CN116234589A - 神经移植物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了再生潜力降低的组织移植物、制备此类移植物的方法以及相关之试剂盒与处理方法。该方法可以包括用包含胰蛋白酶、α‑胰凝乳蛋白酶(ACT)及可选的乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液处理组织以从组织中基本上去除一种或多种易感蛋白质。该方法还可包括用缓冲溶液及/或用含丝氨酸的血清清洗经处理的组织。根据所公开的方法制备的神经移植物可以抑制或减轻(例如，提供用以减少)神经瘤形成及/或植入后的轴突长出。
Description
技术领域
本专利申请要求2021年8月25日提交的美国非临时专利申请第17/411,718号的优先权，该申请要求2020年8月28日提交的美国临时专利申请第63/071,635号的优先权，这些申请的全部内容在通过引用并入本文。
背景技术
周围神经损伤是慢性残疾的主要来源。当切断的轴突无法与远端神经重新建立连续性时，对神经损伤的管理不善会导致疼痛的神经瘤。尽管神经在受伤后有再生的潜力，但这取决于再生神经纤维与切断的神经节段(以及其中的许旺氏细胞基底层)的适当接触。在严重的组织损伤的情况下，正在再生的轴突可能无法到达远端神经残端，而会形成一团缠结的轴突及结缔组织，最终导致疼痛的球状神经瘤。在神经严重受损的情况下，例如受损或切断的神经的不连续性太大而无法桥接，疼痛性神经瘤的形成仍然是一个挑战。
目前用于神经瘤治疗之允许对齐的轴突生长的技术，如将神经移植物或导管缝合到神经残端(nerve stump)的末端，并不能充分保护神经末端免受包括生长因子和其他促进轴突生长的物质之外部环境的影响。随着时间的推移，轴突因此可以生长穿过移植物或导管，并在它们离开开放的远端时形成神经瘤，于该处不再有促进对齐生长的结构。当前的市售产品，例如神经帽(nerve cap)，已被用于经由阻遏轴突来提供用于阻碍神经元延伸和神经生长的物理屏障。然而，由于神经帽中缺乏内部结构而可造成轴突于随机方向延伸，这些装置仍可导致一个或多个疼痛性神经瘤之产生。
发明内容
根据本公开，制备组织移植物的方法可以用包括(a)胰蛋白酶及α-胰凝乳蛋白酶(alpha-chymotrypsin，ACT)，或(b)胰蛋白酶、ACT及乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的分解溶液(消化溶液)处理组织，以从组织中基本上去除一种或多种易感蛋白质(susceptible proteins)。
该分解溶液可包含约3.5x103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL的胰蛋白酶。该分解溶液可包含约50USP单位/mL至约55USP单位/mL的ACT。该分解溶液可包含约1.2mM至约1.5mM的EDTA。该分解溶液可包含约3.5x103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL的胰蛋白酶、约50USP单位/mL至约55USP单位/mL的ACT、以及约1.2mM至约1.5mM的EDTA。该分解溶液还可包含至少一种蛋白分解酶。该一种或多种易感蛋白质包括层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素(perlecan)、巢蛋白(nidogen)-1、巢蛋白-2或其组合。经处理的该组织可基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2或层连结蛋白γ-1中的一种或多种。经处理的该组织可基本上不包含胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链或胶原蛋白αIV-3链中的一种或多种。经处理的该组织可基本上不包含纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种。经处理的该组织可包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣(lumican)、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白(dermatopontin)、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣(decorin)、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白(vitronectin)、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣(asporin)、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣(biglycan)、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素(periostin)、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。可在约4℃至约40℃的温度下用该分解溶液处理该组织。可用该分解溶液处理该组织约4小时至约24小时的时间段范围。该方法可进一步包括用pH范围为约6.8至约7.5的缓冲溶液清洗经处理的该组织。该缓冲溶液可包括磷酸盐缓冲液、盐性阴极液(salinecatholytes)、Tris缓冲液(Tris-buffered saline)、二甲胂酸盐缓冲液(cacodylatebuffer)、索任生磷酸盐缓冲液(
phosphate buffer)、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(phosphate-citrate buffer)或巴比妥缓冲液(barbital buffer)。可用该缓冲溶液清洗经处理的该组织两次或更多次。可用该缓冲溶液在约4℃至约40℃的温度范围清洗经处理的该组织。可用该缓冲溶液在约1分钟至约4小时的时间段范围清洗经处理的该组织。该方法可进一步包括用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗经处理的该组织。该血清可为胎牛血清、兔血清、山羊血清、马血清、绵羊血清、猪血清或鸡血清。可用该血清清洗经处理的该组织两次或更多次。可用该血清在约4℃至约40℃的温度范围清洗经处理的该组织。可用该血清在约30分钟至约8小时的时间段范围清洗经处理的该组织。该方法可进一步包括使经处理的该组织与钙通道阻断剂、细胞外钙(extracellular calcium)、醣胺聚醣及/或醣蛋白接触，任选地，其中该缓冲溶液、该血清或该缓冲溶液及该血清两者可选地包含钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白。该钙通道阻断剂可包含钴Co2+、锰Mn2+、镧La3+或尼群地平(nitrendipine)中的一种或多种。该醣胺聚醣可包含角蛋白硫酸盐(keratin sulfate)或软骨素硫酸盐(chondroitin sulfate)中的一种或多种。该醣蛋白可包含一种或多种髓磷脂相关之醣蛋白。在根据本文公开的方法制备的组织移植物为神经移植物的情况下，此种移植物在植入患者体内后可导致神经瘤形成减少及/或轴突生长减少。该组织移植物，特别是神经移植物，可具有约3mm至约100mm，例如约5mm至约100mm、或约15mm至约40mm的长度。组织移植物，特别是神经移植物的直径可为约1mm至约10mm，例如约1mm至约7mm，或约1mm至约2mm。组织移植物，特别是神经移植物可以限定总体积的范围为约5mm3至约55000mm3。该方法可进一步包括可藉由冷冻干燥处理该组织移植物。该方法可进一步包括处理该组织移植物以形成糊状物或凝胶。该组织可为哺乳动物组织，例如人类组织、非人灵长类动物组织、囓齿动物组织、马组织、犬组织、兔组织、猪组织或羊组织。该组织可为非哺乳动物组织，例如鱼类组织、两栖动物组织、昆虫组织或植物组织。该组织可为神经组织，例如周围神经组织或中枢神经系统组织。该组织可为上皮组织、结缔组织、肌肉组织。该组织可为毛细管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织、或脂肪组织。该组织可为合成组织，包括但不限于实验室培育的组织。
