CN116236482A - 莲心碱在治疗nlrp3炎症小体异常活化相关疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了莲心碱在治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病中的应用。本发明首次发现莲心碱可显著抑制NLRP3炎症小体的活化和细胞焦亡。小鼠经莲心碱灌胃后，可明显降低腹腔注射MSU诱导的腹膜炎、降低细菌感染的肝脏炎症反应，以及提高细菌感染小鼠的存活率，降低MSU诱导的腹膜炎和腹腔细菌感染引起的死亡。因此，莲心碱可用于治疗NLRP3异常活化相关疾病，包括获得性炎症性疾病、遗传性NLRP3突变引起的自身免疫病、神经系统性疾病和感染性炎症性疾病等。

Description

莲心碱在治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及莲心碱在制备治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病中的应用。
背景技术
莲心碱(Liensinine,Lie)是为睡莲科莲属植物莲Nelumbo nucifera Gaertn的莲子胚芽中提取出来的一种双苄基四氢异喹啉生物碱，具有抗肿瘤、降血压、抗心律失常、抗氧化，抗肺纤维化、抗血小板凝集、抗血栓及保护心脑血管活性等作用。莲心碱的分子量610.74，分子式C37H42N2O6；化学结构如下式所示：
Figure BDA0004100118550000011
近年来已经证实莲心碱对多种肿瘤细胞具有明显的抑制效应。可抑制某些恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤等肿瘤细胞生长。且同时减少因肿瘤引起的骨量流失，降低骨质疏松症的发生。
NLRP3炎症小体是由胞内NLRP3、接头蛋白抑制凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和caspase-1作为核心组成的多蛋白复合物，该复合物组装能够诱导促炎因子IL-1β和IL-18等的成熟和分泌，从而促进炎症反应发生。巨噬细胞中NLRP3炎症小体的正常活化，有利于宿主抵御病原微生物的感染，维持机体内环境稳定。
虽然NLRP3炎症小体是固有免疫的重要组成部分，但其过度活化和功能失调与多种获得性炎症性疾病和遗传性NLRP3突变引起的自身免疫病的病理过程密切相关。NLRP3自身的突变会导致一类自身炎症性疾病，包括家族性寒冷型自身炎症性综合征(FCAS)、穆-韦二氏综合征(MWS)和Cryopyrin相关周期性发热综合征(CAPS)等。遗传性CAPS与NLRP3的功能获得性突变有关，这类突变使NLRP3组成性活化，引起caspase-1持续活化，最终导致以IL-1β介导为主的全身炎症。另一方面，多种代谢疾病和免疫紊乱，如2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、痛风和阿尔茨海默病等，都与内源性损伤相关分子(DAMPs)诱发的NLRP3异常活化有关。因此，这也提示可以通过抑制NLRP3炎症小体的活化与细胞焦亡的发生，将有利于缓解上述炎症性疾病以及提供新的治疗途径。
目前临床治疗NLRP3相关炎症性疾病中，主要靶向于NLRP3炎症小体的活化产物IL-1β。但是单纯地抑制IL-1β的功能可能会带来免疫抑制效应等副作用，因此特异性靶向于NLRP3炎症小体活化的抑制剂将成为治疗NLRP3炎症小体相关疾病的更好选择，但目前尚缺乏相关的药物。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供莲心碱在治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。莲心碱可以有效抑制NLRP3炎症小体的活化，可用于制备治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
莲心碱在体外非治疗目的的抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
在一些实施例中，所述NLRP3炎症小体活化包括经典NLRP3炎症小体活化和非经典NLRP3炎症小体活化。
本发明还提供了莲心碱在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
