TW202227105A - 神經移植物及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明描述了再生潛力降低的組織移植物、製備此類移植物的方法以及相關之套組與處理方法。該方法可以包括用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶(ACT)及可選的乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液處理組織以從組織中基本上去除一種或多種易感蛋白質。該方法還可包括用緩衝溶液及/或用含絲氨酸的血清清洗經處理的組織。根據所公開的方法製備的神經移植物可以抑制或減輕(例如，提供用以減少)神經瘤形成及/或植入後的軸突長出。

Description

神經移植物及其製備方法

本專利申請主張於 2020 年 8 月 28 日提交的美國臨時專利申請第 63/071635 號的優先權，其全部內容藉由引用併入本文。

周圍神經損傷是慢性殘疾的主要來源。當切斷的軸突無法與遠端神經重新建立連續性時，對神經損傷的管理不善會導致疼痛的神經瘤。儘管神經在受傷後有再生的潛力，但這取決於再生神經纖維與切斷的神經節段(以及其中的許旺氏細胞基底層)的適當接觸。在嚴重的組織損傷的情況下，正在再生的軸突可能無法到達遠端神經殘端，而會形成一團纏結的軸突及結締組織，最終導致疼痛的球狀神經瘤。在神經嚴重受損的情況下，例如受損或切斷的神經的不連續性太大而無法橋接，疼痛性神經瘤的形成仍然是一個挑戰。

目前用於神經瘤治療之允許對齊的軸突生長的技術，如將神經移植物或導管縫合到神經殘端(nerve stump)的末端，並不能充分保護神經末端免受包括生長因子和其他促進軸突生長的物質之外部環境的影響。隨著時間的推移，軸突因此可以生長穿過移植物或導管，並在它們離開開放的遠端時形成神經瘤，於該處不再有促進對齊生長的結構。當前的市售產品，例如神經帽(nerve cap)，已被用於經由阻遏軸突來提供用於阻礙神經元突延伸和神經生長的物理屏障。然而，由於神經帽中缺乏內部結構而可造成軸突於隨機方向延伸，這些裝置仍可導致一個或多個疼痛性神經瘤之產生。

根據本公開，製備組織移植物的方法可以用包括(a) 胰蛋白酶及 α-胰凝乳蛋白酶 (alpha-chymotrypsin，ACT)，或 (b) 胰蛋白酶、ACT 及乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) 的分解溶液處理組織，以從組織中基本上去除一種或多種易感蛋白質(susceptible proteins)。

該分解溶液可包含約 3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL 的胰蛋白酶。該分解溶液可包含約 50 USP 單位/mL 至約 55 USP 單位/mL的ACT。該分解溶液可包含約 1.2 mM 至約 1.5 mM 的 EDTA。該分解溶液可包含約3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL 的胰蛋白酶、約 50 USP 單位/mL 至約 55 USP 單位/mL的ACT、以及約 1.2 mM 至約 1.5 mM 的 EDTA。該分解溶液還可包含至少一種蛋白分解酶。該一種或多種易感蛋白質包括層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素(perlecan)、巢蛋白(nidogen)-1、 巢蛋白-2或其組合。經處理的該組織可基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2或層連結蛋白γ-1中的一種或多種。經處理的該組織可基本上不包含膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈或膠原蛋白αIV-3鏈中的一種或多種。經處理的該組織可基本上不包含纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一種或多種。經處理的該組織可包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣(lumican)、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白(dermatopontin)、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣(decorin)、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白(vitronectin)、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣(asporin)、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣(biglycan)、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素(periostin)、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。可在約4°C至約40°C的溫度下用該分解溶液處理該組織。可用該分解溶液處理該組織約4小時至約24小時的時間段範圍。該方法可進一步包括用pH範圍為約6.8至約7.5的緩衝溶液清洗經處理的該組織。該緩衝溶液可包括磷酸鹽緩衝液、鹽性陰極液(saline catholytes)、Tris緩衝液(Tris-buffered saline)、二甲胂酸鹽緩衝液(cacodylate buffer)、索任生磷酸鹽緩衝液(Sørensen's phosphate buffer)、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(phosphate-citrate buffer)或巴比妥緩衝液(barbital buffer)。可用該緩衝溶液清洗經處理的該組織兩次或更多次。可用該緩衝溶液在約4 °C至約40 °C的溫度範圍清洗經處理的該組織。可用該緩衝溶液在約1分鐘至約4小時的時間段範圍清洗經處理的該組織。該方法可進一步包括用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗經處理的該組織。該血清可為胎牛血清、兔血清、山羊血清、馬血清、綿羊血清、豬血清或雞血清。可用該血清清洗經處理的該組織兩次或更多次。可用該血清在約4 °C至約40 °C的溫度範圍清洗經處理的該組織。可用該血清在約30分鐘至約8小時的時間段範圍清洗經處理的該組織。該方法可進一步包括使經處理的該組織與鈣通道阻斷劑、細胞外鈣(extracellular calcium)、醣胺聚醣及/或醣蛋白接觸，任選地，其中該緩衝溶液、該血清或該緩衝溶液及該血清兩者可選地包含鈣通道阻斷劑、細胞外鈣 、醣胺聚醣及/或醣蛋白。該鈣通道阻斷劑可包含鈷Co ²⁺、錳Mn ²⁺、鑭La ³⁺或尼群地平(nitrendipine)中的一種或多種。該醣胺聚醣可包含角蛋白硫酸鹽(keratin sulfate)或軟骨素硫酸鹽(chondroitin sulfate)中的一種或多種。該醣蛋白可包含一種或多種髓磷脂相關之醣蛋白。在根據本文公開的方法製備的組織移植物為神經移植物的情況下，此種移植物在植入患者體內後可導致神經瘤形成減少及/或軸突生長減少。該組織移植物，特別是神經移植物，可具有約3 mm至約100 mm，例如約5 mm至約100 mm、或約15 mm至約40 mm的長度。組織移植物，特別是神經移植物的直徑可為約1 mm至約10 mm，例如約1 mm至約7 mm，或約1 mm至約2 mm。組織移植物，特別是神經移植物可以限定總體積的範圍為約5 mm ³至約55000 mm ³。該方法可進一步包括可藉由冷凍乾燥處理該組織移植物。該方法可進一步包括處理該組織移植物以形成糊狀物或凝膠。該組織可為哺乳動物組織，例如人類組織、非人靈長類動物組織、囓齒動物組織、馬組織、犬組織、兔組織、豬組織或羊組織。該組織可為非哺乳動物組織，例如魚類組織、兩棲動物組織、昆蟲組織或植物組織。該組織可為神經組織，例如周圍神經組織或中樞神經系統組織。該組織可為上皮組織、結締組織、肌肉組織。該組織可為微血管組織、真皮組織、骨骼組織、平滑肌組織、心臟組織、或脂肪組織。該組織可為合成組織，包括但不限於實驗室培育的組織。