此外，根据本公开，可以根据上述方法制备组织移植物。根据上述方法制备的组织移植物可基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种。此种移植物可为神经移植物。
进而，根据本公开，根据本文公开的方法制备的组织移植物可基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种，且可包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。此种移植物可为神经移植物。
该组织移植物可基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1中的一种或多种。该组织移植物可基本上不包含胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链中的一种或多种。该神经移植物可基本上不包含纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种。该神经移植物可包含至少0.1nmol/g的胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。该组织移植物可包含钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白中的一种或多种。该钙通道阻断剂可包含钴Co2+、锰Mn2+、镧La3+或尼群地平中的一种或多种。该醣胺聚醣可包含角蛋白硫酸盐或软骨素硫酸盐中的一种或多种。该醣蛋白可包含一种或多种髓磷脂相关之醣蛋白。该组织移植物，特别是神经移植物可具有约3mm至约100mm的长度。组织移植物，特别是神经移植物的直径可为约1mm至约10mm，例如约1mm至约7mm，或约1mm至约2mm。组织移植物，特别是神经移植物可以限定总体积的范围为约5mm3至约55000mm3。
更进一步地，根据本公开，治疗患者的方法可以包括将如上所述的组织移植物引入患者体内。
该神经移植物可以抑制神经瘤的形成。神经移植物可以经由神经移植物保持轴突对齐。神经移植物可以抑制神经元延伸至神经移植物中。患者可以是人类或非人类动物。
此外，根据本公开，用于制备神经移植物的试剂盒可包括组织、胰蛋白酶以及α-胰凝乳蛋白酶(ACT)。
该试剂盒可进一步包含乙二胺四乙酸(EDTA)。该试剂盒可包括包含该胰蛋白酶与该EDTA的第一容器以及包含该ACT的第二容器。该试剂盒可进一步包括缓冲溶液。该缓冲溶液可包括磷酸盐缓冲液、盐性阴极液、Tris缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、索任生磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液。该试剂盒可进一步包括包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清。该血清可为胎牛血清、兔血清、山羊血清、马血清、绵羊血清、猪血清或鸡血清。该试剂盒可进一步包括制备包含该胰蛋白酶及该ACT的分解溶液或包含该胰蛋白酶、该ACT及该乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液的说明。该试剂盒可进一步包括用该分解溶液处理该组织的说明。该组织可为哺乳动物组织，例如人类组织、非人灵长类动物组织、囓齿动物组织、马组织、犬组织、兔组织、猪组织或羊组织；或非哺乳动物组织，例如鱼类组织、两栖动物组织或昆虫组织；或合成组织，例如但不限于实验室培育的组织。该组织可为植物组织。该组织可为神经组织，例如周围神经组织或中枢神经系统组织，或可为上皮组织、结缔组织、肌肉组织。该组织可为毛细管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织、或脂肪组织。
此外，根据本公开，制备神经移植物的方法可包括：用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶(ACT)及乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液处理组织；用缓冲溶液清洗经处理的该组织一次或多次；以及用该缓冲溶液清洗后，用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗经处理的该组织一次或多次；其中经处理的该组织基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种，且其中经处理的该组织包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。
本技术领域中具有通常知识者将理解，本文公开的经再生潜力衰减处理之神经移植物可用于人类和其他脊椎动物的外科手术，以及实验室之研究、比较与测定。
本技术领域中具有通常知识者将理解，在本公开的实践中可以采用不同于具体举例说明的那些起始材料、生物材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法和生物方法，而无需求助于过度的实验。任何此类材料和方法的所有本领域已知的功能等效物旨在包括于本公开中。
除非上下文另有说明，否则单数形式「一」及「该」可包括复数形式。术语「大约」及「约」是指与参考数字或值几乎相同。如本文所使用，术语「大约」及「约」通常应理解为涵盖指定量或值的±5％。
已采用的术语和表达方式被用作描述而非限制，并且在使用此类术语和表达方式时并非旨在排除所表示及描述的特征或其部分的任何等效物，但应理解为在要求保护的公开内容之范围内可以进行各种修改。
附图说明
下列图式构成说明书的一部分，并被包括于内以进一步说明本发明的某些实施方式或各面向。在某些情况下，可以藉由参考图式并结合本文所示之详细描述来最佳地理解本发明的实施方式。描述和图式可以突出本发明的某个特定示例或某个面向。然而，本技术领域中具有通常知识者将理解，示例或面向的部分可与本发明的其他示例或面向结合使用。
图1是如示例2中描述的神经移植物样品之神经元生长测量的长条图。
图2A至2D是如示例3中描述的针对层连结蛋白染色之神经移植物样品的显微照片。
图3A至3B是如示例3中描述的神经移植物样品的定量测量(每100000μm的管周长；每100000μm的管数)的长条图。
图4A至4B是如示例3中描述的神经移植物样品的定量测量(神经内膜管(endoneurial tubes)的面积百分比；以μm2为单位的总束面积(total fascicle area))的长条图。
图5A至5B是描绘如示例4中描述之存在于经处理及未经处理的神经组织样品中之基底膜结构蛋白的定量的长条图。
具体实施方式
