在角膜局部渗透作用差、刺激性强、毒性大等缺点，导致真菌性角膜炎治疗十分棘手。因此寻找新的真菌性角膜炎治疗策略并探究其作用机制意义重大。

纳米抗体(Nb)，又称单域抗体，近年来在抗炎、抗感染、抗肿瘤及药物递送等多方面有突破性进展。Nb是利用基因工程技术从鲨鱼或者骆驼科动物的血清中分离制备的一种抗体，虽然天然缺失轻链及重链恒定区，但并未损失其抗体的特性，并可以靶向结合抗原。相对于单克隆抗体，纳米抗体的制备过程简便、成本低，更重要的是纳米抗体分子量更小(16kDa)，有更强的组织穿透性，且具有高溶解性及稳定性、高亲合性、可主动进入细胞内作为胞内抗体等优势。

抗病毒、细菌、寄生虫感染以及毒素中和等应用领域的纳米抗体均被成功制备。研发中的纳米抗体不仅以病原体表面抗原为靶点，调动宿主免疫系统的补体固定和调理吞噬杀伤来清除病原体，而且可以抑制病原体生长，中和病原体产生的毒素，显著降低对宿主细胞结构和功能的损害作用，降低感染的严重程度。在减轻炎症反应方面，针对病原体表面抗原的纳米抗体能够阻断病原体与免疫细胞的结合，从而抑制免疫信号转导，发挥抗炎作用。针对脂多糖(LPS)的纳米抗体对纯化的LPS和细菌表面的LPS均有亲和力，该纳米抗体阻断了LPS与免疫系统靶细胞的结合，从而抑制了全血中LPS介导的免疫信号通路的传导，抑制LPS触发的炎症反应。

β-葡聚糖是真菌细胞壁的特有的成分，结构高度保守，占细胞壁的50％以上，参与构成真菌细胞壁网络骨架，在维持细胞形态、强度和抗压能力等方面有重要作用，并且可以作为重要的病原分子相关模式引起宿主强烈的免疫反应。目前在真菌性角膜炎中尚未见β-葡聚糖纳米抗体相关报道。因此，本发明首次制备一种针对β-葡聚糖纳米抗体，并将其用于真菌性角膜炎的治疗，发挥其抗炎及抗真菌的作用，减轻真菌性角膜炎的严重程度。并对其应用的浓度及次数进行探索，提出真菌性角膜炎的治疗新方法，为真菌性角膜炎的临床应用提供切实可行的新思路。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提出一种特异性β-葡聚糖纳米抗体及其制备方法和应用，以解决现有抗真菌药物生物利用度低、毒性大、水溶性差、稳定性差、活性低、亲和力差、起效慢、抗炎效果差的问题，克服现有抗真菌药物生产工艺复杂、成本高、不易保存、产量低的缺陷，解决真菌性角膜炎治疗药物生物利用度低、穿透性差、角膜毒性大的问题。

为了实现上述发明目的，本发明涉及的特异性β-葡聚糖纳米抗体的制备方法包括3个工艺步骤：

(1)纳米抗体噬菌体文本库的复苏、特异性纳米抗体噬菌体的淘选及鉴定：噬菌体文本库复苏，用β-葡聚糖作为抗原进行三轮淘选后，进行多克隆噬菌体间接ELISA法验证特异性噬菌体被富集；将第三轮淘选到的噬菌体涂布到培养皿中，挑选95个单菌落噬菌体，并用单克隆噬菌体间接ELISA法对的单个噬菌体特异性进行验证，确定对β-葡聚糖特异性最强的噬菌体及其对应的目的基因序列，确定的特异性β-葡聚糖纳米抗体的目的氨基酸序列为：SMARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDSNCALSSTYWYRKKSGST NEESISKGGRCVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDSGTYRCNVCSINRT GGRAEGTRAYVYGGGTVVTVNAAA，包括117个氨基酸，发挥结合功能的CDR3区为CSINRTGGRAEGTRAYV。

(2)重组pET-28a质粒表达载体的构建：利用基因工程技术将特异性β-葡聚糖纳米抗体基因与载体质粒pET-28a连接，获取重组质粒；将重组质粒导入大肠杆菌中进行蛋白表达，以获取特异性β-葡聚糖纳米抗体。

