CN116239692A - 分离的抗体、包含该抗体的car及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的分离的抗体、编码该抗体的分离核酸、包含该抗体的嵌合抗原受体、包含该嵌合抗原受体的细胞以及它们的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的分离的抗体、包含该抗体的嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor,CAR)、包含该嵌合抗原受体的细胞及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体是一种人工合成的受体分子，将其转入T细胞后形成的CAR-T细胞利用抗原抗体结合机制与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活T细胞，特异性识别并杀伤肿瘤(Jackson H J et al.,Nature Reviews Clinical Oncology,2016,13(6):370-383)。CAR-T细胞识别肿瘤抗原不受人白细胞抗原(HLA)限制，能有效避免肿瘤细胞通过下调主要组织相容性复合体(MHC)分子表达而产生的免疫逃逸(Fesnak A D et al.,NatureReviews Cancer,2016,16(9):566-581)。
CAR的结构通常包括胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号域(Gross etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10024,1989；Eshhar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:720,1993)。第一代CAR胞内信号转导区只包含单一的CD3ζ链，CAR-T细胞活化效率低，体内存活时间短。第二代CAR增加了胞内共刺激域，如CD27、CD28、CD134(OX40)或CD137(4-1BB)等，可使CAR-T细胞持续增殖并释放细胞因子，增强抗肿瘤活性(Imai et al.,Leukemia 18:676,2004；Zhao et al.,Cancer Cell 28:415,2015)。第三代CAR使用两个共刺激域(Zhong et al.,Mol.Ther.18:413,2010)。第四代CAR除了嵌合抗原受体基因外，还整合表达了细胞因子、共刺激受体或配体、趋化因子、蛋白酶、抗体、或自杀开关等，可以增强CAR-T细胞的激活、扩增和杀伤，或增加肿瘤局部的趋化以及招募，或活化其它免疫细胞等。
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是起源于骨髓造血细胞的血液系统恶性肿瘤，是继非霍奇金淋巴瘤之后血液系统第二常见的恶性肿瘤。MM在我国的年发病率约为1.5-2.0/10万左右，约占所有肿瘤的1％，血液系统肿瘤的10％，属于发病相对比较罕见的血液肿瘤。相比于白血病、淋巴瘤等血液系统常见肿瘤，MM的致死率更高，每年11400患者死亡，且多发于老年患者，平均发病年龄约为65岁。MM虽然可以治疗，但是目前仍无法治愈。
自2000年以来，MM患者的总生存率显著提高，这主要是由于自体造血干细胞移植、蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物等新疗法的广泛使用，以及移植后维持治疗的采用(Holstein et al.,Ther Adv Hematol.9:175,2018)。2015年美国FDA批准了CD38单克隆抗体达雷妥尤单抗用于治疗MM，随后单克隆抗体、抗体-药物偶联物、双特异性抗体和CAR-T细胞疗法等新型免疫疗法都得到了积极研究。
CAR-T细胞疗法在治疗复发性和/或难治性MM方面显示出巨大的潜力。美国FDA于2021年3月批准了首个用于复发性和/或难治性MM的BCMA CAR-T细胞疗法。其他许多靶向MM的CAR-T正在开展临床研究，预计更多的骨髓瘤CAR-T将在不久的将来获得批准上市。尽管如此，大部分接受CAR-T治疗的患者仍然复发，因此发展新一代的高效持久的CAR-T是目前临床所急需的。
靶点的选择、CAR的分子结构、CAR-T制备工艺是CAR-T治疗MM需要考虑的因素。BCMA是特异表达在MM细胞上的受体蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族，结合B细胞活化因子以及增殖诱导配体，进而促进MM细胞生长和骨髓基质细胞的黏附，BCMA抗体对MM细胞系和原代MM细胞都具有杀伤作用。BCMA 缺陷小鼠的B细胞数量正常，但B细胞功能受到抑制。上述研究结果提示BCMA适合作为MM治疗的靶点，并不会引起正常B细胞的功能受到明显影响。研究已证实了抗BCMA CAR-T细胞治疗MM的有效性，并且发现BCMA呈现出一个非常有限的RNA表达模式。除浆细胞外，BCMA蛋白在正常组织上未检出，在CD34+的造血细胞上也未检出，因此BCMA是MM相对有效且安全的CAR-T治疗靶点。
为了确保CAR-T靶向BCMA的安全性，需要CAR分子中的单链抗体片段(singlechain variable fragment,scFv)能特异并有效识别和结合肿瘤细胞上高表达的BCMA，除scFv之外，CAR结构设计主要还考虑胞内信号域的设计，以增强CAR-T对靶细胞的体内扩增能力和安全性。
发明内容
目前已知的靶向BCMA的CAR分子通常采用基于4-1BB共刺激信号域和CD3ζ信号域的二代CAR设计，这些CAR-T在患者治疗后的1-3个月通常能有效抑制MM细胞，但部分患者会在3个月后出现肿瘤复发，BCMA CAR-T的长期疗效亟待提高。CAR-T识别肿瘤抗原后，如果其胞内信号传递过强或过弱，会影响CAR-T形成免疫突触的质量，从而影响CAR-T细胞在体内的存活、扩增、对肿瘤细胞杀伤性能的持续性及整个免疫系统功能的调节，最终体现为临床疗效和安全性的差异。