此外，根據本公開，可以根據上述方法製備組織移植物。根據上述方法製備的組織移植物可基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種。此種移植物可為神經移植物。

進而，根據本公開，根據本文公開的方法製備的組織移植物可基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種，且可包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。此種移植物可為神經移植物。

該組織移植物可基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1中的一種或多種。該組織移植物可基本上不包含膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈中的一種或多種。該神經移植物可基本上不包含纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一種或多種。該神經移植物可包含至少 0.1 nmol/g的膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。該組織移植物可包含鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣及/或醣蛋白中的一種或多種。該鈣通道阻斷劑可包含鈷Co2+、錳Mn2+、鑭La3+或尼群地平中的一種或多種。該醣胺聚醣可包含角蛋白硫酸鹽或軟骨素硫酸鹽中的一種或多種。該醣蛋白可包含一種或多種髓磷脂相關之醣蛋白。該組織移植物，特別是神經移植物可具有約3 mm至約100 mm的長度。組織移植物，特別是神經移植物的直徑可為約1 mm至約10 mm，例如約1 mm至約7 mm，或約1 mm至約2 mm。組織移植物，特別是神經移植物可以限定總體積的範圍為約5 mm ³至約55000 mm ³。

更進一步地，根據本公開，治療患者的方法可以包括將如上所述的組織移植物引入患者體內。

該神經移植物可以抑制神經瘤的形成。神經移植物可以經由神經移植物保持軸突對齊。神經移植物可以抑制神經元突延伸至神經移植物中。患者可以是人類或非人類動物。

此外，根據本公開，用於製備神經移植物的套組可包括組織、胰蛋白酶以及α-胰凝乳蛋白酶(ACT)。

該套組可進一步包含乙二胺四乙酸(EDTA)。該套組可包括包含該胰蛋白酶與該EDTA的第一容器以及包含該ACT的第二容器。該套組可進一步包括緩衝溶液。該緩衝溶液可包括磷酸鹽緩衝液、鹽性陰極液、Tris緩衝液、二甲胂酸鹽緩衝液、索任生磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液或巴比妥緩衝液。該套組可進一步包括包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清。該血清可為胎牛血清、兔血清、山羊血清、馬血清、綿羊血清、豬血清或雞血清。該套組可進一步包括製備包含該胰蛋白酶及該ACT的分解溶液或包含該胰蛋白酶、該ACT及該乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液的說明。該套組可進一步包括用該分解溶液處理該組織的說明。該組織可為哺乳動物組織，例如人類組織、非人靈長類動物組織、囓齒動物組織、馬組織、犬組織、兔組織、豬組織或羊組織；或非哺乳動物組織，例如魚類組織、兩棲動物組織或昆蟲組織；或合成組織，例如但不限於實驗室培育的組織。該組織可為植物組織。該組織可為神經組織，例如周圍神經組織或中樞神經系統組織，或可為上皮組織、結締組織、肌肉組織。該組織可為微血管組織、真皮組織、骨骼組織、平滑肌組織、心臟組織、或脂肪組織。

此外，根據本公開，製備神經移植物的方法可包括：用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶 (ACT)及乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液處理組織；用緩衝溶液清洗經處理的該組織一次或多次； 以及用該緩衝溶液清洗後，用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗經處理的該組織一次或多次；其中經處理的該組織基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種，且其中經處理的該組織包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。

本技術領域中具有通常知識者將理解，本文公開的經再生潛力衰減處理之神經移植物可用於人類和其他脊椎動物的外科手術，以及實驗室之研究、比較與測定。

本技術領域中具有通常知識者將理解，在本公開的實踐中可以採用不同於具體舉例說明的那些起始材料、生物材料、試劑、合成方法、純化方法、分析方法、測定方法和生物方法，而無需求助於過度的實驗。任何此類材料和方法的所有本領域已知的功能等效物旨在包括於本公開中。

除非上下文另有說明，否則單數形式「一」及「該」包括複數形式。術語「大約」及「約」是指與參考數字或值幾乎相同。如本文所使用，術語「大約」及「約」通常應理解為涵蓋指定量或值的±5%。

已採用的術語和表達方式被用作描述而非限制，並且在使用此類術語和表達方式時並非旨在排除所表示及描述的特徵或其部分的任何等效物，但應理解為在要求保護的公開內容之範圍內可以進行各種修改。

本公開是關於具有降低的再生潛力，例如與再生潛力相關的某些生化化合物的含量較低之神經移植物的製備。例如，本公開包括處理組織以將其基底膜蛋白質之至少一部分進行減少、去除、變性或去活化的方法。相對於含有此種功能性基底膜蛋白質的移植物，使用這些材料作為神經移植物，例如經由減少神經元突生長及/或形成更小、更少、更不疼痛的神經瘤或不存在神經瘤，可以顯著降低植入後的神經再生活性。

在至少一面向，本文的方法包括用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶(ACT) 及可選的乙二胺四乙酸 (EDTA) 的分解溶液處理組織。用此種溶液處理組織可以選擇性地將組織內的至少一部分基底膜蛋白質去除、分解及/或去活化，而不會顯著影響組織內的其他蛋白質。經處理的組織可以用緩衝溶液及/或含絲氨酸的血清進行一個或多個清洗步驟，並且可選地可以用一種或多種添加物如鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣及/或醣蛋白進一步處理，進而降低神經移植物的再生潛力。

在神經組織中，基底膜為一片狀層，其圍繞包括周圍神經軸突及許旺氏細胞之神經細胞並將其與下面的結締組織及細胞外基質 (ECM)隔開。基底膜包含蛋白質，該蛋白質包括但不限於層連結蛋白(例如層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1)、膠原蛋白(例如膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈)、纖網蛋白(例如纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域))、珍珠素及巢蛋白(例如巢蛋白-1、 巢蛋白-2)。其他類型的組織也包括含有這些蛋白質的基底膜。這些蛋白質被認為有助於組織的再生能力。

如下文進一步討論的，本文的方法可以基本上去除或以其他方式降低基底膜蛋白質的濃度，同時保持組織的其餘部分完整。例如，對於神經組織，此種濃度降低的基底膜蛋白質與神經元突延伸及神經再生有關，而保持完整的部分包括不參與再生及存在於ECM中的蛋白質。如本文所用，術語「易感蛋白質」是指會被胰蛋白酶、ACT或兩者切割、變性或以其他方式去活化的基底膜蛋白質。例如，本文的方法可以去除一種或多種以下基底膜蛋白質的至少一部分：層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1及/或巢蛋白-2。此類易感蛋白質可從組織中部分或全部去除，而細胞外基質蛋白質及組織的結構基本保持完整。如本文所用，「基本上不包含」蛋白質是指組織(經處理的組織)或神經移植物基於各組織(經處理的組織)或移植物之質量，包含小於約0.1 nmol/g的蛋白質。

