CN116240130A - 一株耐酸性的暗黑中华单孢菌txb1-10及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐酸性的暗黑中华单孢菌TXB1‑10及其应用。一株耐酸性菌株TXB1‑10，所述耐酸性菌株TXB1‑10的分类学名为暗黑中华单孢菌(Sinomonas atrocyanea)，于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2020984。本发明菌株TXB1‑10的LB液体培养基中含菌量为5.0×107cfu/g时，其对番茄灰霉病的EC50为131.4641mg/L，菌株TXB1‑10具有开发成杀菌剂的潜力。另外，本发明菌株TXB1‑10制成微生物活性成分后与苯醚甲环唑进行复配时，对抑制番茄灰霉病菌丝生长表现出增效作用，与单一有效成分相比，可以提高对番茄灰霉病的防治效果，可以为开发防治番茄灰霉病的生物药剂提供支持。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐酸性的暗黑中华单孢菌TXB1-10及其应用。
背景技术
番茄灰霉病是由灰葡萄孢引起的一种严重的世界性病害，主要发生在花期和结果期，可危害花、果实、叶片和茎。该病不仅在植株生长期间严重发生，而且在采收的储藏和运输过程中还可继续造成严重危害。长期以来，防治番茄灰霉病的方法主要是喷施化学杀菌剂，但由于番茄灰霉病菌具有繁殖速度快，变异度大等特点，使得番茄灰霉病菌对化学药剂容易产生抗药性。由于单一有效成分化学药剂的长期使用，番茄灰霉病对多用现有化学药剂已产生不同程度的抗药性，导致防治效果逐年降低。因此开发新型杀菌剂很好必要。
随着人们对抗药性以及食品安全问题认识的不断提高，利用生物防控技术防治植物病害成为研究热点。生物防控具有生产来源广泛，对非靶标生物安全，毒副作用小，对环境兼容性好，对有害标靶能够持续作用等优点。现有技术中已公开解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌等对番茄灰霉病具有防治作用。也有研究报道，荧光假单胞菌YG-1和化学药剂啶酰菌胺复配对番茄灰霉病的防治具有增效作用，可减少杀菌剂的施用量。
菌株TXB1-10是从广西藤县富硒区土壤中筛选出的细菌，其能显著提高土壤克交换态硒含量，对土壤硒具有活化作用。申请号CN201811201689.9，一种高效转化土壤硒的菌株培养方法中就有公开该菌株的筛选及鉴定。另外，申请号CN202110734139.9，一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法的专利中也公开了该菌株具有富硒效果。但，目前尚未见有其在农作物病害方面的相关报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐酸性的暗黑中华单孢菌TXB1-10及其应用，其具有开发成生物杀菌剂的前景，可为农作物病害的生物防治提供支持。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一个目的在于提供一株耐酸性菌株TXB1-10，所述耐酸性菌株TXB1-10的分类学名为暗黑中华单孢菌(Sinomonas atrocyanea)，于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2020984。
本发明的第二个目的在于提供所述的耐酸性菌株TXB1-10在防治农作物真菌性病害中的用途。
作为优选，所述农作物真菌性病害包括灰霉病。
本发明的第三个目的在于提供一种生物杀菌组合物，其有效成分由微生物活性成分和化学活性成分复配而成；其中，所述微生物活性成分由权利要求1所述的耐酸性菌株TXB1-10制备而成；所述化学活性成分为苯醚甲环唑。
作为优选，所述微生物活性成分的制备方法为：
S1.将所述耐酸性菌株TXB1-10平板划线纯化分离后获得单菌落；
S2.将S1获得的单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180r/min的摇床中振荡培养12h，用LB液体培养基调整培养液含菌量至5.0×107cfu/g，即得所述微生物活性成分。
作为优选，所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，调节pH至7.0。
作为优选，所述微生物活性成分和化学活性成分的质量比为1-35：10-1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明菌株TXB1-10的LB液体培养基中含菌量为5.0×107cfu/g时，其对番茄灰霉病的EC50为131.4641mg/L，菌株TXB1-10具有开发成杀菌剂的潜力。
(2)本发明菌株TXB1-10制成微生物活性成分后与苯醚甲环唑进行复配时，对抑制番茄灰霉病菌丝生长表现出增效作用，与单一有效成分相比，可以提高对番茄灰霉病的防治效果，可以为开发防治番茄灰霉病的生物药剂提供支持。