本发明首先对靶向BCMA的CAR分子的抗原识别域进行氨基酸单点突变的改造，比较不同scFv的CAR-T细胞对MM肿瘤细胞的抑制情况；接着，本发明针对CD3ζ信号域信号传导的原理，对CD3ζ信号域进行不同氨基酸突变的设计；最后，本发明在共刺激信号域4-1BB的基础上，引入第二共刺激受体OX40，提高CAR-T的肿瘤杀伤和存活能力，以获得疗效更持久的BCMA CAR-T细胞。与现有CAR-T相比，本发明能显著提高靶向BCMA的CAR-T细胞在体内的扩增效率和持续时间，提高杀伤肿瘤的效能，最终达到提高临床疗效和减少肿瘤复发的目的。
具体地，本发明涉及：
(1)一种分离的抗体，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
(2)上述(1)所述的抗体，特异性结合BCMA。
(3)一种分离的核酸，其编码上述(1)或(2)所述的抗体。
(4)一种克隆载体或表达载体，其包含上述(3)所述的核酸。
(5)一种宿主细胞，其包括如上述(4)所述的载体。
(6)嵌合抗原受体，其包含上述(1)或(2)所述的抗体。
(7)上述(6)所述的嵌合抗原受体，其进一步包含天然的CD3ζ信号域或改造的CD3ζ信号域；
所述天然的CD3ζ信号域包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成；
所述改造的CD3ζ信号域包含如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
(8)上述(7)所述的嵌合抗原受体，其中CD3ζ信号域C端增加通过连接子连接的OX40蛋白，包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成，所述连接子优选为P2A自剪切肽。
(9)上述(6)至(8)中任意一项所述的嵌合抗原受体，其进一步包含来自4-1BB、CD28、CD27、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD-2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激信号域。
(10)上述(6)至(9)中任意一项所述的嵌合抗原受体，其进一步包含铰链区和跨膜区，铰链区和跨膜区优选来自CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、CD34等的铰链区或跨膜区
(11)上述(6)至(10)中任意一项所述的嵌合抗原受体，其包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
(12)一种细胞，其包含上述(6)至(11)中任意一项所述的嵌合抗原受体，所述细胞不为生殖细胞或受精卵。
(13)上述(12)所述的细胞，其为免疫细胞。
(14)上述(13)所述的细胞，其为T细胞。
(15)上述(1)或(2)所述的分离的抗体、上述(6)至(11)中任意一项所述的嵌合抗原受体、上述(12)至(14)中任意一项所述的动物细胞在制备用于预防或治疗B细胞相关疾病中的用途。
(16)上述(15)所述的用途，所述B细胞相关疾病选自：多发性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、视神经脊髓炎谱系疾病、系统性红斑狼疮、多毛细胞白血病或脊髓发育不良。
附图说明
图1是本发明实施例中各BCMA CAR分子的结构示意图。
图2表示本发明实施例中装载各BCMA CAR基因的慢病毒在T细胞中的转导效率。
图3表示本发明实施例中包含不同改造的C11D5.3 scFv的BCMA CAR-T杀伤靶细胞的效率。
图4表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T细胞在U266细胞刺激不同天数的增殖。
图5表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在NCI-H929细胞刺激下的细胞因子分泌。
图6表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在静息状态下的增殖。
图7表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T对靶细胞的杀伤效率。
图8表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在静息状态及U266细胞刺激下的分化。
图9表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在静息状态及U266细胞刺激下的耗竭相关分子表达。
图10表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在静息状态及U266细胞刺激下的凋亡。
图11表示本发明实施例中另一部分BCMA CAR-T在静息状态下的增殖。
图12表示本发明实施例中另一部分BCMA CAR-T对靶细胞的杀伤效率。
图13表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效果。
图14表示本发明实施例中部分BCMA CAR-T在荷瘤小鼠外周血中的数量变化。
图15表示本发明实施例中S206T突变的scFv-Fc与人BCMA蛋白的亲和力。
具体实施方式
1.靶向BCMA CAR分子抗原识别域的设计
本发明以特异识别BCMA靶点的小鼠单克隆抗体C11D5.3的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(序列来自CN 201510142069.2)为基础设计scFv，scFv的氨基酸序列如SEQID NO:1，核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
本发明中，将抗体C11D5.3 scFv的框架区氨基酸进行选择性单点突变，包括将SEQID NO:1所示氨基酸序列中的S206突变为T，或T207突变为S，或L210突变为I，或L50突变为I，或S69突变为T，并分别用C11D5.3 scFv和上述各种突变的scFv，与CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区连接构建CAR基因。其中，S206突变为T的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:3，核苷酸序列如SEQ ID NO:4。