根據本公開的面向，用於製備移植物的組織可經處理以去除細胞性及非細胞性材料，包括誘導免疫反應或以其他方式與免疫反應相關的成分。例如，人類組織或其他動物例如哺乳動物或非哺乳動物之組織可經處理以去除細胞性及非細胞性成分，如細胞、脂肪、血液及/或軸突碎屑，同時保留組織的三維結構(例如神經組織的管狀結構)。在一些示例中，移植物是由非細胞性組織，例如非細胞性神經組織製備。

本文的方法包括用至少包含胰蛋白酶及ACT的分解溶液，例如包含胰蛋白酶、ACT及EDTA的分解溶液，處理具有基底膜的任何組織如神經組織(例如，細胞性、脫細胞及/或非細胞性組織)。分解溶液可以藉由將胰蛋白酶、ACT、EDTA以任意順序混合來製備，例如將胰蛋白酶與EDTA混合後加入ACT，或將胰蛋白酶與ACT混合後加入EDTA。可選地，分解溶液包含至少一種額外的蛋白分解酶。

根據本公開的一些示例，胰蛋白酶的濃度範圍可為約 3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 7.0 x 10 ³USP 單位/mL，例如約 3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL、約 4.0 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL、或約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 6.0 x 10 ³USP 單位/mL。此外，例如，ACT的濃度範圍可為約45 USP單位/mL至約60 USP單位/mL，例如約50單位/mL至約50單位/mL。EDTA的濃度範圍內可為例如約1.0 mM至約2.5 mM，例如約1.2 mM至約1.5 mM，或約1.5 mM至約2.0 mM。在至少一個示例中，分解溶液包含約 3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL 的胰蛋白酶、約 50 USP 單位/mL 至約 55 USP 單位/mL 的 ACT 及約 1.2 mM 至約 1.5 mM 的 EDTA。

以胰蛋白酶含量%表示的分解溶液可包含0.01%之胰蛋白酶(例如，0.01%之胰蛋白酶/ACT/EDTA溶液)至約0.3%或更多胰蛋白酶(例如，0.3%或更多胰蛋白酶/ACT/EDTA) 溶液)，例如約0.05%至約0.25%、約0.1%至約0.20%、約0.15%至約0.18%、約0.2%至約0.25%、約0.10%至約0.20%、約0.5%至約 0.12%之胰蛋白酶。

組織在分解溶液中溫育的持續時間可為至少2小時，例如約2小時至約4小時、約4小時至約24小時、約6小時至約12小時或約 10小至約16小時。合適的溫度範圍可為約4℃至約40℃，例如約4℃至約37℃、約4℃至約25℃、約20℃至約35℃，其中較低的溫度適合較長的溫育時間。在至少一個示例中，以分解溶液在約37℃至約40℃的溫度下處理組織約2小時至約4小時的時間段。在另外的例子中，能夠以用分解溶液在約 35°C至約 40°C之間的溫度下處理組織約 4 小時至約 6 小時之間的時間段，或在約 4°C 至約 15°C 之間的溫度下處理組織約 18 小時至約 24 小時之間的時間段。雖然此處列出了持續時間和溫度的示例性範圍，但一般而言，隨著溫育溫度降低，溫育的持續時間可以增加。分解的持續時間和相應的時間將被本技術領域中具有通常知識者理解並且屬於本技術領域中具有通常知識者的技術範圍內。組織在分解溶液中的溫育可於攪拌下進行。

在以分解溶液處理後，經處理的組織可以用緩衝溶液清洗一次或多次。例如，緩衝溶液的pH範圍可為約6.8至約7.6，如約7.2至約7.6、約7.3至約7.5，例如約7.4的pH。適用於清洗經處理的組織(在分解溶液中處理後)的示例性緩衝溶液包括但不限於磷酸鹽緩衝液(PBS)、鹽性陰極液、Tris緩衝液、二甲胂酸鹽緩衝液、索任生磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液及巴比妥緩衝液。緩衝溶液可以中和 pH 值並去除酶及/或分解溶液的其他成分。以緩衝溶液清洗經處理的組織可以避免組織在長期暴露於分解溶液中的酶時降解。例如，緩衝溶液可以中和組織中殘留的胰蛋白酶、ACT及EDTA。經處理的組織能夠以該緩衝溶液(或不同的緩衝溶液)清洗一次或多次，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。適用於給定之組織的清洗次數可取決於組織(或從經處理的組織製備之神經移植物)的大小、其密度、伴隨清洗之攪拌的使用與程度及/或其他因素，以基本上中和組織的pH值。

經處理的組織可以另外用含絲氨酸的血清如動物來源之血清，例如胎牛血清 (FBS)、兔血清、山羊血清、馬血清、綿羊血清、豬血清、 或雞血清清洗一次或多次。含絲氨酸的溶液可包含一種或多種絲氨酸成分，例如α-抗胰蛋白酶及/或α2巨球蛋白(A2M)，其量足以在用分解溶液處理後使組織中殘留的胰蛋白酶、ACT和EDTA去活化。例如，在清洗經處理的組織的步驟中使用 FBS 作為動物來源之血清的情況下，FBS 的滲透壓可為 280 mOsm/kg至340 mOsm/kg，或300 mOsm/kg至320 mOsm/kg。經處理的組織能夠以含絲氨酸的血清清洗一次或多次，包括2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。每次清洗的溫育持續時間及適合給定組織的清洗次數可取決於組織的大小、其密度、伴隨清洗之攪拌的使用與程度及/或其他因素，以基本上將至少殘留的胰蛋白酶、ACT與EDTA從組織中去活化及去除。例如，具有更大尺寸及/或更大密度的組織可能需要相對更多的清洗次數及/或更長的清洗持續時間。

在用緩衝溶液清洗組織之後，可以在含有絲氨酸的血清例如 FBS 中清洗組織一次或多次。在至少一個示例中，將經處理的組織如上所述用緩衝溶液清洗一次或多次，然後置於 FBS 或其他含絲氨酸的血清中並溫育約30分鐘至約24小時之間的時間段，例如，約30分鐘及約8小時之間、約45分鐘及約1小時之間、約1小時及約24小時之間、約4小時及約12小時之間、約8小時及約16小時之間或約12小時及24小時之間。適合在含絲氨酸的血清中溫育的溫度範圍可為約4°C至約37°C，例如約10°C至約35°C、約15°C至約30°C或約22°C至約 28°C，取決於溫育長度。例如，組織可以在約4°C至約37°C的溫度範圍內處理約45分鐘至約24小時的時間段範圍，其中較低的溫度(例如，約 4°C 至約 22 °C) 適合較長持續時間的溫育(例如，12 小時至約 24 小時)，而較高的溫度(例如，約 23°C 至約 37°C)適合較短的溫育時間段(例如，45分鐘至約11小時)。在至少一個非限制性示例中，經處理的組織在約37℃的溫度下以含絲氨酸的血清清洗45至60分鐘。