本公开是关于具有降低的再生潜力，例如与再生潜力相关的某些生化化合物的含量较低之神经移植物的制备。例如，本公开包括处理组织以将其基底膜蛋白质之至少一部分进行减少、去除、变性或去活化的方法。相对于含有此种功能性基底膜蛋白质的移植物，使用这些材料作为神经移植物，例如经由减少神经元生长及/或形成更小、更少、更不疼痛的神经瘤或不存在神经瘤，可以显著降低植入后的神经再生活性。
在至少一面向，本文的方法包括用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶(ACT)及可选的乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液处理组织。用此种溶液处理组织可以选择性地将组织内的至少一部分基底膜蛋白质去除、分解(消化)及/或去活化，而不会显著影响组织内的其他蛋白质。经处理的组织可以用缓冲溶液及/或含丝氨酸的血清进行一个或多个清洗步骤，并且可选地可以用一种或多种添加物如钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白进一步处理，进而降低神经移植物的再生潜力。
在神经组织中，基底膜为一片状层，其围绕包括周围神经轴突及许旺氏细胞之神经细胞并将其与下面的结缔组织及细胞外基质(ECM)隔开。基底膜包含蛋白质，该蛋白质包括但不限于层连结蛋白(例如层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1)、胶原蛋白(例如胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链)、纤网蛋白(例如纤网蛋白1(III型4、7结构域))、珍珠素及巢蛋白(例如巢蛋白-1、巢蛋白-2)。其他类型的组织也包括含有这些蛋白质的基底膜。这些蛋白质被认为有助于组织的再生能力。
如下文进一步讨论的，本文的方法可以基本上去除或以其他方式降低基底膜蛋白质的浓度，同时保持组织的其余部分完整。例如，对于神经组织，此种浓度降低的基底膜蛋白质与神经元延伸及神经再生有关，而保持完整的部分包括不参与再生及存在于ECM中的蛋白质。如本文所用，术语「易感蛋白质」是指会被胰蛋白酶、ACT或两者切割、变性或以其他方式去活化的基底膜蛋白质。例如，本文的方法可以去除一种或多种以下基底膜蛋白质的至少一部分：层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1及/或巢蛋白-2。此类易感蛋白质可从组织中部分或全部去除，而细胞外基质蛋白质及组织的结构基本保持完整。如本文所用，「基本上不包含」蛋白质是指组织(经处理的组织)或神经移植物基于各组织(经处理的组织)或移植物之质量，包含小于约0.1nmol/g的蛋白质。
根据本公开的面向，用于制备移植物的组织可经处理以去除细胞性及非细胞性材料，包括诱导免疫反应或以其他方式与免疫反应相关的成分。例如，人类组织或其他动物例如哺乳动物或非哺乳动物之组织可经处理以去除细胞性及非细胞性成分，如细胞、脂肪、血液及/或轴突碎屑，同时保留组织的三维结构(例如神经组织的管状结构)。在一些示例中，移植物是由非细胞性组织，例如非细胞性神经组织制备。
本文的方法包括用至少包含胰蛋白酶及ACT的分解溶液，例如包含胰蛋白酶、ACT及EDTA的分解溶液，处理具有基底膜的任何组织如神经组织(例如，细胞性、脱细胞及/或非细胞性组织)。分解溶液可以藉由将胰蛋白酶、ACT、EDTA以任意顺序混合来制备，例如将胰蛋白酶与EDTA混合后加入ACT，或将胰蛋白酶与ACT混合后加入EDTA。可选地，分解溶液包含至少一种额外的蛋白分解酶。
根据本公开的一些示例，胰蛋白酶的浓度范围可为约3.5x103USP单位/mL至约7.0x103USP单位/mL，例如约3.5x103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL、约4.0x103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL、或约4.5x103USP单位/mL至约6.0x103USP单位/mL。此外，例如，ACT的浓度范围可为约45USP单位/mL至约60USP单位/mL，例如约50单位/mL至约50单位/mL。EDTA的浓度范围内可为例如约1.0mM至约2.5mM，例如约1.2mM至约1.5mM，或约1.5mM至约2.0mM。在至少一个示例中，分解溶液包含约3.5x103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL的胰蛋白酶、约50USP单位/mL至约55USP单位/mL的ACT及约1.2mM至约1.5mM的EDTA。
以胰蛋白酶含量％表示的分解溶液可包含0.01％之胰蛋白酶(例如，0.01％之胰蛋白酶/ACT/EDTA溶液)至约0.3％或更多胰蛋白酶(例如，0.3％或更多胰蛋白酶/ACT/EDTA)溶液)，例如约0.05％至约0.25％、约0.1％至约0.20％、约0.15％至约0.18％、约0.2％至约0.25％、约0.10％至约0.20％、约0.5％至约0.12％之胰蛋白酶。
组织在分解溶液中温育的持续时间可为至少2小时，例如约2小时至约4小时、约4小时至约24小时、约6小时至约12小时或约10小至约16小时。合适的温度范围可为约4℃至约40℃，例如约4℃至约37℃、约4℃至约25℃、约20℃至约35℃，其中较低的温度适合较长的温育时间。在至少一个示例中，以分解溶液在约37℃至约40℃的温度下处理组织约2小时至约4小时的时间段。在另外的例子中，能够以用分解溶液在约35℃至约40℃之间的温度下处理组织约4小时至约6小时之间的时间段，或在约4℃至约15℃之间的温度下处理组织约18小时至约24小时之间的时间段。虽然此处列出了持续时间和温度的示例性范围，但一般而言，随着温育温度降低，温育的持续时间可以增加。分解的持续时间和相应的时间将被本技术领域中具有通常知识者理解并且属于本技术领域中具有通常知识者的技术范围内。组织在分解溶液中的温育可于搅拌下进行。
在以分解溶液处理后，经处理的组织可以用缓冲溶液清洗一次或多次。例如，缓冲溶液的pH范围可为约6.8至约7.6，如约7.2至约7.6、约7.3至约7.5，例如约7.4的pH。适用于清洗经处理的组织(在分解溶液中处理后)的示例性缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、盐性阴极液、Tris缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、索任生磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液及巴比妥缓冲液。缓冲溶液可以中和pH值并去除酶及/或分解溶液的其他成分。以缓冲溶液清洗经处理的组织可以避免组织在长期暴露于分解溶液中的酶时降解。例如，缓冲溶液可以中和组织中残留的胰蛋白酶、ACT及EDTA。经处理的组织能够以该缓冲溶液(或不同的缓冲溶液)清洗一次或多次，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。适用于给定之组织的清洗次数可取决于组织(或从经处理的组织制备之神经移植物)的大小、其密度、伴随清洗之搅拌的使用与程度及/或其他因素，以基本上中和组织的pH值。