2.靶向BCMA CAR分子胞内信号域的设计
以CD3ζ信号域的天然序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:5，对应于NP_000725.1中胞内区的氨基酸片段)为基础，设计CAR分子的CD3ζ信号域，包括：
1)将CD3ζ信号域的天然序列中的近膜端氨基酸Q14替代成K；
2)将CD3ζ信号域的天然序列中的近膜端氨基酸V2替代成L，D9替代成E，Q15替代成K；
3)将CD3ζ信号域的天然序列中的酪氨酸磷酸化位点Y90替代成F。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域-1包含Q14K替代。氨基酸序列如SEQ IDNO:6，核苷酸序列如SEQ ID NO:7。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域-2包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代。氨基酸序列如SEQ ID NO:8，核苷酸序列如SEQ ID NO:9。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域包含Q14K替代，同时CD3ζ信号域C端增加P2A自剪切肽序列连接的OX40蛋白。氨基酸序列如SEQ ID NO:10，核苷酸序列如SEQ ID NO:11。
在一个实施方案中，改造后的CD3ζ信号域包含V2L、D9E、Q15K和Y90F替代，同时CD3ζ信号域C端增加P2A自剪切肽序列连接的OX40蛋白。氨基酸序列如SEQ ID NO:12，核苷酸序列如SEQ ID NO:13。
OX40蛋白是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族，是一个重要的共刺激受体，主要表达在活化的T细胞，能够减少细胞凋亡相关的基因表达，促进T细胞的存活，增殖及记忆T细胞的生成。OX40蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。P2A自剪切肽序列如SEQ ID NO:25所示。
3.BCMA CAR分子的组成
本发明一方面涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其包含如上文所述的改造的来自C11D5.3的scFv分子、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、如上文所述的CD3ζ信号域及共刺激受体OX40等构件。除非特殊说明，这些构件可以任意组合。
在一个实施方案中，本发明以一种包含未改造的来自C11D5.3的scFv、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体(CAR-0)为对比例，其氨基酸序列为SEQ ID NO：14，核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含改造的(将S206氨基酸突变为T)来自C11D5.3的scFv、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体(CAR-1)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：16，核苷酸序列为SEQ ID NO：17。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含未改造的来自C11D5.3的scFv、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、改造的CD3ζ信号域-2的嵌合抗原受体(CAR-2)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：18，核苷酸序列为SEQ ID NO：19。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含改造的(将S206氨基酸突变为T)来自C11D5.3的scFv、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、改造的CD3ζ信号域-1、以及天然的OX40的嵌合抗原受体(CAR-3)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：20，核苷酸序列为SEQ ID NO：21。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含改造的(将S206氨基酸突变为T)来自C11D5.3的scFv、来自CD8α的铰链区和跨膜区、来自4-1BB的共刺激信号域、改造的CD3ζ信号域-2、以及天然的OX40的嵌合抗原受体(CAR-4)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：22，核苷酸序列为SEQ ID NO：23。
实施例
实施例1：BCMA CAR分子的设计
本实施例以设计具有不同抗原识别域、CD3ζ信号域和引入共刺激分子设计的BCMACAR分子，以及CAR-T细胞制备为例。
抗原识别域设计原则：在不改变C11D5.3 scFv性质和功能的同时，对C11D5.3scFv的框架区进行单点氨基酸突变的改造，例如将C11D5.3 scFv第206位的丝氨酸突变为苏氨酸。
CD3ζ信号域设计原则：通过对CD3ζ胞内信号区与信号传递相关的氨基酸位点进行改造，最终达到改善CAR-T细胞胞内信号传递通路，提升CAR-T细胞在体内的扩增能力、持续能力、改善细胞因子分泌状况，进而提升CAR-T细胞抗瘤性能。
共刺激分子OX40设计原则：通过引入第二共刺激受体OX40分子，达到改善CAR-T细胞凋亡，提升CAR-T细胞在体内的扩增能力、杀伤能力以及记忆T细胞的生成，进而提升CAR-T细胞强而持久的抗瘤性能。