除了用緩衝溶液及含絲氨酸的血清分開清洗之外，或者作為替代，可以在用緩衝溶液清洗的同時用含絲氨酸的血清清洗經處理的組織。例如，可以用包含絲氨酸成分例如α-抗胰蛋白酶及/或A2M的緩衝溶液清洗經處理的組織。此種組合溶液可包含例如PBS和FBS。PBS(或其他緩衝溶液)與FBS(或其他含絲氨酸血清)的相對量如上所述，可以基於一個或多個因素，例如組織的大小、其密度、伴隨清洗之攪拌的使用及程度而決定。例如，PBS(或其他緩衝溶液)的體積可以隨著組織的大小及/或密度的增加而成比例地增加。在一些示例中，可以在用緩衝溶液及/或含絲氨酸的血清進行單次清洗或多次清洗之前及/或之後，用組合的緩衝液/含絲氨酸的溶液清洗組織。

可選地，組織移植物，特別是神經移植物，可藉由進一步使經處理及清洗的組織暴露於一種或多種添加物來製備，以例如進一步幫助降低再生潛力。示例性添加物包括但不限於鈣通道阻斷劑，也稱為鈣滲透阻斷劑(例如Co ²⁺、錳Mn ²⁺、鑭La ³⁺或尼群地平)、細胞外鈣、醣胺聚醣(包括但不限於角蛋白硫酸鹽及/或軟骨素硫酸鹽)和醣蛋白(包括但不限於髓磷脂相關之醣蛋白)。添加物的量的範圍可為約0.1 mM至約1000 M，如約1 mM至約500 M、約0.1 M至約250 M、約0.5 M至約100 M、約5 M至約50 M、約0.1 mM至約50 mM、約10 mM至約100 mM、或約0.5 M至約10 M、約25 M至約250 M。

可以將添加物添加至溶液如pH中性溶液，例如pH為約6.8至約7.6。可以在處理及/或清洗經處理的組織期間，將添加物添加至上述任何分解溶液、緩衝溶液及/或含絲氨酸的血清中，及/或可藉由在其最終清洗期間或之後進一步將經處理及清洗的組織暴露於添加物來製備移植物。附加地或替代地，根據本文方法進行處理後，可以在儲存於pH中性溶液(例如，pH自約6.8至約7.6)之前及/或自儲存於pH中性溶液(例如，pH自約6.8至約7.6)中取出之後，將添加物添加至移植物，該pH中性溶液可選地為緩衝溶液。因此，舉例來說，組織移植物，例如神經移植物，在其用於醫療程序時可包含添加物。

一旦用分解溶液處理並如上所述清洗，並且可選地包括一種或多種添加物，就可以儲存經處理的組織。所得移植物可為濕形式、冷凍形式或冷凍乾燥形式。根據本公開的一些面向，以冷凍乾燥進一步處理神經移植物。在冷凍乾燥期間，可以控制壓力、水含量及/或溫度以保持所欲之神經移植物的內部微觀結構。根據一些面向，神經移植物被進一步處理以形成凝膠或糊狀物。例如，聚合因子可用於從已根據本文的方法以分解溶液處理過的組織來製備凝膠或糊狀物。凝膠或糊狀物可具有與待治療之神經的彈性模量相似的彈性模量，以防止可導致神經瘤進一步形成的神經之機械性壓迫或將其最小化。

根據本文的方法處理後，可將移植物(可選地藉由冷凍乾燥處理、或經處理以形成凝膠或糊狀物)置於儲存容器中，然後保持在約-80°C至室溫(約 20至22°C)的溫度範圍內。儲存容器可以在急驟冷凍並保持在-80°C 或更低的溫度下數週、數月或數年。儲存容器也可以基本上是氣密的並且用惰性氣體回填。在一些示例中，如本文所公開地處理組織(例如，利用分解溶液，並用可包括緩衝溶液的含絲氨酸之血清進行一次或多次清洗，並且可選地以包含緩衝溶液的額外清洗)，然後轉移至緩衝溶液，例如緩衝鹽水溶液，其pH範圍約7.2至約7.6，例如pH約7.3至約7.5、例如pH約7.4，用以在使用於醫療程序前進行儲存。適用於儲存根據本文方法製備的移植物的示例性緩衝溶液包括但不限於PBS、鹽性陰極液、Tris 緩衝液、二甲胂酸鹽緩衝液、索任生磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液及巴比妥緩衝液。用於儲存移植物的緩衝溶液可包含一種或多種添加物，如上所述(例如，一種或多種鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣、醣蛋白或其組合)。

令人驚訝地發現，用本文公開的分解溶液溫育組織是可選擇性的，並且降低了組織內基底膜蛋白質的量，同時對存在於ECM中的蛋白質的量基本上沒有可測量的影響。例如，作為以分解溶液進行溫育的結果，組織內的基底膜蛋白質的60%至100%、或80%至100%的量可被去除，例如被去活化和/或被變性。由於基底膜蛋白質的減少，經處理的組織的基底膜蛋白質可能會「失活(deactivated)」，意味著經處理的組織在體外或被植入受試者體內時，可防止其支持神經再生及/或降低其支持神經再生的能力。使用胰蛋白酶、ACT 和 EDTA 的分解過程可以基本上去除例如以下易感基底膜蛋白質中的一種或多種：層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2。在至少一個示例中，經處理的組織及/或由經處理的組織製備的移植物基本上不含對於由胰蛋白酶及/或ACT造成之裂解敏感的蛋白質中的一種或多種。相同的分解過程可能對例如以下蛋白質，也可認為是非易感蛋白質中的一種或多種基本上沒有可測量的影響：膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、無孢蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(V)鏈、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈。例如，在用分解溶液處理後，經處理的組織及/或由經處理的組織製備的移植物可包含0.1 nmol/g或更多的非易感蛋白質，例如0.15 nmol/g或更多，或是 0.2 nmol/g 或更多的非易感蛋白質。

分解程度及分解過程後殘留於組織中之易感蛋白質的量可取決於分解過程中所採用的參數，例如胰蛋白酶、ACT及/或EDTA的濃度、為了在分解溶液中進行溫育所提供的時間量、作為額外的再生潛力衰減劑加入的添加物，及/或移植物的特性例如組織密度及/或存在於組織中之基底蛋白質的量、攪拌的程度和使用、進行分解處理的溫度。例如，隨著分解酶濃度的增加，可以從體積相對大的組織中去除更多易感蛋白質，包括基底膜蛋白質。增加分解時間將反過來增加分解率。在一些面向，提高分解發生的溫度可以提高易感蛋白質的分解率。在某些情況下，分解處理會減少一種或多種易感蛋白質的量，以至於無法藉由定量測量技術如有無使用高效能液相層析法(high performance liquid chromatograph，HPLC)之串聯質譜法 (MS/MS)、液相層析-選擇反應監測 (liquid chromatography-selected reaction monitoring，LC-SRM)、酵素結合免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 及多重蛋白質檢測技術如快速蛋白質液相層析 (fast protein liquid chromatography，FPLC) 檢測到。在一些情況下，在經處理的組織及/或從經處理的組織製備之移植物中檢測不到易感蛋白質。