在一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为获得性炎症性疾病、遗传性NLRP3突变引起的自身免疫病、神经系统性疾病或感染性炎症性疾病。
在一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为家族性寒冷型自身炎症性综合征、穆-韦二氏综合征、Cryopyrin相关周期性发热综合征、2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、痛风、阿尔茨海默病、帕金森氏症、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、肝炎、或腹腔细菌感染性疾病。
在一些实施例中，所述药物可以抑制NLRP3炎症小体的活化和/或细胞焦亡。
在一些实施例中，所述药物具有以下效果中的至少一种：抑制caspase-1活化、jiangdi IL-1β的分泌量、抑制凋亡相关斑点样蛋白斑块的形成和/或聚合、抑制NF-κB p65的入核、抑制钾离子的外流、抑制钙离子的内流、抑制线粒体膜电位下降、抑制ROS的产生。
本发明还提供了一种治疗NLRP3炎症小体异常活性相关疾病的药物，所述药物包含主要活性成分莲心碱和药物学上可接受的辅料。
在一些实施例中，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液、粉末剂或注射剂。
本发明还提供了一种体外非治疗目的的抑制NLRP3炎症小体活化的方法，包括以下步骤：在体外NLRP3炎症小体活化诱导体系中加入莲心碱；所述莲心碱在所述诱导体系中的终浓度为1～25μM。
在一些实施例中，所述的方法包括以下步骤：体外诱导或培养巨噬细胞，加入LPS刺激，然后加入莲心碱，最后加入NLRP3炎症小体诱导试剂；所述莲心碱在所述诱导培养体系中的终浓度为1～25μM。
在一些优选的实施例中，所述莲心碱在所述诱导体系中的终浓度为7～25μM。
更优选地，所述莲心碱在所述诱导体系中的终浓度为7～20μM。
本发明经过研究首次证实了莲心碱可明显抑制NLRP3炎症小体的活化，包括抑制抑制caspase-1活化、jiangdi IL-1β的分泌量、抑制凋亡相关斑点样蛋白斑块的形成和/或聚合、抑制NF-κB p65的入核、抑制钾离子的外流、抑制钙离子的内流、抑制线粒体膜电位下降、抑制ROS的产生；同时抑制Gasdermin D蛋白的切割及抑制细胞焦亡的发生。小鼠经莲心碱灌胃后，可明显降低腹腔注射MSU诱导的腹膜炎以及提高细菌感染小鼠的存活率，降低MSU诱导的腹膜炎和腹腔细菌感染引起的死亡，降低细菌感染小鼠的肝脏炎症性细胞的浸润。因此，莲心碱可通过抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡来治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病，包括家族性寒冷型自身炎症性综合征、穆-韦二氏综合征、Cryopyrin相关周期性发热综合征、2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、痛风、阿尔茨海默病、帕金森氏症、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、肝炎、或腹腔细菌感染性疾病。
附图说明
图1是莲心碱(Liensinine,Lie)对LPS+ATP诱导的THP-1细胞炎症小体激活的抑制作用；其中，A：莲心碱可以剂量依赖地抑制LPS+ATP诱导的caspase-1活化；B：ELISA检测莲心碱可以依赖地抑制LPS+ATP诱导的IL-1β的分泌；C：ELISA检测莲心碱对AIM2炎症小体及NLRC4炎症小体刺激剂诱导的IL-1β的分泌无影响，但对转染LPS激活非经典NLRP3活化有抑制作用。
图2是莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞免疫荧光显微技术分析ASC斑块形成的抑制作用；其中，A：ASC斑块的免疫荧光显微分析图；B：含有ASC斑块的细胞百分比例分析统计图。C：ASC cross linking实验，分析莲心碱对ASC聚合度的影响。