未改造的C11D5.3 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:1；未改造的CD3ζ信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5。
包含未改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体(CAR-0)的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。包含S206突变为T的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体(CAR-1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。包含未改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-2的嵌合抗原受体(CAR-2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。包含改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域-1和天然的OX40的嵌合抗原受体(CAR-3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。包含改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域-2和天然的OX40的嵌合抗原受体(CAR-4)的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。包含T207突变为S的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体为CAR-5，包含L210突变为I的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体为CAR-6，包含L50突变为I的C11D5.3scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体为CAR-7，包含S69突变为T的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合抗原受体为CAR-8。以上CAR分子结构如图1所示。
实施例2：靶向BCMA的CAR慢病毒转移质粒的构建和慢病毒制备
1)将编码靶向BCMA的scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因通过基因合成的方法合成，将编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过基因合成的方法合成，将编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-2的嵌合基因通过基因合成的方法合成，将编码P2A和OX40的嵌合基因通过基因合成的方法合成。以上所有基因委托北京博迈德基因技术有限公司合成。
2)将编码靶向C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-0基因片段；
将编码S206突变为T的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-1基因片段；
将编码C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-2的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-2基因片段；
将编码S206突变为T的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-1的嵌合基因、编码P2A和OX40的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-3基因片段；
将编码S206突变为T的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和CD3ζ信号域-2的嵌合基因、编码P2A和OX40的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-4基因片段；
将编码T207突变为S的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-5基因片段；
将编码L210突变为I的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-6基因片段；
将编码L50突变为I的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-7基因片段；
将编码S69突变为T的C11D5.3 scFv、CD8α铰链区及跨膜区的嵌合基因、编码4-1BB胞内区和改造的CD3ζ信号域-1的嵌合基因通过同源重组方法，克隆出CAR-8基因片段。
3)将慢病毒载体pLenti6.3/V5(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)用XbaI和SalI(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳和DNA凝胶回收试剂盒(北京全式金生物)回收质粒片段；将CAR-0、CAR-1、CAR-2、CAR-3、CAR-4、CAR-5、CAR-6、CAR-7、CAR-8基因片段分别用XbaI和SalI进行双酶切，利用琼脂糖凝胶电泳和DNA凝胶回收试剂盒回收基因片段；将双酶切的质粒片段和基因片段用DNA连接酶进行拼接，获得完整的CAR质粒。