與用分解溶液處理之前的組織相比及/或與參考用之未經處理的組織相比，本文所述的關於神經移植物的組織處理方法可以提供具有至少2倍的神經再生活性損失之神經移植物。再生潛力降低的程度可以是例如至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少 12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少20倍或至少50倍。與對照組相比，再生潛力降低的程度可以藉由合適的分析技術來確定，例如有無使用HPLC、ELISA、FPLC之MS/MS、或藉由生物測定例如但不限於評估從一簇神經元或神經細胞株到神經移植物或神經移植物的衍生物之神經元突延伸活動。

適合根據本文方法處理的組織可以是天然的或合成的。例如，組織可以是從動物如哺乳動物，包括人或非人哺乳動物，或非哺乳動物，包括魚、兩棲動物或昆蟲獲得的軟生物組織。組織可以是植物組織。移植物對於被植入移植物的患者可以是同種異體的或異種的。組織可以是神經組織，包括例如周圍神經組織或中樞神經系統組織。適用於本公開的其他類型的組織包括但不限於上皮組織、結締組織、肌肉組織、微血管組織、真皮組織、骨骼組織、平滑肌組織、心臟組織和脂肪組織。如上所述，軟生物組織可以是哺乳動物組織，包括人類組織和其他靈長類動物組織、囓齒動物組織、馬組織、犬組織、兔組織、豬組織或羊組織。此外，組織可以是選自魚類、兩棲動物或昆蟲組織之非哺乳動物組織。組織可以是合成組織，例如但不限於實驗室培育的組織。根據一些示例，組織是從動物如人或非人哺乳動物獲得的神經組織。

本文還考慮了植入患者之前及/或之後的免疫抑制技術。例如，可以結合移植物的植入對患者施用一種或多種免疫抑制劑。例如，移植物可包含經由移植物傳遞至患者的一種或多種免疫抑制劑。

經處理的組織及/或由經處理的組織製備的移植物可具有適於治療患者神經損傷的尺寸。例如，經處理的組織及/或移植物的長度可介於約3 mm與約100 mm之間，例如介於約5 mm 約100 mm之間、介於約20 mm與約50 mm之間、介於約45 mm與約75 mm之間 ，或長度介於約 15 mm與約 40 mm之間。此外，例如，移植物可限定總體積的範圍為約5 mm ³至約55000 mm ³，例如約100 mm ³至約 25000 mm ³、約500 mm ³至約10000 mm ³、約1000 mm ³至約5000 mm ³、約500 mm ³至約2000 mm ³、約100 mm ³至約5000 mm ³或約 7500 mm ³至約15000 mm ³。

本文中的神經移植物可植入患者體內以減少或最小化軸突再生、減少植入後在該部位形成之神經瘤的大小或數量、減緩神經瘤形成及/或完全防止神經瘤形成。神經移植物可以代替神經帽或與神經帽結合使用，例如美國專利第9629997號、美國專利第10952806號、美國專利第10945805號、美國專利申請公開第 2021/0186645 號，以及美國專利申請公開第2021/0161611號所述之裝置。患者可為人類或非人類動物。

根據本文方法製備的神經移植物可表現出減少的神經瘤形成及/或減少的軸突生長。本文的神經移植物可抑制神經瘤形成及/或抑制神經元突延伸。如本文所用，抑制包括減少、最小化、減緩及/或防止神經瘤形成及/或神經元突延伸。

可由套組製備根據本公開的分解溶液。例如，用於製備再生潛力衰減的神經移植物的套組可以包括組織以及分解溶液的一種或多種成分，例如胰蛋白酶、ACT及EDTA。其他成分可包括例如用於進行清洗的試劑，例如一種或多種緩衝溶液、含絲氨酸的血清或緩衝液/含絲氨酸的溶液之組合。可選地，套組可以包括一種或多種添加物，在分解及一次或多次清洗後組織將暴露於該添加物，例如鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣及/或醣蛋白。套組的組織及試劑可以包裝在水性介質中或以冷凍乾燥形式包裝。套組還可以包括可於其中處理及/或儲存組織之一個或多個容器、器皿或管，並且可以包括用於根據合適的參數例如時間、溫度、分解溶液濃度等來製備分解溶液及/或處理組織之說明。

根據本公開的一些面向，套組包括神經移植物及試劑可以放置或適當地分裝至其中的至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他合適的容器。本公開的套組可以提供隔離密閉的試劑容器以用於商業銷售。此類容器可包括其中保留有一個或多個小瓶的注射容器或吹模成型容器。該套組還可包含用於在以試劑處理後儲存移植物的器皿或其他合適的容器。

藉由以下非限制性示例可以進一步理解本公開。示例旨在說明上述公開而不應解釋為縮小其範圍。本技術領域中具有通常知識者將容易地認識到，這些示例提出了可以實踐本公開的許多其他方式。應當理解，在保持於本公開之範圍內的同時可以進行多種變化和修改。

示例1：軟組織分解 本實驗的目的是測試模型神經組織的分解操作準則和基底膜蛋白質的分解，同時保持組織的物理和微觀結構完整性。模型神經組織是 Axogen, Inc. (Alachua, FL, US) 製造的 Avance® Nerve Grafts (1至2 mm)。

藉由在15 mL錐形管中混合6.6 mL之胰蛋白酶/EDTA(0.25%)(Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)與4.4 mL之無菌再蒸餾水，製備胰蛋白酶/EDTA(0.15%)儲備溶液。市售的胰蛋白酶/EDTA (0.25%) 儲備溶液中的胰蛋白酶為 2700 單位/mg USP。

分別將16.5 mg和27.5 mg之乾粉ACT(Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)添加至11 mL的0.15%與0.25%之胰蛋白酶/EDTA 儲備溶液中，製備胰蛋白酶/ACT/EDTA 之分解溶液 ，並藉由將15 mL 錐形管輕輕搖動及倒置進行混合。ACT呈報為35 USP單位/mg。0.15% 分解溶液包含約4.1 x 10 ³USP單位/mL 之胰蛋白酶、約52.5 USP單位/mL之ACT及約1.3 mM之EDTA；表1列出了化學成分。0.25% 分解溶液包含約 6.8 x 10 ³USP 單位/mL之胰蛋白酶、約87.5 USP 單位/mL之ACT及約3.6 mM之EDTA。

表1

分解溶液 (0.15%)
成分	濃度 (mg/L)
D-葡萄醣	600.00
EDTA • 4Na • 2H 2O	552.00
KCl	240.00
KH 2PO 4	36.00
NaCl	4800.00
NaHCO 3	---
Na 2HPO 4(無水)	28.62
酚紅• Na	6.00
胰蛋白酶	1500.00
α- 胰凝乳蛋白酶 (ACT)	1500.00