经处理的组织可以另外用含丝氨酸的血清如动物来源之血清，例如胎牛血清(FBS)、兔血清、山羊血清、马血清、绵羊血清、猪血清、或鸡血清清洗一次或多次。含丝氨酸的溶液可包含一种或多种丝氨酸成分，例如α-抗胰蛋白酶及/或α2巨球蛋白(A2M)，其量足以在用分解溶液处理后使组织中残留的胰蛋白酶、ACT和EDTA去活化。例如，在清洗经处理的组织的步骤中使用FBS作为动物来源之血清的情况下，FBS的渗透压可为280mOsm/kg至340mOsm/kg，或300mOsm/kg至320mOsm/kg。经处理的组织能够以含丝氨酸的血清清洗一次或多次，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。每次清洗的温育持续时间及适合给定组织的清洗次数可取决于组织的大小、其密度、伴随清洗之搅拌的使用与程度及/或其他因素，以基本上将至少残留的胰蛋白酶、ACT与EDTA从组织中去活化及去除。例如，具有更大尺寸及/或更大密度的组织可能需要相对更多的清洗次数及/或更长的清洗持续时间。
在用缓冲溶液清洗组织之后，可以在含有丝氨酸的血清例如FBS中清洗组织一次或多次。在至少一个示例中，将经处理的组织如上所述用缓冲溶液清洗一次或多次，然后置于FBS或其他含丝氨酸的血清中并温育约30分钟至约24小时之间的时间段，例如，约30分钟及约8小时之间、约45分钟及约1小时之间、约1小时及约24小时之间、约4小时及约12小时之间、约8小时及约16小时之间或约12小时及24小时之间。适合在含丝氨酸的血清中温育的温度范围可为约4℃至约37℃，例如约10℃至约35℃、约15℃至约30℃或约22℃至约28℃，取决于温育长度。例如，组织可以在约4℃至约37℃的温度范围内处理约45分钟至约24小时的时间段范围，其中较低的温度(例如，约4℃至约22℃)适合较长持续时间的温育(例如，12小时至约24小时)，而较高的温度(例如，约23℃至约37℃)适合较短的温育时间段(例如，45分钟至约11小时)。在至少一个非限制性示例中，经处理的组织在约37℃的温度下以含丝氨酸的血清清洗45至60分钟。
除了用缓冲溶液及含丝氨酸的血清分开清洗之外，或者作为替代，可以在用缓冲溶液清洗的同时用含丝氨酸的血清清洗经处理的组织。例如，可以用包含丝氨酸成分例如α-抗胰蛋白酶及/或A2M的缓冲溶液清洗经处理的组织。此种组合溶液可包含例如PBS和FBS。PBS(或其他缓冲溶液)与FBS(或其他含丝氨酸血清)的相对量如上所述，可以基于一个或多个因素，例如组织的大小、其密度、伴随清洗之搅拌的使用及程度而决定。例如，PBS(或其他缓冲溶液)的体积可以随着组织的大小及/或密度的增加而成比例地增加。在一些示例中，可以在用缓冲溶液及/或含丝氨酸的血清进行单次清洗或多次清洗之前及/或之后，用组合的缓冲液/含丝氨酸的溶液清洗组织。
可选地，组织移植物，特别是神经移植物，可藉由进一步使经处理及清洗的组织暴露于一种或多种添加物来制备，以例如进一步帮助降低再生潜力。示例性添加物包括但不限于钙通道阻断剂，也称为钙渗透阻断剂(例如Co2+、锰Mn2+、镧La3+或尼群地平)、细胞外钙、醣胺聚醣(包括但不限于角蛋白硫酸盐及/或软骨素硫酸盐)和醣蛋白(包括但不限于髓磷脂相关之醣蛋白)。添加物的量的范围可为约0.1mM至约1000M，如约1mM至约500M、约0.1M至约250M、约0.5M至约100M、约5M至约50M、约0.1mM至约50mM、约10mM至约100mM、或约0.5M至约10M、约25M至约250M。
可以将添加物添加至溶液如pH中性溶液，例如pH为约6.8至约7.6。可以在处理及/或清洗经处理的组织期间，将添加物添加至上述任何分解溶液、缓冲溶液及/或含丝氨酸的血清中，及/或可藉由在其最终清洗期间或之后进一步将经处理及清洗的组织暴露于添加物来制备移植物。附加地或替代地，根据本文方法进行处理后，可以在储存于pH中性溶液(例如，pH自约6.8至约7.6)之前及/或自储存于pH中性溶液(例如，pH自约6.8至约7.6)中取出之后，将添加物添加至移植物，该pH中性溶液可选地为缓冲溶液。因此，举例来说，组织移植物，例如神经移植物，在其用于医疗程序时可包含添加物。
一旦用分解溶液处理并如上所述清洗，并且可选地包括一种或多种添加物，就可以储存经处理的组织。所得移植物可为湿形式、冷冻形式或冷冻干燥形式。根据本公开的一些面向，以冷冻干燥进一步处理神经移植物。在冷冻干燥期间，可以控制压力、水含量及/或温度以保持所欲之神经移植物的内部微观结构。根据一些面向，神经移植物被进一步处理以形成凝胶或糊状物。例如，聚合因子可用于从已根据本文的方法以分解溶液处理过的组织来制备凝胶或糊状物。凝胶或糊状物可具有与待治疗之神经的弹性模量相似的弹性模量，以防止可导致神经瘤进一步形成的神经之机械性压迫或将其最小化。
根据本文的方法处理后，可将移植物(可选地藉由冷冻干燥处理、或经处理以形成凝胶或糊状物)置于储存容器中，然后保持在约-80℃至室温(约20至22℃)的温度范围内。储存容器可以在急骤冷冻并保持在-80℃或更低的温度下数周、数月或数年。储存容器也可以基本上是气密的并且用惰性气体回填。在一些示例中，如本文所公开地处理组织(例如，利用分解溶液，并用可包括缓冲溶液的含丝氨酸之血清进行一次或多次清洗，并且可选地以包含缓冲溶液的额外清洗)，然后转移至缓冲溶液，例如缓冲盐水溶液，其pH范围约7.2至约7.6，例如pH约7.3至约7.5、例如pH约7.4，用以在使用于医疗程序前进行储存。适用于储存根据本文方法制备的移植物的示例性缓冲溶液包括但不限于PBS、盐性阴极液、Tris缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、索任生磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液及巴比妥缓冲液。用于储存移植物的缓冲溶液可包含一种或多种添加物，如上所述(例如，一种或多种钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣、醣蛋白或其组合)。
令人惊讶地发现，用本文公开的分解溶液温育组织是可选择性的，并且降低了组织内基底膜蛋白质的量，同时对存在于ECM中的蛋白质的量基本上没有可测量的影响。例如，作为以分解溶液进行温育的结果，组织内的基底膜蛋白质的60％至100％、或80％至100％的量可被去除，例如被去活化和/或被变性。由于基底膜蛋白质的减少，经处理的组织的基底膜蛋白质可能会「失活(deactivated)」，意味着经处理的组织在体外或被植入受试者体内时，可防止其支持神经再生及/或降低其支持神经再生的能力。使用胰蛋白酶、ACT和EDTA的分解过程可以基本上去除例如以下易感基底膜蛋白质中的一种或多种：层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2。在至少一个示例中，经处理的组织及/或由经处理的组织制备的移植物基本上不含对于由胰蛋白酶及/或ACT造成之裂解敏感的蛋白质中的一种或多种。相同的分解过程可能对例如以下蛋白质，也可认为是非易感蛋白质中的一种或多种基本上没有可测量的影响：胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、无孢蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(V)链、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链。例如，在用分解溶液处理后，经处理的组织及/或由经处理的组织制备的移植物可包含0.1nmol/g或更多的非易感蛋白质，例如0.15nmol/g或更多，或是0.2nmol/g或更多的非易感蛋白质。