4)将慢病毒包装质粒pLP/VSVG,pLP1/MDK,pLP2/RSK(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)与步骤3)获得的CAR质粒，用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)转染至HEK293T细胞，48小时后收集培养基，300g离心去除细胞碎片后，用超速离心机25000rpm离心3小时。将沉淀用1mL生理盐水溶解，即为所需的慢病毒载体。
实施例3：CAR-T细胞制备
使用CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher)从健康志愿者的外周血单个核细胞(妙通(上海)生物科技有限公司，中国)中分离T细胞，将分离得到的T细胞(此时的T细胞与CD3/CD28 Dynabeads连在一起)在含IL-2(500IU/mL)的新鲜X-VIVO 15培养体系中培养24小时后，用上述慢病毒载体感染T细胞。转导CAR-0、CAR-1、CAR-2、CAR-3、CAR-4、CAR-5、CAR-6、CAR-7、CAR-8基因的T细胞，分别记为CAR-T-0、CAR-T-1、CAR-T-2、CAR-T-3、CAR-T-4、CAR-T-5、CAR-T-6、CAR-T-7、CAR-T-8。病毒感染细胞24小时后，细胞离心换液，并于上述培养体系中继续培养。细胞培养4天后，收集培养体系中的所有细胞，并用磁力架去除培养体系中的Dynabeads，离心并计数。将CAR-T与荧光蛋白PE标记的BCMA蛋白(北京百普赛斯生物科技有限公司)室温孵育20分钟，用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，SanDiego，CA，USA)检测各组细胞CAR含量。图2显示，在慢病毒感染MOI＝1时，CAR-0、CAR-1、CAR-2、CAR-3、CAR-4基因的转导效率在60-80％之间，CAR-5、CAR-6、CAR-7、CAR-8基因的转导效率在40-60％之间。
实施例4：包含不同改造的C11D5.3 scFv的BCMA CAR-T杀伤靶细胞的效率
本实施例以比较包含不同改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-1、CAR-T-5、CAR-T-6、CAR-T-7、CAR-T-8，以及包含未改造的C11D5.3scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-0对表达BCMA的靶细胞的杀伤效率为例。
利用1mL生理盐水重悬U266及NCI-H929靶细胞，加入10μL Calcein-AM(浓度1μg/μL，ThermoFisher,USA)，轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育10min，以标记靶细胞。向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1×105个上述标记的U266及NCI-H929细胞，按E:T＝3:1加入不同CAR-T，同时加一组不转导CAR基因的T细胞(与CAR-T细胞总数相同)以供对照实验使用。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育5h，用荧光酶标仪(Varioscan Lux,ThermoFisher)检测细胞上清的荧光值(激发波长:495nm，发射波长:515nm)。
图3显示，所有CAR-T均能通过识别BCMA靶蛋白有效杀伤U266和NCI-H929细胞；与其它CAR-T相比，CAR-T-1对两种肿瘤细胞的杀伤效率更稳定。
实施例5：包含改造的C11D5.3 scFv的BCMA CAR-T的体外扩增
本实施例以比较包含未改造的C11D5.3 scFv的CAR-T-0、包含改造的C11D5.3scFv的CAR-T-1在表达BCMA的U266刺激下的增殖为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入2×105个U266细胞(北京协和细胞资源中心提供)，按CAR-T：肿瘤细胞(E:T)＝5:1加入各种CAR-T细胞，根据各种CAR-T的CAR比例，将各组T细胞补齐，使各组CAR-T和T细胞总数相同。随后置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，在培养2天和7天时，分别用台盼蓝将细胞染色，统计活细胞总数，用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各组细胞中CAR-T的比例，计算出各组中CAR-T的增殖倍数。
图4显示，与包含未改造的C11D5.3 scFv的CAR-T-0相比，包含改造的C11D5.3scFv的CAR-T-1在U266靶细胞刺激下的增殖效率明显提高，说明该构件改造能增强CAR-T在靶细胞刺激下的扩增效率。
实施例6：包含改造的C11D5.3 scFv的BCMA CAR-T在靶细胞刺激下的细胞因子分泌
本实施例以比较包含未改造的C11D5.3 scFv的CAR-T-0、包含改造的C11D5.3scFv的CAR-T-1在表达BCMA的NCI-H929(北京协和细胞资源中心提供)靶细胞刺激下的细胞因子分泌为例。
向96孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1×105个NCI-H929细胞，按E:T＝1:1加入各种CAR-T细胞，培养总体积为500μL。随后置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养5小时，用Cytometric Bead Array(CBA)kits(BD Biosciences)标记各组上清中TNF和IFN-γ，用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各组上清中TNF和IFN-γ的分泌情况。
图5显示，包含改造的C11D5.3 scFv的CAR-T-1和未改造的C11D5.3 scFv的CAR-T-0能通过识别BCMA靶蛋白分泌细胞因子，且CAR-T-1分泌水平更高，说明在与靶细胞孵育的短时间内，这些CAR-T细胞均能被激活并分泌细胞因子，且改造后的C11D5.3 scFv能使CAR-T细胞具有更强的细胞因子分泌能力，为体内有效免疫调节提供了基础。