图3是莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞细胞焦亡的抑制作用的碘化丙啶(PI)染色荧光图及乳酸脱氢酶释放的检测；其中，A：PI染色荧光显微镜图；B：焦亡细胞占总细胞的百分比统计图；C：细胞培养上清中释放的乳酸脱氢酶检测。
图4是莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞细胞焦亡的抑制作用的形态变化图和Gasdermin D切割免疫印迹分析图；其中，A：细胞焦亡抑制的细胞形态；B：Gasdermin D切割产生N端片段(32kDa)的免疫印迹分析图；以及上清中HMGB1和细胞中HMGB1的变化情况(指示细胞的死亡情况)。
图5是莲心碱抑制LPS诱导的NF-кB通路的激活；其中，A：NF-кB p-65入核的免疫荧光显微分析图；B：莲心碱预处理，抑制细胞培养上清中乳酸脱氢酶释放的检测。
图6是莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞钾离子外流和钙离子内流的抑制作用；其中，A：THP-1细胞内钾离子的荧光显微分析图；B：钾离子平均荧光强度统计图；C：THP-1细胞内钙离子的荧光显微分析图；D：钙离子平均荧光强度统计图。
图7是莲心碱抑制LPS+ATP诱导的THP-1细胞线粒体膜电位的下降和活性氧ROS的产生。其中，A：THP-1细胞内线粒体膜电位的荧光图；B：THP-1细胞内活性氧ROS的荧光图；C：THP-1细胞内ROS的平均荧光强度统计图。
图8是莲心碱抑制MSU诱导的小鼠体内NLRP3炎症小体的活化；其中，A：ELISA检测MSU诱导的小鼠血清和腹腔洗出液中IL-1β的分泌；B：HE染色检测MSU诱导的腹腔细胞的变化；C：流式细胞术分析小鼠腹腔中单核细胞的比例统计；D：流式细胞术分析小鼠腹腔中中性粒细胞的比例统计。
图9是莲心碱降低细菌感染小鼠的肝脏炎症性细胞的浸润；其中，1#、2#和3#分别代表第1只小鼠、第2只小鼠和第3只小鼠。
图10是莲心碱降低腹腔细菌感染小鼠的死亡率的分析图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
PMA诱导的THP-1分化的巨噬细胞由LPS致敏后，再经ATP等NLRP3炎症小体诱导剂刺激下，可以激活NLRP3炎症小体，导致caspase-1活化，促进成熟IL-1β的分泌，ASC斑块的形成以及诱导Gasdermin D蛋白的切割，产生具有膜成孔活性的N端片段，诱导细胞焦亡。
在一些实施例中，所述体外非治疗目的的抑制NLRP3炎症小体活化的方法中，体外培养巨噬细胞，可以为巨噬细胞系J774A.1、腹腔巨噬细胞以及骨髓来源巨噬细胞的培养；也可以为先培养前体细胞，然后诱导分化为巨噬细胞，例如，体外培养THP-1细胞，并诱导其分化为巨噬细胞，均同等有效。
下面结合具体实施例进行说明。
以下实施例中所用到的材料，其来源如下：
莲心碱(Liensinine，Lie)(目录号：HY-N0484)购MedChemExpress生物公司。脂多糖(LPS)(目录号：L4391)、三磷酸腺苷(ATP)(目录号：A6419)、碘化丙锭(PI)(目录号：P4170)、Hoechst 33342(目录号：B2261)购自Sigma-Aldrich公司。Pam3CSK4(目录号：tlrl-pms)、FLA-PA(目录号：tlrl-pafla)、Poly(dA:dT)(目录号：tlrl-patn)和MSU(目录号：tlrl-msu)购买于Invivogen公司。细胞培养基RPMI1640、青霉素/链霉素、胎牛血清(FBS)购于ThermoFisher公司。PMA(目录号：S1819)、Caspase-1活性检测试剂盒(目录号：C1102)、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(目录号：C0017)、线粒体膜电位检测试剂盒(目录号：C2006)、活性氧检测试剂盒(目录号：S0033S)和钙离子荧光探针Fluo-4 AM(目录号：S1060)均为碧云天公司产品。Human IL-1beta ELISA Kit(目录号：EK0392)和Mouse IL-1betaELISA Kit(目录号：EK0394)购于博士德公司。钾离子探针(目录号：ab142806)、抗GSDMD抗体(目录号：ab210070)和抗HMGB1(目录号：ab18256)购于Abcam公司。抗ASC(目录号：67824)、GADPH(目录号：5174)和NF-κB p65(目录号：6956)抗体均为Cell SignalingTechnology公司产品。CD11b-FITC(目录号：E00148)、Ly6G-PE(目录号：4284861)和Ly6C-APC(目录号：4285390)均为eBioscience公司产品。