(3)诱导特异性β-葡聚糖纳米抗体的表达及纯化：将上述大肠杆菌进行活化培养，添加终浓度为0.5mMIPTG分别在16℃下16h培养诱导β-葡聚糖纳米抗体表达；诱导表达后超声破碎菌体，破碎Buffer为：8MUrea、50mMTris-HCl、300mMNaCl的混合溶液，pH8.0；破碎后收集上清，用镍离子柱对上清进行纯化：取5mL镍填料装柱，用Bindingbuffer平衡柱子，所述的Bindingbuffer为：8MUrea、50mMTris-HCl、300mMNaCl的混合溶液，pH8.0，调整蛋白流速为5mL/min；用含有20mM咪唑的Elutionbuffer洗去杂质，再用含有50mM和100mM咪唑的Elutionbuffer清洗柱子，收集流出液；将流出液进行透析复性，复性后，12％SDS-PAGE结果显示约在17kDa处有蛋白条带，即特异性β-葡聚糖纳米抗体；这与先前研究中纳米抗体的分子量为约15kDa一致。

制备的特异性β-葡聚糖纳米抗体对β-葡聚糖具有特异性。

制备的特异性β-葡聚糖纳米抗体在体内外可有效抑制烟曲霉菌的生长。

制备的特异性β-葡聚糖纳米抗体在体内外均能有效抑制烟曲霉菌感染引起的炎症反应。

特异性β-葡聚糖纳米抗体应用于眼科，用于真菌性角膜炎的治疗，具有抗真菌、抗炎效果好、溶解度高、稳定性好、易保存、生物利用度高、穿透性好、特异性好、角膜毒性小等优点。

特异性β-葡聚糖纳米抗体用于制备特异性β-葡聚糖纳米抗体滴眼液，成分及其含量为：在每1mL缓冲溶液中含有的特异性β-葡聚糖的纳米抗体的含量为0.5mg。制备的滴眼液具有抗真菌及抗炎作用，对角膜无毒性作用。

本发明与现有技术相比，β-葡聚糖纳米抗体具有同时具有抗真菌和抗炎作用，并且生物利用度高、毒性小、水溶性好、稳定性强、活性大、亲和力好、起效快、抗炎效果好，其生产工艺简单、成本低、产量高、易保存，结构简单，易于进行基因工程化改造及批量生产；将β-葡聚糖纳米抗体应用于真菌性角膜炎治疗，显著降低角膜真菌负荷，降低炎症程度，生物利用度高、穿透性好、角膜毒性小。

附图说明：

图1是本发明中特异性β-葡聚糖纳米抗体的基因序列。

图2是本发明中特异性β-葡聚糖纳米抗体的表达载体。

图3本发明经纯化及透析复性后制得的特异性β-葡聚糖纳米抗体的蛋白电泳图。

图4是本发明中特异性β-葡聚糖纳米抗体的特异性验证。

图5是本发明制得的特异性β-葡聚糖纳米抗体在体外的抗真菌效果。

图6是本发明制得的特异性β-葡聚糖纳米抗体对永生化人角膜上皮细胞的毒性作用。

图7是本发明制得的特异性β-葡聚糖纳米抗体在小鼠真菌性角膜炎中的抗真菌及抗炎效果。

图8是本发明制得的特异性β-葡聚糖纳米抗体在人角膜上皮细胞中的抗炎效果。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及的特异性β-葡聚糖纳米抗体的制备方法包括3个工艺步骤：

(1)纳米抗体噬菌体文本库的复苏、特异性纳米抗体噬菌体的淘选及鉴定：通过辅助噬菌体侵染噬菌体文本库，达到复苏的噬菌体。依次经过三轮浓度为100ug/mL、10ug/mL、1ug/mL的β-葡聚糖抗原淘选后，进行多克隆噬菌体间接ELISA法验证特异性纳米抗体噬菌体被富集；将第三轮淘选到的特异性纳米抗体噬菌体涂布到培养皿中，挑取95个单菌落，淘选出携带特异性针对β-葡聚糖的纳米抗体的单克隆基因的噬菌体，并用单克隆噬菌体间接ELISA法对噬菌体特异性进行验证，确定对β-葡聚糖特异性最强的噬菌体及其对应的目的氨基酸序列为：SMARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDSNCAL SSTYWYRKKSGSTNEESISKGGRCVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDG TYRCNVCSINRTGGRAEGTRAYVYGGGTVVTVNAAA；