分解程度及分解过程后残留于组织中之易感蛋白质的量可取决于分解过程中所采用的参数，例如胰蛋白酶、ACT及/或EDTA的浓度、为了在分解溶液中进行温育所提供的时间量、作为额外的再生潜力衰减剂加入的添加物，及/或移植物的特性例如组织密度及/或存在于组织中之基底蛋白质的量、搅拌的程度和使用、进行分解处理的温度。例如，随着分解酶浓度的增加，可以从体积相对大的组织中去除更多易感蛋白质，包括基底膜蛋白质。增加分解时间将反过来增加分解率。在一些面向，提高分解发生的温度可以提高易感蛋白质的分解率。在某些情况下，分解处理会减少一种或多种易感蛋白质的量，以至于无法藉由定量测量技术如有无使用高效能液相层析法(high performance liquid chromatograph，HPLC)之串联质谱法(MS/MS)、液相层析-选择反应监测(liquid chromatography-selectedreaction monitoring，LC-SRM)、酵素结合免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)及多重蛋白质检测技术如快速蛋白质液相层析(fastprotein liquid chromatography，FPLC)检测到。在一些情况下，在经处理的组织及/或从经处理的组织制备之移植物中检测不到易感蛋白质。
与用分解溶液处理之前的组织相比及/或与参考用之未经处理的组织相比，本文所述的关于神经移植物的组织处理方法可以提供具有至少2倍的神经再生活性损失之神经移植物。再生潜力降低的程度可以是例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少20倍或至少50倍。与对照组相比，再生潜力降低的程度可以藉由合适的分析技术来确定，例如有无使用HPLC、ELISA、FPLC之MS/MS、或藉由生物测定例如但不限于评估从一簇神经元或神经细胞株到神经移植物或神经移植物的衍生物之神经元延伸活动。
适合根据本文方法处理的组织可以是天然的或合成的。例如，组织可以是从动物如哺乳动物，包括人或非人哺乳动物，或非哺乳动物，包括鱼、两栖动物或昆虫获得的软生物组织。组织可以是植物组织。移植物对于被植入移植物的患者可以是同种异体的或异种的。组织可以是神经组织，包括例如周围神经组织或中枢神经系统组织。适用于本公开的其他类型的组织包括但不限于上皮组织、结缔组织、肌肉组织、毛细管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织和脂肪组织。如上所述，软生物组织可以是哺乳动物组织，包括人类组织和其他灵长类动物组织、囓齿动物组织、马组织、犬组织、兔组织、猪组织或羊组织。此外，组织可以是选自鱼类、两栖动物或昆虫组织之非哺乳动物组织。组织可以是合成组织，例如但不限于实验室培育的组织。根据一些示例，组织是从动物如人或非人哺乳动物获得的神经组织。
本文还考虑了植入患者之前及/或之后的免疫抑制技术。例如，可以结合移植物的植入对患者施用一种或多种免疫抑制剂。例如，移植物可包含经由移植物传递至患者的一种或多种免疫抑制剂。
经处理的组织及/或由经处理的组织制备的移植物可具有适于治疗患者神经损伤的尺寸。例如，经处理的组织及/或移植物的长度可介于约3mm与约100mm之间，例如介于约5mm约100mm之间、介于约20mm与约50mm之间、介于约45mm与约75mm之间，或长度介于约15mm与约40mm之间。此外，例如，移植物可限定总体积的范围为约5mm3至约55000mm3，例如约100mm3至约25000mm3、约500mm3至约10000mm3、约1000mm3至约5000mm3、约500mm3至约2000mm3、约100mm3至约5000mm3或约7500mm3至约15000mm3。
本文中的神经移植物可植入患者体内以减少或最小化轴突再生、减少植入后在该部位形成之神经瘤的大小或数量、减缓神经瘤形成及/或完全防止神经瘤形成。神经移植物可以代替神经帽或与神经帽结合使用。患者可为人类或非人类动物。
根据本文方法制备的神经移植物可表现出减少的神经瘤形成及/或减少的轴突生长。本文的神经移植物可抑制神经瘤形成及/或抑制神经元延伸。如本文所用，抑制包括减少、最小化、减缓及/或防止神经瘤形成及/或神经元延伸。
可由试剂盒制备根据本公开的分解溶液。例如，用于制备再生潜力衰减的神经移植物的试剂盒可以包括组织以及分解溶液的一种或多种成分，例如胰蛋白酶、ACT及EDTA。其他成分可包括例如用于进行清洗的试剂，例如一种或多种缓冲溶液、含丝氨酸的血清或缓冲液/含丝氨酸的溶液之组合。可选地，试剂盒可以包括一种或多种添加物，在分解及一次或多次清洗后组织将暴露于该添加物，例如钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白。试剂盒的组织及试剂可以包装在水性介质中或以冷冻干燥形式包装。试剂盒还可以包括可于其中处理及/或储存组织之一个或多个容器、器皿或管，并且可以包括用于根据合适的参数例如时间、温度、分解溶液浓度等来制备分解溶液及/或处理组织之说明。
根据本公开的一些面向，试剂盒包括神经移植物及试剂可以放置或适当地分装至其中的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他合适的容器。本公开的试剂盒可以提供隔离密闭的试剂容器以用于商业销售。此类容器可包括其中保留有一个或多个小瓶的注射容器或吹模成型容器。该试剂盒还可包含用于在以试剂处理后储存移植物的器皿或其他合适的容器。
藉由以下非限制性示例可以进一步理解本公开。示例旨在说明上述公开而不应解释为缩小其范围。本技术领域中具有通常知识者将容易地认识到，这些示例提出了可以实践本公开的许多其他方式。应当理解，在保持于本公开之范围内的同时可以进行多种变化和修改。
示例1：软组织分解
本实验的目的是测试模型神经组织的分解操作准则和基底膜蛋白质的分解，同时保持组织的物理和微观结构完整性。模型神经组织是Axogen,Inc.(Alachua,FL,US)制造的
Nerve Grafts(1至2mm)。
藉由在15mL锥形管中混合6.6mL之胰蛋白酶/EDTA(0.25％)(Fisher Scientific,Hampton,NH,USA)与4.4mL之无菌再蒸馏水，制备胰蛋白酶/EDTA(0.15％)储备溶液。市售的胰蛋白酶/EDTA(0.25％)储备溶液中的胰蛋白酶为2700单位/mg USP。
分别将16.5mg和27.5mg之干粉ACT(Fisher Scientific,Hampton,NH,USA)添加至11mL的0.15％与0.25％之胰蛋白酶/EDTA储备溶液中，制备胰蛋白酶/ACT/EDTA之分解溶液，并藉由将15mL锥形管轻轻摇动及倒置进行混合。ACT呈报为35USP单位/mg。0.15％分解溶液包含约4.1x103USP单位/mL之胰蛋白酶、约52.5USP单位/mL之ACT及约1.3mM之EDTA；表1列出了化学成分。0.25％分解溶液包含约6.8x103USP单位/mL之胰蛋白酶、约87.5USP单位/mL之ACT及约3.6mM之EDTA。
表1
使用Zivic切割板(Zivic Instruments,Pittsburg,PA,USA)解冻各
Nerve Graft样品并切割成约3mm的节段。然后将节段与100μL之分解溶液一起放入1.5mL离心管中，并在37℃下温育2小时。接着使用球型移液管吸取分解溶液，并用1mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗移植物3次。然后将500μL之胎牛血清(FBS)添加到每个管中，并将样品在37℃下温育45至55分钟。吸出FBS，加入新鲜的FBS，然后再次温育试管以总共进行两次FBS处理。然后，将1mL之PBS添加到各管中以用于储存移植物。
示例2：再生潜力测定
对示例1之经处理的神经组织样品进行评估以确定经由基底膜蛋白质的分解之组织的再生潜力。还藉由对另一神经组织样品(
Nerve Graft)进行化学处理以将参与神经元生长的蛋白质进行交联及化学去活化来制备经化学钝化的样品，以用于与经分解酶处理及未处理的样品进行比较。再生潜力由神经元生长测量(neurite outgrowthmeasurement，NOM)测定系统确定。在进行测量之前，彻底清洗这些节段以去除任何残留的酶。