使用 Zivic切割板(Zivic Instruments, Pittsburg, PA, USA)解凍各Avance® Nerve Graft 樣品並切割成約3 mm的節段。然後將節段與100 µL之分解溶液一起放入1.5 mL離心管中，並在37℃下溫育 2 小時。接著使用球型移液管吸取分解溶液，並用1 mL無菌磷酸鹽緩衝液 (PBS) 清洗移植物3次。然後將500 µL之胎牛血清(FBS)添加到每個管中，並將樣品在37℃下溫育45至55分鐘。吸出 FBS，加入新鮮的 FBS，然後再次溫育試管以總共進行兩次FBS處理。然後，將 1 mL之PBS添加到各管中以用於儲存移植物。

示例2：再生潛力測定 對示例1之經處理的神經組織樣品進行評估以確定經由基底膜蛋白質的分解之組織的再生潛力。還藉由對另一神經組織樣品 (Avance® Nerve Graft)進行化學處理以將參與神經元突生長的蛋白質進行交聯及化學去活化來製備經化學鈍化的樣品，以用於與經分解酶處理及未處理的樣品進行比較。再生潛力由神經元突生長測量(neurite outgrowth measurement，NOM)測定系統確定。在進行測量之前，徹底清洗這些節段以去除任何殘留的酶。

將清除所有根的大鼠背根神經節 (dorsal root ganglia，DRG) 置於各測試樣品節段及用膠原凝膠進行了化學鈍化的樣品上，並在含有神經基礎培養基、麩醯胺、B27 及神經生長因子 (nerve growth factor，NGF) 的標準培養基中培養 7 天 以允許神經元突生長。然後將樣品固定並在每個節段的多個位準縱向切片，以用於神經元突延伸的組織學測量。使用 βIII-微管蛋白實現神經元突染色。自DRG邊緣到神經元突尖端確定神經元突的生長長度(在所有切片中觀察到的最長之三個的平均值)。如果不存在 DRG，則假定 DRG 在處理過程中脫落，並且不計算樣品。

作為陽性對照組樣品，將3 mg/mL之膠原I中的30% Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤細胞外基質衍生凝膠(EHS 凝膠)置於基於細胞外基質之管內(extracellular matrix-based tube，ECM，豬衍生的空心管導管，AxoGuard® Nerve Connector, Axogen, Inc., Alachua, FL, USA)。將ECM進行水合約 60 分鐘。從ECM管中去除多餘的液體，然後填充EHS凝膠，讓凝膠凝固。然後將 DRG 放置在 EHS 填充管的一端，且於其他樣品對節段進行上述處理。各種樣品的處理匯整於表2。表 2 中，陰性對照組對應於未接受 DRG 的神經組織樣品 (Avance® Nerve Graft)。

表2

組	標準培養基中培養 7 天	培養前的化學固定	培養前的 分解 酶處理	培養前 DRG 置於節段末端
經分解的蛋白質 (Protein Digested，PD)	是	否	是	是
標準 (Standard，STD)	是	否	否	是
化學鈍化(Chemical Passivation，ChemP)	是	是	否	是
陰性對照組	是	否	否	否
陽性對照組	是	否	否	是

表 3 呈報神經元突生長試驗的結果。

表3

組	平均 NOM (μm) +/- SD
胰蛋白酶/EDTA – 0.25%	1159 ± 637
胰蛋白酶/EDTA – 0.15%	1207 ± 434
胰蛋白酶/α-胰凝乳蛋白酶/EDTA – 9.25%	491 ± 250
胰蛋白酶/α-胰凝乳蛋白酶/EDTA – 0.15%	424 ± 157
經化學鈍化 (10% NBF)	840 ± 300
標準處理	1671 ± 716

與未用分解溶液處理的標準神經組織樣品(對照組)相比，用分解溶液分解基底膜蛋白質導致經處理的神經組織樣品中神經元突生長的程度顯著降低。這項研究表明，神經移植物中的基底膜蛋白質如層連結蛋白會支持神經移植物的再生能力。

如表 3 所示，在沒有 ACT 的情況下，用0.15%或 0.25%濃度的胰蛋白酶/EDTA分解神經組織樣品並未顯著減少經處理之神經組織樣品中的神經元突延伸(p＞0.05)。與標準組相比，用0.15%或0.25%濃度的胰蛋白酶/ACT/EDTA 溶液處理樣品導致這些樣品的再生潛力顯著降低(分別為 p = 0.002、p = 0.0002)。與經化學鈍化的對照組相比，用胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理導致經處理的樣品的再生潛力的趨勢降低；然而，兩種處理之間的再生潛力差異於統計上無顯著性(p＞0.999)。經化學鈍化的樣品顯示減少之平均神經元突延伸；與標準組相比，該減少於統計上無顯著性(p＞0.683)(圖 1)。

示例3：組織學測量 藉由組織學篩選方法對示例1及2所述的分解樣品及以0.25％ACT溶液處理的神經組織樣品之內部微觀結構進行評價。該技術評估神經節段內神經內衣管的幾何形狀。進行神經內衣管評估 (ETA) 以確定每 100000 µm的管周長、每 100000 µm 的管數、神經內衣管的百分比面積及總束面積 (µm ²)。處理遵循示例1中概述的操作準則，分解溶液列於下述表4中。

處理後的各節段被固定並進行石蠟包埋切片。對於陰性對照組，10 個節段未經處理（對照組）。獲得每個樣品的橫截面。各節段為8 µm厚。表 4 顯示了所分析的每一類處理方案中的樣品數量。

表4

組	A	B	C	D
分解溶液	對照組	胰蛋白酶/EDTA (0.25%)	胰蛋白酶/ACT/EDTA (0.25%)	ACT (0.25%)
# 節段	10	10	10	10

各橫截面都用針對層連結蛋白之抗體進行染色，結果顯示在圖 2A至2D的顯微照片中。這些圖像對應於層連結蛋白染色樣品的福馬林固定-石蠟包埋 (formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE) 橫截面。在未處理的神經移植物的橫截面內觀察到正常的神經內衣管層連結蛋白染色(圖2A)。用胰蛋白酶/EDTA（圖2B）或胰蛋白酶/ACT/EDTA（圖2C）處理神經移植組織樣品會導致神經組織神經內衣管內可檢測的及完整的層連結蛋白被去除；在處理這些樣品後，神經內衣管內之層連結蛋白染色的量減少。未觀察到胰蛋白酶/EDTA處理（圖 2B）導致神經ECM的分解。觀察到以胰蛋白酶/ACT/EDTA處理的神經組織節段內之ECM的分解最少；未觀察到此種ECM解離神經組織束（圖 2C）。用ACT 溶液處理導致神經內衣管內之層連結蛋白的分解最少，同時影響移植物束周圍之ECM的完整性（圖 2D）。