实施例7：包含改造的CD3ζ的BCMA CAR-T的体外扩增
本实施例以比较包含改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-0、包含改造的CD3ζ信号域-2的CAR-T-2在体外静息下的增殖效率为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入相同总数的各CAR-T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养8天后，用台盼蓝将细胞染色，统计活细胞总数，计算出各组CAR-T细胞总数的增殖倍数。
图6显示，与CAR-T-0相比，CAR-T-2在体外静息下的增殖效率有所提高，说明CD3ζ信号域-2比CD3ζ信号域-1能更有效地促进CAR-T细胞在培养过程中的扩增。
实施例8：包含OX40的BCMA CAR-T杀伤靶细胞的效率
本实施例以比较包含改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-1，以及包含改造的C11D5.3 scFv、改造的来自CD3ζ信号域-1和天然OX40的CAR-T-3对表达BCMA的靶细胞的杀伤效率为例。
利用1mL生理盐水重悬U266及NCI-H929靶细胞，加入10μL Calcein-AM(浓度1μg/μL，ThermoFisher,USA)，轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育10min，以标记靶细胞。向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1×105个上述标记的U266及NCI-H929细胞，按E:T＝1:1、3:1加入不同CAR-T，同时加一组不转导CAR基因的T细胞(与CAR-T细胞总数相同)以供对照实验使用。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育5h，用荧光酶标仪(Varioscan Lux,ThermoFisher)检测细胞上清的荧光值(激发波长:495nm，发射波长:515nm)。
图7显示，包含或不包含OX40的CAR-T均能通过识别BCMA靶蛋白有效杀伤U266和NCI-H929细胞；与CAR-T-1相比，包含OX40的CAR-T-3具有更强的杀伤能力。以上数据说明在与靶细胞孵育的短时间内，这些CAR-T细胞均能被激活并裂解靶细胞，且包含OX40的CAR-T-3具有更强的杀伤能力，为体内有效杀伤肿瘤细胞提供了基础。
实施例9：包含OX40的BCMA CAR-T在靶细胞刺激下的分化
本实施例以比较包含改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-1，以及包含改造的C11D5.3 scFv、改造的来自CD3ζ信号域-1和天然OX40的CAR-T-3在表达BCMA的U266靶细胞刺激下的细胞分化为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1.5×106个CAR-T细胞，按E:T＝5:1加入U266细胞，同时加一组无靶细胞刺激的静息组为对照。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4天后，将CAR-T与PE标记的BCMA蛋白、CD4-BV750抗体(Biolegend)、CD8-Percp-eFlour710抗体(Biolegend)、CD45RA-BV510抗体(Biolegend)、CD62L-APC-Fire750抗体(Biolegend)在室温孵育20分钟，用全光谱流式细胞仪(
Aurora)检测各组细胞中CAR-T的分化。
图8所示，观察在不同的细胞亚群中(CD4+、CD8+)，无论是静息还是刺激下，各个CAR-T的分化趋势较一致。包含OX40的CAR-T-3在静息下初始/记忆性干细胞样T细胞(CD62L+CD45RA+)的未分化细胞比例略微高于对照CAR-T-1，并且在U266靶细胞刺激下该差异更显著，包含OX40的CAR-T-3的初始/记忆性干细胞样T细胞比例明显高于不包含OX40的CAR-T-1。上述数据说明OX40的表达能使CAR-T细胞的初始/记忆性干细胞样比例升高，使CAR-T在接受靶抗原的刺激后具有更优的持续性。
实施例10：包含OX40的BCMA CAR-T在靶细胞刺激下的耗竭相关蛋白表达
本实施例以比较包含改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-1，以及包含改造的C11D5.3 scFv、改造的来自CD3ζ信号域-1和天然OX40的CAR-T-3在表达BCMA的U266靶细胞刺激下的T细胞耗竭相关蛋白为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1.5×106个CAR-T细胞，按E:T＝5:1加入U266细胞，同时加一组无靶细胞刺激的静息组为对照。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4天后，将细胞与PE标记的BCMA蛋白、CD4-BV750抗体(Biolegend)、CD8-Percp-eFlour710抗体(Biolegend)、PD-1-BV650抗体(Biolegend)、LAG-3-PE/Cy7抗体(Biolegend)室温孵育20分钟，用全光谱流式细胞仪(
Aurora)检测各组细胞中CAR-T的耗竭。
图9所示，包含OX40的CAR-T-3与不包含OX40的CAR-T-1相比，耗竭相关蛋白分子PD-1+、LAG-3+、PD-1+LAG-3+的细胞团比例在静息下无明显差异或略微高，而在U266靶细胞刺激下，包含OX40的CAR-T-3的耗竭分子细胞比例明显低于不包含OX40的CAR-T-1，说明OX40的表达可减缓CAR-T的耗竭，进而提高体内持续的抗肿瘤作用。
实施例11：包含OX40的BCMA CAR-T在靶细胞刺激下的凋亡