实施例1
莲心碱抑制NLRP3炎症小体活化的试验。
1、实验方法
包括以下步骤：
(1)THP-1细胞的培养和分化
人急性单核细胞白血病细胞THP-1为悬浮细胞，培养于含10％(v/v)胎牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素和50μMβ-巯基乙醇的RPMI1640培养基中，置于37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养。细胞培养2-3天后可以传代。诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞：接种细胞密度为5×105于6孔板中，加入含PMA(终浓度：500nM)的RPMI1640培养基，培养16小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基预处理4小时，再经含不同浓度的莲心碱(5μM、10μM、20μM)的培养基处理1小时，最后补加含4mmol/L ATP处理30分钟。
(2)Caspase-1活性检测
经莲心碱预处理，加入NLRP3激活剂后，检测caspase-1的活性，基于活化的caspase-1可以催化底物Ac-YVAD-pNA(acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，pNA(4-硝基苯胺)在405nm附近有强吸收；从而可以通过测定吸光度来检测caspase-1的活性。
(3)上清中IL-1β的检测
诱导巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化后，会向细胞培养上清液中释放IL-1β，是NLRP3活化的标志之一。莲心碱干预后，收集上清液，按照酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测步骤使用IL-1β试剂盒检测上清液中IL-1β的含量。
(4)AIM2/NLRC4/非经典NLRP3炎症小体活化
Pam3CSK4(1μg/ml)预处理4小时，随后加入莲心碱作用1小时后，加入不同的转染试剂作用16h。(非经典NLRP3炎症小体活化：LPS(2.5μg/ml)+0.5μl Fugene HD/孔；NLRC4炎症小体活化：FLA-PA(0.5μg/ml)+0.5μl Fugene HD/孔；AIM2炎症小体活化：Poly(dA:dT)(2μg/ml)+0.2μl Lipofectamine/well。)收集上清液，ELISA检测IL-1β的分泌。
2、实验结果
炎症小体激活程度以Caspase-1的活化水平和成熟IL-1β的分泌量反映。如图1所示，在细胞中Caspase-1的活化水平(图1A)和细胞培养上清液中IL-1β的释放(图1B)随莲心碱的剂量增加而降低。说明莲心碱可剂量依赖性地抑制LPS+ATP诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活化。另外，莲心碱同样能够明显抑制非经典NLRP3炎症小体的活化，但是对于AIM2或NLRC4炎症小体的活化无影响(图1C)。因此，莲心碱能特异性抑制经典和非经典NLRP3炎症小体的活化，是一种NLRP3炎症小体活化的特异性抑制剂。
实施例2
ASC斑块形成和聚合度的检测。ASC斑块(ASC speck)的形成是NLRP3炎症小体活化的另一重要指标。
1、实验方法
ASC斑块形成：将THP-1细胞接种在玻底培养皿中(密度为5×105/孔)，加入含PMA(终浓度：500nM)的RPMI1640培养基，培养16小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基预处理4小时，加入莲心碱20μM作用1小时，然后加入4mmol/L ATP刺激30分钟，最后吸弃其培养基，每孔加1mL 4％多聚甲醛，室温固定15分钟，然后每孔加2mL冷甲醇于-20℃条件下通透10分钟，再用封闭液室温封闭1小时，加一抗ASC(100μL/孔)，4℃孵育过夜，洗涤后加无交叉反应的CF568-山羊兔抗IgG(美国Biotium公司)，室温孵育1小时，Hoechst 33342染核1避光10分钟，蔡司倒置荧光显微镜观察并拍照。