保藏信息说明
暗黑中华单胞菌(Sinomonas atrocyanea)菌株TXB1-10，其保藏编号为CCTCC No：M 2020984，保藏日期为2020年12月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：菌株TXB1-10对番茄灰霉病病原菌的毒力测定
本实施例中的菌株TXB1-10已在申请号为：CN202110734139.9，专利名称为：一种富硒蔬菜专用菌肥及其制备方法的专利中公开。本实施例只对该菌株TXB1-10对番茄灰霉病病原菌的抑制效果进行研究。
1.供试菌株
番茄灰霉病病原菌，采集自广西壮族自治区农业科学院番茄试验地内感染番茄灰霉病番茄植株，在实验室内分离纯化，保存于PDA培养基中。
其中，PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。
2.供试药剂
微生物活性成分：将菌株TXB1-10平板划线纯化分离后获得单菌落；将获得的单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180r/min的摇床中振荡培养12h，再用LB液体培养基调整培养液含菌量至5.0×107cfu/g，即得所述微生物活性成分。
其中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，调节pH至7.0。
3.试验方法
采用菌丝生长速率法。用0.1％吐温-80水溶液稀释微生物活性成分，按等比方法设置5个质量浓度梯度。将预先融化的PDA培养基9mL加入无菌锥形瓶中，从低浓度到高浓度依次定量吸取药液1mL，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀后倒入直径为9cm的培养皿中，制成相应浓度的含药平板；并设不含药剂的处理作空白对照，每个处理设置10个重复。
用打孔器在供试菌株菌落边缘切取直径5mm的菌饼，接种于含药平板和空白对照平板中央，盖上皿盖后置于25℃恒温箱培养。待空白对照的菌落直径接近培养皿直径的2/3时，用十字交叉法测量菌落直径，计算药剂处理对靶标病菌菌丝生长的抑制率。
4.数据分析
采用DPS软件进行数据统计分析，以药剂浓度对数值为x，对应的菌丝生长抑制率几率值为y进行线性回归，得出毒力回归方程及药剂对靶标病菌的毒力EC50值，结果见表1。
表1微生物活性成分对番茄灰霉病病原菌的毒力测定
由表1知，微生物活性成分对番茄灰霉病病原菌的EC50为131.4641mg/L，菌株TXB1-10具有开发成杀菌剂的潜力。
实施例2：化学药剂对菌株TXB1-10的相容性试验
1.供试化学药剂
97％戊唑醇原药(江苏丰登作物保护有限公司)
95％苯醚甲环唑原药(江苏优嘉植物保护有限公司)
98％百菌清原药(内蒙古白凌科技有限公司)
95％甲基硫菌灵原药(山东华阳农药化工集团有限公司)
98.5％腐霉利原药(浙江禾本科技股份有限公司)
98％咪鲜胺原药(绍兴东湖高科股份有限公司)
2.试验方法
将供试化学药剂先用二甲基亚砜溶解，再用0.1％吐温-80水溶液稀释，分别配置成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/L的药液。将预先融化的PDA培养基9mL加入无菌锥形瓶中，从低浓度到高浓度依次定量吸取药液1mL，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀后倒入直径为9cm的培养皿中，制成相应浓度的含药平板，并设加等量清水的处理作为空白对照，每个处理设置5次重复。
用移液器吸取100μL实施例1中制备的微生物活性成分均匀涂布于含药平板表面和空白对照平板表面，置于37℃的恒温培养箱中培养，在5d时采用平板稀释法检测菌体生长情况，统计并记录菌落数量。
结果：在0.05-0.5mg/L时，6种化学杀菌剂与菌株TXB1-10的相容性均较好，菌株TXB1-10均能正常生长；在1.0mg/L时，菌株TXB1-10在戊唑醇、百菌清和腐霉利平板上停止生长；在2.0mg/L时，菌株TXB1-10在甲基硫菌灵和咪鲜胺平板上停止生长，此时，菌株TXB1-10在苯醚甲环唑平板上仍可生长，但相较低浓度菌落数量明显减少。因此，选择苯醚甲环唑作为菌株TXB1-10复配剂的化学因子。
实施例3：菌株TXB1-10复配对番茄灰霉病病原菌的毒力测定
1.供试菌株
番茄灰霉病病原菌，采集自广西壮族自治区农业科学院番茄试验地内感染番茄灰霉病番茄植株，在实验室内分离纯化，保存于PDA培养基中。
其中，PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1L，调节pH至7.0。
2.供试药剂