本实施例以比较包含改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-1，以及包含改造的C11D5.3 scFv、改造的来自CD3ζ信号域-1和天然OX40的CAR-T-3在表达BCMA的U266靶细胞刺激下的细胞凋亡为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1.5×106个CAR-T细胞，按E:T＝5:1加入U266细胞，同时加一组无靶细胞刺激的静息组为对照。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4天后，将细胞与PE标记的BCMA蛋白、7-AAD抗体(BD)、Annexin V-BV421抗体(Biolegend)室温孵育20分钟，用全光谱流式细胞仪(
Aurora)检测各组细胞的凋亡水平。
图10所示，包含OX40设计的CAR-T-3与不包含OX40的CAR-T-1相比，早期凋亡Annexin V-BV421+7-AAD-细胞团在静息下无明显差异或略微高，而在U266靶细胞刺激下，包含OX40的CAR-T-3的早期凋亡Annexin V-BV421+7-AAD-细胞团比例明显低于不包含OX40的CAR-T-1，说明OX40的表达可减缓CAR-T的凋亡，进而提高体内持续的抗肿瘤作用。
实施例12：包含改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域和OX40的BCMA CAR-T的体外扩增
本实施例以比较包含未改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-0，以及包含改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域-2和天然OX40的CAR-T-4在体外静息下的增殖效率为例。
向6孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入相同总数的各CAR-T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，在第4、8天，用台盼蓝将细胞染色，统计活细胞总数，用流式细胞仪(NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA，USA)检测各组细胞中CAR-T的比例，计算出培养第6至8天各组CAR-T的增殖倍数。
图11显示，与CAR-T-0相比，CAR-T-4在体外静息下的增殖效率明显提高，说明scFv、CD3ζ信号域和OX40等构件的组合改造能增强CAR-T的扩增效率。
实施例13：包含改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域和OX40的BCMA CAR-T的杀伤靶细胞的效率
本实施例以比较包含未改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1CAR-T-0，以及改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域-2和天然OX40的CAR-T-4对表达BCMA的靶细胞的杀伤效率为例。
利用1mL生理盐水重悬U266及NCI-H929靶细胞，加入10μL Calcein-AM(浓度1μg/μL，ThermoFisher,USA)，轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育10min，以标记靶细胞。向48孔细胞培养板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)每孔中加入1×105个上述标记的U266及NCI-H929细胞，按E:T＝1:1或3:1加入不同CAR-T细胞，同时加一组不转导CAR基因的T细胞(与CAR-T细胞总数相同)以供对照实验使用；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育5h，用荧光酶标仪(Varioscan Lux,ThermoFisher)检测细胞上清的荧光值(激发波长:495nm，发射波长:515nm)。
图12显示，CAR-T-0和CAR-T-4均能通过识别BCMA靶蛋白，有效杀伤U266、NCI-H929细胞，且与CAR-T-0相比，CAR-T-4具有更强的杀伤能力，说明在与靶细胞孵育的短时间内，scFv、CD3ζ信号域和OX40等构件的组合改造能增强CAR-T对靶细胞的杀伤能力，为体内有效杀伤肿瘤细胞提供了基础。
实施例14：BCMA CAR-T细胞在荷瘤小鼠中的抗瘤能力和扩增能力
本实施例以检测包含未改造的C11D5.3 scFv和改造的CD3ζ信号域-1的CAR-T-0，以及改造的C11D5.3 scFv、改造的CD3ζ信号域-2和OX40的CAR-T-4对荷瘤小鼠的抗瘤能力、体内扩增和持续能力为例。
将分离纯化的T细胞按1.5×106个细胞/mL接种培养至含IL-2(500IU/mL)的新鲜X-VIVO培养基中，按T细胞数与CD3/CD28 Dynabeads数量为1:1的比例加入Dynabeads培养细胞48小时后，将T细胞分别感染含相应CAR的慢病毒以制备相应CAR-T细胞，同时培养不转导CAR基因的T细胞以供对照实验使用。病毒感染24小时后，细胞离心换液，计数，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2(500IU/ml)的新鲜X-VIVO中，继续维持原有的Dynabeads刺激培养，细胞每48小时离心换液，按0.8×106个细胞/mL接种培养至含IL-2(500IU/ml)的新鲜X-VIVO中，培养至第8天时，收获细胞并计数，并进行流式检测分析CAR表达率。
合成荧光素酶luciferase基因和荧光蛋白GFP基因(北京博迈德基因技术有限公司)，将luciferase基因和GFP基因利用PCR和酶切连接法插入慢病毒载体pLenti6.3/V5中，构建出含有luciferase和GFP基因的质粒；利用该质粒与慢病毒包装质粒pLP/VSVG,pLP1/MDK转染HEK293T细胞，制备出载带luciferase和GFP基因的慢病毒，将该慢病毒感染NCI-H929细胞，利用流式细胞仪分选出GFP阳性的细胞，命名为NCI-H929-LAE，该细胞同时表达GFP和luciferase。