将清除所有根的大鼠背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)置于各测试样品节段及用胶原凝胶进行了化学钝化的样品上，并在含有神经基础培养基、麸酰胺、B27及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的标准培养基中培养7天以允许神经元生长。然后将样品固定并在每个节段的多个位准纵向切片，以用于神经元延伸的组织学测量。使用βIII-微管蛋白实现神经元染色。自DRG边缘到神经元尖端确定神经元的生长长度(在所有切片中观察到的最长之三个的平均值)。如果不存在DRG，则假定DRG在处理过程中脱落，并且不计算样品。
作为阳性对照组样品，将3mg/mL之胶原I中的30％ Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞外基质衍生凝胶(EHS凝胶)置于基于细胞外基质之管内(extracellular matrix-based tube，ECM，猪衍生的空心管导管，
Nerve Connector,Axogen,Inc.,Alachua,FL,USA)。将ECM进行水合约60分钟。从ECM管中去除多余的液体，然后填充EHS凝胶，让凝胶凝固。然后将DRG放置在EHS填充管的一端，且于其他样品对节段进行上述处理。各种样品的处理汇整于表2。表2中，阴性对照组对应于未接受DRG的神经组织样品(
Nerve Graft)。
表2
表3呈报神经元生长试验的结果。
表3
| 组 | 平均NOM(μm)+/-SD |
| 胰蛋白酶/EDTA–0.25％ | 1159±637 |
| 胰蛋白酶/EDTA–0.15％ | 1207±434 |
| 胰蛋白酶/α-胰凝乳蛋白酶/EDTA–9.25％ | 491±250 |
| 胰蛋白酶/α-胰凝乳蛋白酶/EDTA–0.15％ | 424±157 |
| 经化学钝化(10％NBF) | 840±300 |
| 标准处理 | 1671±716 |
与未用分解溶液处理的标准神经组织样品(对照组)相比，用分解溶液分解基底膜蛋白质导致经处理的神经组织样品中神经元生长的程度显著降低。这项研究表明，神经移植物中的基底膜蛋白质如层连结蛋白会支持神经移植物的再生能力。
如表3所示，在没有ACT的情况下，用0.15％或0.25％浓度的胰蛋白酶/EDTA分解神经组织样品并未显著减少经处理之神经组织样品中的神经元延伸(p>0.05)。与标准组相比，用0.15％或0.25％浓度的胰蛋白酶/ACT/EDTA溶液处理样品导致这些样品的再生潜力显著降低(分别为p＝0.002、p＝0.0002)。与经化学钝化的对照组相比，用胰蛋白酶/ACT/EDTA处理导致经处理的样品的再生潜力的趋势降低；然而，两种处理之间的再生潜力差异于统计上无显著性(p>0.999)。经化学钝化的样品显示减少之平均神经元延伸；与标准组相比，该减少于统计上无显著性(p>0.683)(图1)。
示例3：组织学测量
藉由组织学筛选方法对示例1及2所述的分解样品及以0.25％ACT溶液处理的神经组织样品之内部微观结构进行评价。该技术评估神经节段内神经内膜管的几何形状。进行神经内膜管评估(ETA)以确定每100000μm的管周长、每100000μm的管数、神经内膜管的百分比面积及总束面积(μm2)。处理遵循示例1中概述的操作准则，分解溶液列于下述表4中。
处理后的各节段被固定并进行石蜡包埋切片。对于阴性对照组，10个节段未经处理(对照组)。获得每个样品的横截面。各节段为8μm厚。表4显示了所分析的每一类处理方案中的样品数量。
表4
各横截面都用针对层连结蛋白之抗体进行染色，结果显示在图2A至2D的显微照片中。这些图像对应于层连结蛋白染色样品的福马林固定-石蜡包埋(formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE)横截面。在未处理的神经移植物的横截面内观察到正常的神经内膜管层连结蛋白染色(图2A)。用胰蛋白酶/EDTA(图2B)或胰蛋白酶/ACT/EDTA(图2C)处理神经移植组织样品会导致神经组织神经内膜管内可检测的及完整的层连结蛋白被去除；在处理这些样品后，神经内膜管内之层连结蛋白染色的量减少。未观察到胰蛋白酶/EDTA处理(图2B)导致神经ECM的分解。观察到以胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的神经组织节段内之ECM的分解最少；未观察到此种ECM解离神经组织束(图2C)。用ACT溶液处理导致神经内膜管内之层连结蛋白的分解最少，同时影响移植物束周围之ECM的完整性(图2D)。
还分析了经处理的节段之内部微观结构的完整性。在对照组节段与用胰蛋白酶/EDTA或胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的样品中，未检测到评估参数之间的统计差异。结果总结在下述表5中。
表5
图3A至3B及图4A至4B显示了对照组与经处理的样品之微观结构的定量的长条图。图3A表示样品神经组织的周长，其值(μm)以每100000μm的管周长表示，用于未经处理的样品(对照组，最左侧)、经胰蛋白酶/EDTA处理的样品(中间)以及经胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的样品(最右侧)。图3B表示未经处理的样品(对照组，最左侧)、经胰蛋白酶/EDTA处理的样品(中间)以及经胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的样品(最右侧)之每100000μm的管数。图4A表示未经处理的样品(对照组，最左侧)、经胰蛋白酶/EDTA处理的样品(中间)以及经胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的样品(最右侧)的神经内膜管的面积百分比。图4B显示了未经处理的样品(对照组，最左侧)、经胰蛋白酶/EDTA处理的样品(中间)以及经胰蛋白酶/ACT/EDTA处理的样品(最右侧)的总束面积，单位为μm2。
示例4：经分解的神经组织之蛋白质体学
评估如示例1中所述之经处理的分解样品是否存在与周围神经组织的神经再生活性相关的基底膜蛋白质，包括活性层连结蛋白链、IV型胶原蛋白链及巢蛋白。分析是藉由液相层析-选择反应监测(LC-SRM)实现，包括针对感兴趣的ECM蛋白质的稳定同位素标记标准。
为了进行蛋白质体学分析，将经分解的神经样品与未经处理的对照组样品称重至1mg，并溶解于包含NH2OH、KCO3及盐酸胍的碱性溶液至10mg/mL。然后将样品在加热及搅拌下温育28小时，获得大多数样品的澄清溶液。
将等体积的各样品与已知浓度的ECM标准品混合，并用0.25％之胰蛋白酶/ACT/EDTA进行蛋白水解分解。藉由LC-SRM ECM测定分析所得之肽。结果示于图5A至5B(经处理的样品＝「经分解的Avance」，未经处理的对照组＝「Avance」)。与未经处理的神经组织相比，用胰蛋白酶/ACT/EDTA处理周围神经组织导致基底膜内之活性层连结蛋白链显著减少。层连结蛋白链包括层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2及层连结蛋白γ-1(图5A)。此外，与未经处理的神经组织相比，经分解的样品表现出胶原蛋白IV链(胶原蛋白α-1(IV)、胶原蛋白α-1/5(IV)、胶原蛋白α-2(IV)、胶原蛋白α-3(IV)、纤网蛋白、珍珠素及巢蛋白(巢蛋白-1及巢蛋白-2)(图5B)显著减少。总体而言，与未经处理的神经组织相比，经分解的样品中测试的蛋白质减少了10倍。