微生物活性成分：将菌株TXB1-10平板划线纯化分离后获得单菌落；将获得的单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180r/min的摇床中振荡培养12h，再用LB液体培养基调整培养液含菌量至5.0×107cfu/g，即得所述微生物活性成分。其中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，调节pH至7.0。
化学活性成分：95％苯醚甲环唑原药(江苏优嘉植物保护有限公司)
3.试验方法(采用菌丝生长速率法)
微生物活性成分直接用0.1％吐温-80水溶液稀释配制成单剂母液；苯醚甲环唑原药先用二甲基亚砜溶解，再用0.1％吐温-80水溶液稀释成单剂母液；设置多组配比，各单剂和配比混剂均按等比方法设置5个质量浓度梯度。所有药剂现配现用。
将预先融化的PDA培养基9mL加入无菌锥形瓶中，从低浓度到高浓度依次定量吸取药液1mL，分别加入上述锥形瓶中，充分摇匀后倒入直径为9cm的培养皿中，制成相应浓度的含药平板；并设不含药剂的处理作空白对照，每个处理设置10个重复。
用打孔器在供试菌株菌落边缘切取直径5mm的菌饼，接种于含药平板和空白对照平板中央，盖上皿盖后置于25℃恒温箱培养。待空白对照的菌落直径接近培养皿直径的2/3时，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同药剂处理对靶标病菌菌丝生长的抑制率。
4.数据分析
采用DPS软件进行数据统计分析，以药剂浓度对数值为x，对应的菌丝生长抑制率几率值为y进行线性回归，得出毒力回归方程及药剂对靶标病菌的毒力EC50值，并根据Wadlley法评价增效作用。
SR≥1.5表示具有增效作用；SR≤0.5表示具有拮抗作用；0.5＜SR＜1.5表示具有相加作用，结果见表2。
表2微生物活性成分(A)和苯醚甲环唑(B)复配对番茄灰霉病的毒力
由表2可知，微生物活性成分和苯醚甲环唑复配后对抑制番茄灰霉病菌丝生长表现出增效作用，与单一有效成分相比，可以提高对番茄灰霉病的防治效果，可以为开发防治番茄灰霉病的生物药剂提供支持。
实施例4：菌株TXB1-10耐酸性测试
4.1培养基耐酸性试验
营养琼脂培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，分别用HCl和NaOH调节营养琼脂培养基pH值，设置6个pH值梯度处理：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，120℃灭菌20min后倒入直径9cm的培养皿中，每皿20mL。吸取10μL处于对数生长期的TXB1-10菌液到pH梯度平板上，置于37℃恒温培养箱中培养48h，观察菌株TXB1-10的生长情况。
结果表明，菌株TXB1-10在pH4.5-7.0营养琼脂平板上均能生长。
4.2土壤中耐酸性试验
土壤1：pH5.88
土壤2：pH4.86
每培养皿分别装灭菌土50g，接种处于对数生长期的TXB1-10菌液5mL，加入灭菌水10mL，搅拌均匀，定期补水，控制土壤水分含量30％左右，于0、7、14、21、35、49d取样进行细菌计数。
结果表明，菌株TXB1-10在土壤1中生长维持在107-108数量水平；在土壤2中生长维持在108-109数量水平。菌株TXB1-10在土壤2中的定殖能力较在土壤1中强，菌株TXB1-10具有较强的耐酸能力。
对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一株耐酸性菌株TXB1-10，其特征在于，所述耐酸性菌株TXB1-10的分类学名为暗黑中华单孢菌(Sinomonas atrocyanea)，于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2020984。
2.根据权利要求1所述的耐酸性菌株TXB1-10在防治农作物真菌性病害中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述农作物真菌性病害包括灰霉病。
4.一种生物杀菌组合物，其特征在于，其有效成分由微生物活性成分和化学活性成分复配而成；其中，所述微生物活性成分由权利要求1所述的耐酸性菌株TXB1-10制备而成；所述化学活性成分为苯醚甲环唑。
5.根据权利要求4所述的生物杀菌组合物，其特征在于，所述微生物活性成分的制备方法为：
S1.将所述耐酸性菌株TXB1-10平板划线纯化分离后获得单菌落；
S2.将S1获得的单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180r/min的摇床中振荡培养12h，用LB液体培养基调整培养液含菌量至5.0×107cfu/g，即得所述微生物活性成分。
6.根据权利要求5所述的生物杀菌组合物，其特征在于，所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，调节pH至7.0。
7.根据权利要求4所述的生物杀菌组合物，其特征在于，所述微生物活性成分和化学活性成分的质量比为1-35：10-1。
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