ASC聚合度检测：将THP-1细胞接种在玻底培养皿中(密度为5×105/孔)，加入含PMA(终浓度：500nM)的RPMI1640培养基，培养16小时。然后换液，加入含500ng/mL LPS的完全培养基预处理4小时，加入莲心碱20μM作用1小时，然后加入4mmol/L ATP刺激30分钟，最后吸弃其培养基，加入500μl预冷的PBS含0.5％ TritonX-100。用21G的注射器抽打裂解液10次，离心8000rpm，15分钟，4℃。弃上清，加入预冷的1ml PBS洗涤两次，每次离心(8000rpm，15分钟，4℃)。最后加入终浓度为2mM的辛二酸二琥珀酰亚胺酯(sigma，S1885)，室温反应30分钟，最后免疫印记法检测ASC的聚合度。
2、实验结果
ASC斑块的免疫荧光显微分析图(图2A)显示，莲心碱处理能明显抑制ASC斑块的形成；图2B为含有ASC斑块的细胞百分比例分析统计图。ASC cross linking实验结果(图2C)显示，莲心碱能明显抑制ASC的聚合度。结果表明，莲心碱能显著地抑制LPS+ATP诱导的THP-1细胞中ASC斑块的形成以及抑制ASC的聚合，进一步说明莲心碱可以抑制NLRP3炎症小体的活化(图2)。
实施例3
莲心碱抑制ATP诱导的细胞焦亡试验。
1、实验方法
细胞培养和处理：细胞培养和处理的方法同“实施例1步骤(1)”，最后加入PI(2μg/mL)和Hoechst33342(5μg/mL)，室温下避光染色10分钟；置于倒置荧光显微镜下观察拍照并统计PI阳性率(表明细胞已焦亡)。收集细胞的培养上清，检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放，反映细胞的死亡率。
2、实验结果
激活NLRP3炎症小体，同时会诱导细胞焦亡的发生。细胞焦亡后，可被PI染色呈阳性以及细胞内的乳酸脱氢酶(细胞死亡标志物)会释放至上清中。图3中显示莲心碱可以剂量依赖性抑制LPS+ATP诱导的细胞焦亡，其中，图3A为PI染色荧光显微镜图；图3B为焦亡细胞占总细胞的百分比统计图；图3C为细胞培养上清中释放的乳酸脱氢酶检测结果。
实施例4
莲心碱抑制细胞焦亡试验。
1、实验方法
包括以下步骤：
(1)细胞培养和处理
细胞处理方法同“实施例3步骤(1)”。显微镜拍摄细胞焦亡的形态。
(2)细胞中Gasdermin D活化的检测
细胞经上述处理后，最后用免疫印迹法检测Gasdermin D切割以及上清中和细胞内HMGB1的情况。
2、实验结果
细胞焦亡后，细胞明显肿胀、变圆及细胞核收缩，且细胞内的Gasdermin D会被活化切割成N端产物(32kDa)。光学显微镜观察，LPS+ATP组中细胞发生肿胀变圆，呈现“气球”样肿胀，典型的细胞焦亡的形态；经莲心碱预处理，再加入ATP，细胞未出现明显改变(图4A)；同时能剂量依赖性地抑制LPS+ATP诱导的HMGB1的释放以及Gasdermin D的切割(图4B)，进一步说明莲心碱可以抑制细胞焦亡的发生(图4)。
实施例5
莲心碱能抑制炎症小体活化的第一信号(NF-кB的激活)。
1、实验方法
包括以下步骤：
(1)细胞培养和处理
诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞：接种细胞密度为5×105于6孔板中，加入含PMA(终浓度：500nM)的RPMI1640培养基，培养16小时。然后换液，先加入莲心碱(20μM)预处理1小时，再用500ng/mL LPS的完全培养基处理4小时后吸弃其培养基，每孔加1mL 4％多聚甲醛，室温固定15分钟，然后每孔加2mL冷甲醇于-20℃条件下通透10分钟，再用封闭液室温封闭1小时，加一抗NF-кB p65(100μL/孔)，4℃孵育过夜，洗涤后加无交叉反应的CF568-山羊兔抗IgG(美国Biotium公司)，室温孵育1小时，Hoechst 33342染核避光10分钟，蔡司倒置荧光显微镜观察并拍照。
(2)THP-1细胞先加入莲心碱(20μM)预处理1小时，再用500ng/mL LPS的完全培养基处理4小时后，补加含4mmol/L ATP处理30分钟。最后收集上清液检测LDH的释放量。
2、实验结果