应当理解，虽然本公开已经藉由较佳实施方式、示例性实施方式与可选之特征具体公开，但是本技术领域中具有通常知识者可以对本文公开的概念进行修改和变化，且这样的修改和变化被认为是属于所附申请专利范围所限定之本公开的范围。本文提供的具体实施方式和示例仅是非限制性和说明性的；对于本技术领域中具有通常知识者来说显而易见的是，可以使用本说明书中阐述的装置、装置组件、方法步骤的大量变体来实施本公开。本技术领域中具有通常知识者将认识到，可用于本方法的方法和装置可包括各种可选的组合物及处理元件与步骤。
Claims (73)
1.一种制备组织移植物的方法，其特征在于，包括：
用包含(a)胰蛋白酶及α-胰凝乳蛋白酶(ACT)，或(b)胰蛋白酶、ACT及乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液处理组织，以从该组织中基本上去除一种或多种易感蛋白质。
2.如权利要求1记载的方法，其中，该分解溶液包含约3.5x 103USP单位/mL至约4.5x103USP单位/mL的胰蛋白酶。
3.如权利要求1或2记载的方法，其中，该分解溶液包含约50USP单位/mL至约55USP单位/mL的ACT。
4.如前述权利要求任一项记载的方法，其中，该分解溶液包含约1.2mM至约1.5mM的EDTA。
5.如前述权利要求任一项记载的方法，其中，该分解溶液包含以下一种或多种：
约3.5x 103USP单位/mL至约4.5x 103USP单位/mL的胰蛋白酶；
约50USP单位/mL至约55USP单位/mL的ACT；及
约1.2mM至约1.5mM的EDTA。
6.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该分解溶液还包含至少一种蛋白分解酶。
7.如前述权利要求任一项记载的方法，其中，该一种或多种易感蛋白质包括层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的至少一种或其组合。
8.如前述权利要求任一项记载的方法，其中经处理的该组织基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2和层连结蛋白γ-1的一种或多种。
9.如前述权利要求任一项记载的方法，其中经处理的该组织基本上不包含胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链和胶原蛋白αIV-3链中的一种或多种。
10.如前述权利要求任一项记载的方法，其中经处理的该组织基本上不包含纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种。
11.如前述权利要求任一项记载的方法，其中，经处理的该组织包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。
12.如前述权利要求任一项记载的方法，其中在约4℃至约40℃的温度下用该分解溶液处理该组织。
13.如前述权利要求任一项记载的方法，其中用该分解溶液处理该组织约4小时至约24小时的时间段范围。
14.如前述权利要求任一项记载的方法，进一步包括用pH范围为约6.8至约7.5的缓冲溶液清洗经处理的该组织。
15.如权利要求14记载的方法，其中该缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、盐性阴极液、Tris缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、索任生磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液。
16.如权利要求14或15记载的方法，其中用该缓冲溶液清洗经处理的该组织两次或更多次。
17.如权利要求14-16任一项记载的方法，其中用该缓冲溶液在约4℃至约40℃的温度范围清洗经处理的该组织。
18.如权利要求14-17任一项记载的方法，其中用该缓冲溶液在约1分钟至约4小时的时间段范围清洗经处理的该组织。
19.如前述权利要求任一项记载的方法，进一步包括用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗经处理的该组织。
20.如权利要求19所述的方法，其中该血清为胎牛血清、兔血清、山羊血清、马血清、绵羊血清、猪血清或鸡血清。
21.如权利要求19或20记载的方法，其中用该血清清洗经处理的该组织两次或更多次。
22.如权利要求19-21任一项记载的方法，其中用该血清在约4℃至约40℃的温度范围清洗经处理的该组织。
23.如权利要求19-22任一项记载的方法，其中用该血清在约30分钟至约8小时的时间段范围清洗经处理的该组织。
24.如前述权利要求任一项记载的方法，进一步包括使经处理的该组织与钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白接触，其中该缓冲溶液、该血清或该缓冲溶液及该血清两者可选地包含钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣及/或醣蛋白。
25.如权利要求24记载的方法，其中该组织移植物包含钙通道阻断剂，且其中该钙通道阻断剂包含钴Co2+、锰Mn2+、镧La3+或尼群地平中的一种或多种。
26.如权利要求24记载的方法，其中该组织移植物包含醣胺聚醣，且其中该醣胺聚醣包含角蛋白硫酸盐或软骨素硫酸盐中的一种或多种。
27.如权利要求24记载的方法，其中该组织移植物包含醣蛋白，且其中该醣蛋白包含一种或多种髓磷脂相关之醣蛋白。
28.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该组织移植物为神经移植物，其导致在移植入患者后神经瘤形成减少及/或轴突向外生长减少。
29.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该组织移植物具有长度约3mm至约100mm，例如约5mm至约100mm，或约15mm至约40mm。
30.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该组织移植物的直径约为1mm至约10mm，例如直径约为1mm至约7mm，或直径约为1mm至约2mm。
31.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该组织移植物限定总体积的范围为约5mm3至约55000mm3。
32.如前述权利要求任一项记载的方法，其中经处理的该组织移植物藉由冷冻干燥进一步处理。
33.如前述权利要求任一项记载的方法，经处理的该组织移植物通过经处理的该组织形成糊状物或经处理的该组织形成凝胶来进一步处理。
34.如前述权利要求任一项记载的方法，其中该组织为哺乳动物组织，例如人类组织、非人灵长类动物组织、囓齿动物组织、马组织、犬组织、兔组织、猪组织或羊组织。
35.如权利要求1-33任一项记载的方法，其中该组织为非哺乳动物组织，例如鱼类组织、两栖动物组织、昆虫组织或植物组织。
36.如权利要求1-33任一项记载的方法，其中该组织为神经组织，例如周围神经组织或中枢神经系统组织、上皮组织、结缔组织、肌肉组织、毛细管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织、或脂肪组织中的至少一种。
37.权利要求1-33中任一项记载的方法，其中该组织是上皮组织、结缔组织或肌肉组织。
38.权利要求1-33中任一项记载的方法，其中该组织是毛细血管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织或脂肪组织。