(2)重组pET-28a质粒表达载体的构建：根据步骤(1)得到的目的基因序列设计合成引物，将特异性β-葡聚糖纳米抗体基因两端加入新的NotI和BaHI酶切位点；将载体质粒pET-28a用限制性内切酶NotI和BaHI双酶切；将上述基因与酶切后的质粒混合，加入T4DNA连接酶，在16℃下经过12h连接，得到重组pET-28a质粒；12h后，将上述1μL重组pET-28a载体，通过热击法导入大肠杆菌。

(3)诱导特异性β-葡聚糖纳米抗体的表达及纯化：将上述大肠杆菌接种于LB/K50液体培养基，37℃振荡培养12h，取1mL培养液接种到1L的LB/K50液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm约0.4-0.6，添加终浓度为0.5mMIPTG在16℃下16h培养诱导蛋白。4000rpm离心10min收集诱导表达的菌体，弃掉上清，用破碎Buffer溶解沉淀；破碎Buffer成份：8MUrea、50mMTris-HCl、300mMNaCl的混合溶液，pH8.0；用镍离子柱进行蛋白纯化，取5mL镍填料装柱，用Bindingbuffer平衡柱子，所述的Bindingbuffer为：8MUrea、50mMTris-HCl、300mMNaCl的混合溶液，pH8.0，调整流速为5mL/min；用0.22μm膜对β-葡聚糖纳米抗体溶液进行滤过，收集流出液；流出液过柱子，再用含有低咪唑的Elutionbuffer清洗未结合组分，高浓度咪唑Elutionbuffer清洗蛋白，收集流出液，即纯化的β-葡聚糖；将纯化后的β-葡聚糖纳米抗体液进行透析复性，复性后，12％SDS-PAGE结果显示约在17kDa处有β-葡聚糖纳米抗体的蛋白条带；这些与先前研究中纳米抗体的分子量为约15kDa一致，证明已成功表达特异性β-葡聚糖纳米抗体。

对制备的特异性β-葡聚糖纳米抗体进行特异性验证：采用间接ELISA法验证β-葡聚糖纳米抗体对β-葡聚糖的特异性。结果显示，特异性β-葡聚糖纳米抗体与β-葡聚糖具有很强的结合能力。

实施例2：

本实施例涉及的特异性β-葡聚糖纳米抗体的体外杀菌能力验证，将特异性β-葡聚糖纳米抗体在体外作用于烟曲霉菌，显著降低烟曲霉菌的生长，菌丝数量减少，细胞壁遭到破坏。

对本实施例制备的β-葡聚糖纳米抗体进行体外抗真菌作用验证：

将本实施例中的β-葡聚糖纳米抗体溶液进行微量梯度稀释后加入96孔板，每组6孔，每孔中加入100μL已制备好的浓度为2×10⁵/mL的烟曲霉菌孢子悬液。沙氏培养基为空白对照。28℃培养箱内孵育36h。用酶标仪在570nm波长下测定β-葡聚糖纳米抗体对烟曲霉菌分生孢子的MIC。结果显示，β-葡聚糖纳米抗体显著抑制烟曲霉菌分生孢子生长。

在96孔板中加入100μL已制备好的浓度为2×10⁵/mL的烟曲霉菌孢子悬液，生长24h后长出菌丝，将培养基吸出，用PBS清洗菌丝，将本实施例中的β-葡聚糖纳米抗体溶液进行微量梯度稀释后加入96孔板，每孔100μL，沙氏培养基为空白对照。28℃培养箱内孵育24h。用酶标仪在570nm波长下测定β-葡聚糖纳米抗体对烟曲霉菌菌丝的MIC。β-葡聚糖纳米抗体显著抑制烟曲霉菌菌丝生长。

根据烟曲霉菌分生孢子MIC实验方法，采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的标准微量稀释法制备烟曲霉菌的药敏板。分别在0、24、48、72、96h测定620nm波长处的吸光度值并绘制时间杀伤曲线。各孔在620nm处的吸光度值表示各孔的菌载量。β-葡聚糖纳米抗体显著抑制烟曲霉菌菌丝生长，呈浓度依赖性，且＞1.2mg/mL的抗真菌效果持续至48h。