LPS作为第一信号，激活NF-κB信号通路，诱导NLRP3和pro-IL-1β的表达。莲心碱预处理，随后加入LPS致敏，免疫荧光的结果发现莲心碱能够抑制NF-κB p65的入核(图5A)，继而也能抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡，降低LDH的释放量(图5B)。表明莲心碱不仅对NLRP3炎症小体活化的第二信号阶段有抑制作用，对第一信号阶段也起抑制作用(图5)。
实施例6
莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞钾离子外流和钙离子内流的抑制作用。
1、实验方法
细胞培养和处理：细胞培养和处理的方法同“实施例1步骤(1)”。最后加入细胞通过钾离子的指示剂ION Potassium Green-2 AM(50μM)或加入钙离子的荧光探针Fluo-4 AM(10μM)，37℃孵育30分钟；荧光显微镜观察细胞内钾离子和钙离子的变化。
2、实验结果
离子的流动(钾离子外流和钙离子内流)对NLRP3炎症小体的活化至关重要。通过离子指示剂显示，莲心碱可以明显抑制钾离子的外流和钙离子的内流：图6A为THP-1细胞内钾离子的荧光显微分析图；图6B为钾离子平均荧光强度统计图；图6C为THP-1细胞内钙离子的荧光显微分析图；图6D为钙离子平均荧光强度统计图。说明莲心碱可通过调控离子流动影响NLRP3炎症小体的活化(图6)。
实施例7
莲心碱对LPS+ATP诱导的THP-1细胞线粒体膜电位的下降以及ROS产生的抑制作用。
1、实验方法
细胞培养和处理：细胞培养和处理的方法同“实施例1步骤(1)”。最后加入JC-1工作液，37℃孵育25分钟；荧光显微镜观察线粒体膜电位的变化。加入DCFH-DA(10μM)，37℃孵育30分钟；荧光显微镜观察ROS含量的变化。
2、实验结果
NLRP3激活剂处理后，会诱导线粒体功能紊乱，膜电位下降，同时诱导ROS的产生。结果显示，莲心碱处理能够明显保护NLRP3激活剂诱导的线粒体膜电位的下降(图7A)，抑制ROS的产生(图7B-C)，最终抑制NLRP3炎症小体的活化(图7)。
实施例8
莲心碱抑制小鼠体内NLRP3炎症小体活化的试验。
1、实验方法
C57BL/6小鼠(购自广东省实验动物中心)，适应性养殖一周后，按5mg/kg体重的剂量将含莲心碱的PBS溶液预灌胃。作用1小时后，将MSU配制于无菌的PBS(浓度为2mg/ml)。通过腹腔注射(i.p.)0.5ml的MSU溶液(即每只小鼠注射1mg MSU)。注射后，将小鼠放回笼子，作用6小时。反应结束后，收集小鼠的血清和腹腔洗出液并用ELISA检测血清和腹腔中IL-1β的含量。腹腔洗出细胞经处理后，孵育CD11b-FITC、Ly6G-PE和Ly6C-APC通过流式细胞仪检测腹腔中性粒细胞和单核细胞的比例；并通过HE染色，显微镜拍摄观察腹腔细胞的变化。
2、实验结果
腹腔注射MSU是小鼠体内NLRP3炎症小体活化的经典模型，引发小鼠腹腔内NLRP3依赖的炎症性反应。其特点为：腹腔和血清中分泌大量IL-1β以及中性粒细胞和单核细胞的流入。结果分析发现莲心碱处理组能够显著抑制MSU诱导的小鼠血清和腹腔中IL-1β的分泌(图8A)。图8B为MSU诱导的腹腔细胞的HE染色结果。另外，通过HE染色和流式细胞术统计分析发现，莲心碱处理组能够显著抑制MSU诱导的小鼠腹腔中性粒细胞(图8D)和单核细胞(图8C)的募集。因此，说明莲心碱在小鼠体内同样能抑制NLRP3炎症小体的活化(图8)。
实施例9
莲心碱处理抑制小鼠细菌感染的肝脏炎症反应。本实施例小鼠腹腔接种大肠杆菌模型是公知的NLRP3活化模型。
1、实验方法
包括以下步骤：
(1)细菌培养
大肠杆菌DH5α在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37℃)，次日按10％菌液在新鲜培养基中继续摇菌扩增3小时(37℃)。扩增后的菌液在4500rpm离心力下离心10分钟，PBS洗涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000；ThermoScientific)测定；对应的菌落形成单位(CFU)由LB琼脂糖平板涂布培养确定。
(2)动物实验
C57BL/6小鼠(购自广东省实验动物中心)，适应性养殖一周后，按5mg/kg体重的剂量将含莲心碱的PBS溶液预灌胃，3小时后，腹腔接种大肠杆菌(2.0×109CFU/只)。反应24小时后，取小鼠的肝脏做HE染色，观察炎症细胞的浸润情况。