39.权利要求1-33中任一项记载的方法，其中该组织是合成组织。
40.一种根据权利要求1-33任一项的方法制备的组织移植物。
41.如权利要求40记载的组织移植物，其中该神经移植物基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种。
42.一种组织移植物，其特征在于，
其中该组织移植物基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种，且
其中该组织移植物包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。
43.如权利要求42记载的组织移植物，其中该神经移植物基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2和层连结蛋白γ-1中的一种或多种。
44.如权利要求42或43记载的组织移植物，其中该组织移植物基本上不包含、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链和胶原蛋白αIV-3链中的一种或多种。
45.如权利要求42-44任一项记载的组织移植物，其中该组织移植物基本上不包含纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1和巢蛋白-2中的一种或多种。
46.如权利要求42-45任一项28记载的组织移植物，其中该组织移植物包含至少0.1nmol/g的胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。
47.如权利要求42-46任一项记载的组织移植物，其中该组织移植物包含钙通道阻断剂、细胞外钙、醣胺聚醣和醣蛋白中的一种或多种。
48.如权利要求47记载的组织移植物，其中该组织移植物包含钙通道阻断剂，且该钙通道阻断剂包含钴Co2+、锰Mn2+、镧La3+或尼群地平中的一种或多种。
49.如权利要求47记载的组织移植物，其中该组织移植物包含醣胺聚醣，且其中该醣胺聚醣包含角蛋白硫酸盐或软骨素硫酸盐中的一种或多种。
50.如权利要求47记载的组织移植物，其中该组织移植物包含醣蛋白，且其中该醣蛋白包含一种或多种髓磷脂相关之醣蛋白。
51.如权利要求42-50任一项记载的组织移植物，其中该组织移植物具有长度约3mm至约100mm。
52.如权利要求42-51任一项记载的方法，其中该组织移植物的直径约为1mm至约10mm，例如直径约为1mm至约7mm，或直径约为1mm至约2mm。
53.如权利要求42-52任一项记载的组织移植物，其中该组织移植物限定总体积的范围为约5mm3至约55000mm3。
54.如权利要求40-53任一项记载的组织移植物，其中该组织移植物为神经移植物。
55.一种治疗患者的方法，包括将权利要求40-54任一项的组织移植物引入患者体内。
56.如权利要求55的方法，其中该组织移植物是神经移植物，且该神经移植物抑制或减轻神经瘤的形成。
57.如权利要求55的方法，其中该组织移植物是神经移植物，且该神经移植物经由该神经移植物保持轴突排列。
58.如权利要求55的方法，其中该神经移植物抑制或减少神经元延伸入该神经移植物。
59.如权利要求55-58中任一项的方法，其中患者是人类或非人类动物。
60.一种制备组织移植物的试剂盒，其特征在于，包括：
组织；
胰蛋白酶；以及
α-胰凝乳蛋白酶(ACT)。
61.如权利要求60记载的试剂盒，进一步包含乙二胺四乙酸(EDTA)。
62.如权利要求60-61任一项记载的试剂盒，其中该试剂盒包括包含该胰蛋白酶与该EDTA的第一容器以及包含该ACT的第二容器。
63.如权利要求60-62任一项记载的试剂盒，进一步包括缓冲溶液。
64.如权利要求63记载的试剂盒，其中该缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、盐性阴极液、Tris缓冲液、二甲胂酸盐缓冲液、索任生磷酸盐缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液。
65.如权利要求60-64记载的试剂盒，进一步包括包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清。
66.如权利要求65记载的试剂盒，其中该血清为胎牛血清、兔血清、山羊血清、马血清、绵羊血清、猪血清或鸡血清。
67.如权利要求60-66任一项记载的试剂盒，进一步包括制备包含该胰蛋白酶及该ACT的分解溶液或包含该胰蛋白酶、该ACT及该乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液的说明。
68.如权利要求67记载的试剂盒，进一步包括用该分解溶液处理该组织的说明。
69.如权利要求60-68记载的试剂盒，其中该组织为哺乳动物组织，例如人类组织、非人灵长类动物组织、囓齿动物组织、马组织、犬组织、兔组织、猪组织或羊组织；或非哺乳动物组织，例如鱼类组织、两栖动物组织、昆虫组织或植物组织。
70.如权利要求59-68任一项记载的试剂盒，其中该组织为神经组织，例如周围神经组织或中枢神经系统组织；或者该组织为上皮组织、结缔组织或肌肉组织。
71.如权利要求59-68任一项记载的试剂盒，其中该组织为毛细管组织、真皮组织、骨骼组织、平滑肌组织、心脏组织、或脂肪组织。
72.一种制备组织移植物的方法，其特征在于，包括：
用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶(ACT)及乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液处理组织；
用缓冲溶液清洗经处理的该组织一次或多次；以及
用该缓冲溶液清洗后，用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗经处理的该组织一次或多次；
其中经处理的该组织基本上不包含层连结蛋白α-1、层连结蛋白α-2、层连结蛋白α-4、层连结蛋白α-5、层连结蛋白β-1、层连结蛋白β-2、层连结蛋白γ-1、胶原蛋白IVα-1(IV)链、胶原蛋白IVα-1/5(IV)链、胶原蛋白αIV-2链、胶原蛋白αIV-3链、纤网蛋白1(III型4、7结构域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一种或多种，且
其中经处理的该组织包含胶原蛋白Iα-1链、胶原蛋白α-2(I)链、胶原蛋白α-3(VI)链、基膜聚醣、胶原蛋白α-1(VI)链、胶原蛋白α-1(XXVIII)链、皮连蛋白、胶原蛋白α-1(III)链、胶原蛋白α-3(V)链、角蛋白、II型细胞骨架1、小纤维蛋白-1、核心蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(XVI)链、玻璃黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XXXI)链、髓磷脂蛋白P0、胶原蛋白α-2(VI)链、胶原蛋白α-1(VIII)链、胶原蛋白α-1(V)链、无孢蛋白聚醣、脯精蛋白
(prolargin)、双醣链蛋白聚醣、胶原蛋白α-1(II)链、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、胶原蛋白α-1(XIV)链、α-水晶体蛋白B链或胶原蛋白α-1(XII)链中的一种或多种。
73.如权利要求72记载的方法，其中该组织移植物为神经移植物且该组织为神经组织。
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