CalcofluorWhite荧光染料对不同分组的烟曲霉菌菌丝进行染色，采用荧光显微镜拍摄菌丝照片。PI染料对不同分组的烟曲霉菌菌丝进行染色，采用荧光显微镜拍摄菌丝照片。结果表明，β-葡聚糖纳米抗体抑制烟曲霉菌生长，破坏烟曲霉菌细胞壁和细胞膜的完整性。

实施例3：

本实施例涉及的特异性β-葡聚糖纳米抗体的应用，将特异性β-葡聚糖纳米抗体应用于眼科，用于真菌性角膜炎的治疗，有抗真菌和抗炎效果，具有生物利用度高、穿透性好、特异性好、角膜毒性小、抗炎效果好的优势。用于制备特异性β-葡聚糖纳米抗体滴眼液，成分及其含量为：在每1mL缓冲溶液中含有的特异性β-葡聚糖的纳米抗体的含量为0.5mg。

对本实施例制备的滴眼液进行体内作用验证：建立真菌性角膜炎动物模型。建模后第一天拆线，取出角膜接触镜，生理盐水冲洗结膜囊；随机选取小鼠进行结膜下注射5μL特异性β-葡聚糖纳米抗体或PBS(溶剂对照)，每组6只，然后给予小鼠β-葡聚糖纳米抗体(5μL/次)或PBS一天三次点眼治疗。在裂隙灯下拍摄小鼠角膜照片度并根据角膜的炎症程度进行临床评分。根据rt-PCR、MPO及平板计数实验等具体的实验方法及时处理小鼠角膜组织。结果表明：在烟曲霉菌感染后的3天和5天，与溶剂对照组(AF+PBS)相比，纳米抗体处理组(AF+纳米抗体)的小鼠角膜的混浊面积减小、溃疡程度减轻；纳米抗体处理显著降低感染3天和5天小鼠角膜的临床评分，差异具有统计学意义(P<0.05)。与溶剂对照组(AF+PBS)相比，纳米抗体处理组(AF+纳米抗体)的LOX-1的mRNA水平降低，MPO水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。并且β-葡聚糖纳米抗体显著降低小鼠角膜的真菌载量，具有很好的抗真菌效果。

对本实施例制备的滴眼液进行体外作用验证：将β-葡聚糖纳米抗体用于真菌刺激后的人角膜上皮细胞中，与PBS组相比，β-葡聚糖纳米抗体组炎症因子IL-6和IL-8显著下降。

进一步地，所述的特异性β-葡聚糖纳米抗体在制备成真菌性角膜炎药物时还可以制作成粉剂、药片、药膏、喷雾等不同的药物剂型。

Claims (3)

1.一种特异β-葡聚糖纳米抗体，其特征在于特异性β-葡聚糖纳米抗体的氨基酸序列为：SMARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDSNCALSSTYWYRKKSGST NEESISKGGRCVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDSGTYRCNVCSINRT GGRAEGTRAYVYGGGTVVTVNAAA，包括117个氨基酸，发挥结合功能的CDR3区为CSINRTGGRAEGTRAYV。

2.根据权利要求1所述的一种特异β-葡聚糖纳米抗体，其特征在于所述的特异β-葡聚糖纳米抗体对β-葡聚糖具有特异性，可有效抑制烟曲霉菌的生长，有效抑制烟曲霉菌感染引起的炎症反应。

3.一种特异β-葡聚糖纳米抗体的应用，其特征在于特异性β-葡聚糖纳米抗体的氨基酸序列为：SMARVDQTPQTITKETGESLTINCVLRDSNCALSSTYWYRKKSGST NEESISKGGRCVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDSGTYRCNVCSINRT GGRAEGTRAYVYGGGTVVTVNAAA，包括117个氨基酸，发挥结合功能的CDR3区为CSINRTGGRAEGTRAY，将特异性β-葡聚糖纳米抗体用于制备特异性β-葡聚糖纳米抗体滴眼液，成分及其含量为：在每1mL缓冲溶液中含有的特异性β-葡聚糖的纳米抗体的含量为0.5mg，制备的滴眼液具有抗真菌及抗炎作用，对角膜无毒性作用。

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