2、实验结果
大肠杆菌感染，NLRP3炎症小体活化(具体数据省略)，可导致小鼠肝脏炎症细胞的大量浸润；而莲心碱可有效降低细菌感染小鼠肝脏中炎症细胞的浸润，明显抑制炎症反应(图9)。
实施例10
莲心碱处理提高小鼠抗细菌感染能力的试验。本实施例小鼠腹腔接种大肠杆菌模型是公知的NLRP3活化模型。
1、实验方法
包括以下步骤：
(1)细菌培养
大肠杆菌DH5α在Luria Broth(LB)培养基中摇菌过夜(37℃)，次日按10％菌液在新鲜培养基中继续摇菌扩增3小时(37℃)。扩增后的菌液在4500rpm离心力下离心10分钟，PBS洗涤后，重悬于PBS溶液备用。细菌密度用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000；ThermoScientific)测定；对应的菌落形成单位(CFU)由LB琼脂糖平板涂布培养确定。
(2)动物实验
C57BL/6小鼠(购自广东省实验动物中心)，适应性养殖一周后，实验组按5mg/kg和10mg/kg体重的剂量将含莲心碱的PBS溶液预灌胃，对照组灌胃等量的溶剂PBS溶液。3小时后，腹腔接种大肠杆菌(2.0×109CFU/只)。接下来的120小时内，每6小时观察记录小鼠存活情况，并绘制小鼠Kaplan-Meier生存曲线分析存活率。小鼠存活率的差异分析采用Long-rank检验，P<0.05视为差异有统计意义。
2、实验结果
大肠杆菌感染，NLRP3炎症小体活化(具体数据省略)，可导致小鼠因感染而死亡；而莲心碱可有效降低腹腔细菌感染小鼠的死亡率(图10)。
综上所述，莲心碱可有效抑制经典和非经典NLRP3炎症小体的活化，明显降低腹腔注射MSU诱导的腹膜炎以及提高细菌感染小鼠的存活率，降低MSU诱导的腹膜炎和腹腔细菌感染引起的死亡，降低细菌感染小鼠的肝脏炎症性细胞的浸润。因此，莲心碱可通过抑制NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡来治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.莲心碱在体外非治疗目的的抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体活化包括经典NLRP3炎症小体活化和非经典NLRP3炎症小体活化。
3.莲心碱在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为获得性炎症性疾病、遗传性NLRP3突变引起的自身免疫病、神经系统性疾病或感染性炎症性疾病。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为家族性寒冷型自身炎症性综合征、穆-韦二氏综合征、Cryopyrin相关周期性发热综合征、2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、痛风、阿尔茨海默病、帕金森氏症、脓毒血症、内毒素血症、腹膜炎、肝炎、或腹腔细菌感染性疾病。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物可以抑制NLRP3炎症小体的活化和/或细胞焦亡。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下效果中的至少一种：抑制caspase-1活化、降低IL-1β的分泌量、抑制凋亡相关斑点样蛋白斑块的形成和/或聚合、抑制NF-κB p65的入核、抑制钾离子的外流、抑制钙离子的内流、抑制线粒体膜电位下降、抑制ROS的产生。
8.一种治疗NLRP3炎症小体异常活性相关疾病的药物，其特征在于，所述药物包含主要活性成分莲心碱和药物学上可接受的辅料。
9.一种体外非治疗目的的抑制NLRP3炎症小体活化的方法，其特征在于，包括以下步骤：在体外NLRP3炎症小体活化诱导体系中加入莲心碱；所述莲心碱在所述诱导体系中的终浓度为1～25μM。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：体外诱导或培养巨噬细胞，加入LPS刺激，然后加入莲心碱，最后加入NLRP3炎症小体诱导试剂；所述莲心碱在所述诱导培养体系中的终浓度为1～25μM。
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