還分析了經處理的節段之內部微觀結構的完整性。在對照組節段與用胰蛋白酶/EDTA 或胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理的樣品中，未檢測到評估參數之間的統計差異。結果總結在下述表5中。

表5

組	神經內衣管內之層連結蛋白的分解	神經內衣管外之神經 ECM 的分解
B:  胰蛋白酶/EDTA (0.25%)	是	否
C:  胰蛋白酶/ACT/EDTA (0.25%)	是	最少
D:  ACT (0.25%)	最少	部分

圖3A至3B及圖4A至4B顯示了對照組與經處理的樣品之微觀結構的定量的長條圖。圖 3A 表示樣品神經組織的周長，其值 (μm) 以每 100000 μm的管周長表示，用於未經處理的樣品（對照組，最左側）、經胰蛋白酶/EDTA處理的樣品（中間）以及經胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理的樣品（最右側）。圖 3B 表示未經處理的樣品（對照組，最左側）、經胰蛋白酶/EDTA處理的樣品（中間）以及經胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理的樣品（最右側）之每 100000 µm 的管數。圖4A表示未經處理的樣品（對照組，最左側）、經胰蛋白酶/EDTA處理的樣品（中間）以及經胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理的樣品（最右側）的神經內衣管的面積百分比。圖 4B 顯示了未經處理的樣品（對照組，最左側）、經胰蛋白酶/EDTA處理的樣品（中間）以及經胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理的樣品（最右側）的總束面積，單位為 µm ²。

示例4：經分解的神經組織之蛋白質體學 評估如示例1中所述之經處理的分解樣品是否存在與周圍神經組織的神經再生活性相關的基底膜蛋白質，包括活性層連結蛋白鏈、IV型膠原蛋白鏈及巢蛋白。分析是藉由液相層析- 選擇反應監測 (LC-SRM) 實現，包括針對感興趣的 ECM 蛋白質的穩定同位素標記標準。

為了進行蛋白質體學分析，將經分解的神經樣品與未經處理的對照組樣品稱重至1 mg，並溶解於包含 NH ₂OH、KCO ₃及鹽酸胍的鹼性溶液至10 mg/mL。然後將樣品在加熱及攪拌下溫育 28 小時，獲得大多數樣品的澄清溶液。

將等體積的各樣品與已知濃度的ECM標準品混合，並用 0.25%之胰蛋白酶/ACT/EDTA進行蛋白水解分解。藉由LC-SRM ECM測定分析所得之肽。結果示於圖5A至5B（經處理的樣品=「經分解的 Avance」，未經處理的對照組=「 Avance 」）。與未經處理的神經組織相比，用胰蛋白酶/ACT/EDTA 處理周圍神經組織導致基底膜內之活性層連結蛋白鏈顯著減少。層連結蛋白鏈包括層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2及層連結蛋白γ-1 (圖5A)。此外，與未經處理的神經組織相比，經分解的樣品表現出膠原蛋白 IV鏈(膠原蛋白α-1(IV) 、膠原蛋白α-1/5(IV)、膠原蛋白α-2(IV)、膠原蛋白α-3(IV)、纖網蛋白、珍珠素及巢蛋白(巢蛋白-1及巢蛋白-2) (圖 5B)顯著減少。總體而言，與未經處理的神經組織相比，經分解的樣品中測試的蛋白質減少了10倍。

應當理解，雖然本公開已經藉由較佳實施方式、示例性實施方式與可選之特徵具體公開，但是本技術領域中具有通常知識者可以對本文公開的概念進行修改和變化，且這樣的修改和變化被認為是屬於所附申請專利範圍所限定之本公開的範圍。本文提供的具體實施方式和示例僅是非限制性和說明性的；對於本技術領域中具有通常知識者來說顯而易見的是，可以使用本說明書中闡述的裝置、裝置組件、方法步驟的大量變體來實施本公開。本技術領域中具有通常知識者將認識到，可用於本方法的方法和裝置可包括各種可選的組合物及處理元件與步驟。

下列圖式構成說明書的一部分，並被包括於內以進一步說明本發明的某些實施方式或各面向。在某些情況下，可以藉由參考圖式並結合本文所示之詳細描述來最佳地理解本發明的實施方式。描述和圖式可以突出本發明的某個特定示例或某個面向。然而，本技術領域中具有通常知識者將理解，示例或面向的部分可與本發明的其他示例或面向結合使用。

圖1是如示例2中描述的神經移植物樣品之神經元突生長測量的長條圖。 圖2A至2D是如示例3中描述的針對層連結蛋白染色之神經移植物樣品的顯微照片。 圖3A至3B是如示例3中描述的神經移植物樣品的定量測量(每100000μm的管周長；每100000μm的管數)的長條圖。 圖4A至4B是如示例3中描述的神經移植物樣品的定量測量(神經內衣管(endoneurial tubes)的面積百分比；以μm ²為單位的總束面積(total fascicle area))的長條圖。 圖5A至5B是描繪如示例4中描述之存在於經處理及未經處理的神經組織樣品中之基底膜結構蛋白的定量的長條圖。

Claims (49)