将6-8周龄NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司，中国)共18只，分为6只/组，共3组。每只小鼠从皮下接种5.0×106个NCI-H929-LAE细胞，7天后对小鼠进行荧光素酶活体成像(Lumina II小动物活体成像系统，PerkinElmer，USA)分析，以验证小鼠多发性骨髓瘤模型是否成功。小鼠多发性骨髓瘤模型制作成功后，第17天每组小鼠分别从尾静脉注射BCMA CAR-T细胞(5×106个细胞/只)，同时在另外一组小鼠注射相应细胞数的T细胞作为对照。小鼠于CAR-T细胞、T细胞注射后第0、8、12、16、21天进行小鼠活体成像分析，于CAR-T细胞注射后第2、5、7、9、12、16天进行外周血CAR-T检测。
图13显示，与注射T细胞组的荷瘤小鼠相比，CAR-T-0、CAR-T-4均能显著抑制肿瘤的生长。此外CAR-T-4组在肿瘤负荷增加后4-5天内肿瘤再一次被体内CAR-T压制，而CAR-T-0组出现肿瘤负荷增加后5天后未完全压制，说明CAR-T-4在体内的持续抗肿瘤性能力有显著提高。
图14显示，与CAR-T-0相比，CAR-T-4在体内CAR-T扩增达峰值明显升高，并且持续性也有显著提高。具体而言，与CAR-T-0相比，CAR-T-4组小鼠外周血在5天后能检测到明显较高水平的CAR-T细胞。12天后CAR-T含量下降，CAR-T-4组CAR-T水平维持在较CAR-T-0高的水平，说明与CAR-T-0相比，CAR-T-4在体内的抗肿瘤能力和CAR-T持续性能有显著提高。
从上述体外、体内实验结果可知，本发明对BCMA CAR-T进行scFv改造、CD3ζ信号域改造以及共刺激受体的添加后，CAR-T可以有效清除肿瘤且具有很好的持续性，scFv及CD3ζ信号域的设计能显著提高BCMA CAR分子在体外的扩增效率和持续时间，OX40的添加在良好扩增的基础上进一步增强了对肿瘤细胞的杀伤能力。
实施例15：改造的C11D5.3 scFv与BCMA蛋白的亲和力
基于S206突变为T的C11D5.3 scFv，委托北京义翘神州科技股份有限公司制备scFv与人Fc片段偶联的融合蛋白，将蛋白浓度调整至5μg/mL。利用Biocore T200(GEHealthcare Life Sciences,USA)检测scFv-Fc与人BCMA蛋白的亲和力：将芯片Series SSensor Chip CM5(GE Healthcare Life Sciences,USA)活化后，用鼠抗人IgG对的实验通道固定；将scFv-Fc蛋白以10μL/min的流速注入到实验通道；将人BCMA蛋白配制为0,0.391,0.781,1.5625,3.125,6.25,12.5,25,500nM浓度梯度，以30μL/min的流速注入到实验通道和对应参比通道，结合时间为120s，解离时间为400s；使用Biocore T200分析软件计算KD值。
图15所示，S206突变为T的C11D5.3 scFv-Fc与人BCMA蛋白的KD值为9.28×10^-10M，说明该scFv与BCMA蛋白之间存在较强的亲和力。
Claims (13)
1.一种分离的抗体，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
2.权利要求1所述的抗体，其特异性结合BCMA。
3.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的抗体。
4.一种克隆载体或表达载体，其包含权利要求3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的载体。
6.一种嵌合抗原受体，其包含权利要求1所述的抗体。
7.权利要求6所述的嵌合抗原受体，其进一步包含天然的CD3ζ信号域或改造的CD3ζ信号域；
所述天然的CD3ζ信号域包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成；
所述改造的CD3ζ信号域包含如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
8.权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中CD3ζ信号域C端增加通过连接子(优选为P2A自剪切肽)连接的OX40蛋白，包含如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
9.权利要求6-8中任意一项所述的嵌合抗原受体，其进一步包含来自4-1BB、CD28、CD27、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD-2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的共刺激信号域。
10.权利要求6-9中任意一项所述的嵌合抗原受体，其还包含来自CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、CD34的铰链区或跨膜区。
11.权利要求6-10中任意一项所述的嵌合抗原受体，其包含如SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列、或基本由该序列组成、或由该序列组成。
12.一种细胞，其包含权利要求6-11中任意一项所述的嵌合抗原受体，所述细胞不为生殖细胞或受精卵，优选为免疫细胞，更优选为T细胞。
13.权利要求1所述的分离的抗体、权利要求6-11中任意一项所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的细胞在制备用于预防或治疗B细胞相关疾病的药物中的用途；
优选地，所述B细胞相关疾病选自：多发性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、视神经脊髓炎谱系疾病、系统性红斑狼疮、多毛细胞白血病或脊髓发育不良。
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