1. 一種製備組織移植物的方法，其特徵在於，包括： 用包含 (a) 胰蛋白酶及α-胰凝乳蛋白酶 (ACT)，或 (b) 胰蛋白酶、ACT 及乙二胺四乙酸 (EDTA) 的分解溶液處理組織，以從該組織中基本上去除一種或多種易感蛋白質。
2. 如請求項1記載的方法，其中，該分解溶液包含以下一種或多種： 約 3.5 x 10 ³USP 單位/mL 至約 4.5 x 10 ³USP 單位/mL 的胰蛋白酶； 約 50 USP 單位/mL 至約 55 USP 單位/mL的ACT；及 約 1.2 mM 至約 1.5 mM 的 EDTA。
3. 如請求項1記載的方法，其中該分解溶液還包含至少一種蛋白分解酶。
4. 如請求項1記載的方法，其中，該一種或多種易感蛋白質包括層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的至少一種或其組合。
5. 如請求項1記載的方法，其中經處理的該組織基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、巢蛋白-2中的一種或多種。
6. 如請求項1記載的方法，其中，經處理的該組織包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。
7. 如請求項1記載的方法，其中在約4°C至約40°C的溫度下用該分解溶液處理該組織。
8. 如請求項1記載的方法，其中用該分解溶液處理該組織約4小時至約24小時的時間段範圍。
9. 如請求項1記載的方法，進一步包括用pH範圍為約6.8至約7.5的緩衝溶液清洗經處理的該組織。
10. 如請求項9記載的方法，其中該緩衝溶液包括磷酸鹽緩衝液、鹽性陰極液、Tris緩衝液、二甲胂酸鹽緩衝液、索任生磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液或巴比妥緩衝液。
11. 如請求項9記載的方法，其中用該緩衝溶液清洗經處理的該組織兩次或更多次。
12. 如請求項9記載的方法，其中用該緩衝溶液在(a)約4 °C至約40 °C的溫度範圍、或(b)約1分鐘至約4小時的時間段範圍的至少一種清洗經處理的該組織。
13. 如請求項1記載的方法，進一步包括用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗經處理的該組織，其中該血清為胎牛血清、兔血清、山羊血清、馬血清、綿羊血清、豬血清或雞血清。
14. 如請求項13記載的方法，其中用該血清清洗經處理的該組織兩次或更多次。
15. 如請求項13記載的方法，其中用該血清在(a)約4 °C至約40 °C的溫度範圍、或(b)約30分鐘至約8小時的時間段範圍的至少一種清洗經處理的該組織。
16. 如請求項1記載的方法，進一步包括使經處理的該組織與鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣及/或醣蛋白接觸，其中該緩衝溶液、該血清或該緩衝溶液及該血清兩者可選地包含鈣通道阻斷劑、細胞外鈣 、醣胺聚醣及/或醣蛋白。
17. 如請求項16記載的方法，其中該組織移植物包含鈣通道阻斷劑，且其中該鈣通道阻斷劑包含鈷Co ²⁺、錳Mn ²⁺、鑭La ³⁺或尼群地平中的一種或多種。
18. 如請求項16記載的方法，其中該組織移植物包含醣胺聚醣，且其中該醣胺聚醣包含角蛋白硫酸鹽或軟骨素硫酸鹽中的一種或多種。
19. 如請求項16記載的方法，其中該組織移植物包含醣蛋白，且其中該醣蛋白包含一種或多種髓磷脂相關之醣蛋白。
20. 如請求項1記載的方法，其中該組織移植物具有以下至少一者的尺寸： 長度約3 mm至約100 mm，或 直徑約1 mm至約10 mm。
21. 如請求項1記載的方法，其中該組織移植物限定總體積的範圍為約5 mm ³至約55000 mm ³。
22. 如請求項1記載的方法，其中經處理的該組織藉由冷凍乾燥處理、由經處理的該組織形成糊狀物或由經處理的該組織形成凝膠中的至少一種來進一步處理。
23. 如請求項1記載的方法，其中該組織為哺乳動物組織，例如人類組織、非人靈長類動物組織、囓齒動物組織、馬組織、犬組織、兔組織、豬組織或羊組織。
24. 如請求項1記載的方法，其中該組織為合成組織或非哺乳動物組織，例如魚類組織、兩棲動物組織、昆蟲組織或植物組織。
25. 如請求項1記載的方法，其中該組織為神經組織，例如周圍神經組織或中樞神經系統組織、上皮組織、結締組織、肌肉組織、微血管組織、真皮組織、骨骼組織、平滑肌組織、心臟組織、或脂肪組織中的至少一種。
26. 一種根據請求項1的方法製備的組織移植物。
27. 如請求項26記載的組織移植物，其中該組織移植物基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種。
28. 一種組織移植物，其特徵在於， 其中該組織移植物基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種，且 其中該組織移植物包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。
29. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種。
30. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物包含至少 0.1 nmol/g的膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。
31. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物包含鈣通道阻斷劑、細胞外鈣、醣胺聚醣及/或醣蛋白中的一種或多種。
32. 如請求項31記載的組織移植物，其中該組織移植物包含鈣通道阻斷劑，且該鈣通道阻斷劑包含鈷Co2+、錳Mn2+、鑭La3+或尼群地平中的一種或多種。
33. 如請求項31記載的組織移植物，其中該組織移植物包含醣胺聚醣，且其中該醣胺聚醣包含角蛋白硫酸鹽或軟骨素硫酸鹽中的一種或多種。
34. 如請求項31記載的組織移植物，其中該組織移植物包含醣蛋白，且其中該醣蛋白包含一種或多種髓磷脂相關之醣蛋白。
35. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物具有以下至少一者的尺寸： 長度約3 mm至約100 mm，或 直徑約1 mm至約10 mm。
36. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物限定總體積的範圍為約5 mm ³至約55000 mm ³。
37. 如請求項28記載的組織移植物，其中該組織移植物為神經移植物。
38. 一種製備組織移植物的套組，其特徵在於，包括： 組織； 胰蛋白酶；以及 α-胰凝乳蛋白酶 (ACT)。
39. 如請求項38記載的套組，進一步包含乙二胺四乙酸(EDTA)。
40. 如請求項38記載的套組，其中該套組包括包含該胰蛋白酶與該EDTA的第一容器以及包含該ACT的第二容器。
41. 如請求項38記載的套組，進一步包括緩衝溶液。
42. 如請求項41記載的套組，其中該緩衝溶液包括磷酸鹽緩衝液、鹽性陰極液、Tris緩衝液、二甲胂酸鹽緩衝液、索任生磷酸鹽緩衝液、磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液或巴比妥緩衝液。
43. 如請求項38記載的套組，進一步包括包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清，其中該血清為胎牛血清、兔血清、山羊血清、馬血清、綿羊血清、豬血清或雞血清。
44. 如請求項38記載的套組，進一步包括製備包含該胰蛋白酶及該ACT的分解溶液或包含該胰蛋白酶、該ACT及該乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液的說明。
45. 如請求項44記載的套組，進一步包括用該分解溶液處理該組織的說明。
46. 如請求項38記載的套組，其中該組織為合成組織；或哺乳動物組織，例如人類組織、非人靈長類動物組織、囓齒動物組織、馬組織、犬組織、兔組織、豬組織或羊組織；或非哺乳動物組織，例如魚類組織、兩棲動物組織、昆蟲組織或植物組織。
47. 如請求項38記載的套組，其中該組織為神經組織，例如周圍神經組織或中樞神經系統組織、上皮組織、結締組織、肌肉組織、微血管組織、真皮組織、骨骼組織、平滑肌組織、心臟組織、或脂肪組織中的一種。
48. 一種製備組織移植物的方法，其特徵在於，包括： 用包含胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶 (ACT)及乙二胺四乙酸(EDTA)的分解溶液處理組織； 用緩衝溶液清洗經處理的該組織一次或多次； 以及 用該緩衝溶液清洗後，用包含α-抗胰蛋白酶及α-2-巨球蛋白的血清清洗經處理的該組織一次或多次； 其中經處理的該組織基本上不包含層連結蛋白α-1、層連結蛋白α-2、層連結蛋白α-4、層連結蛋白α-5、層連結蛋白β-1、層連結蛋白β-2、層連結蛋白γ-1、膠原蛋白IVα-1(IV) 鏈、膠原蛋白 IVα-1/5(IV)鏈、膠原蛋白αIV-2鏈、膠原蛋白αIV-3鏈、纖網蛋白1(III 型 4、7 結構域)、珍珠素、巢蛋白-1、 巢蛋白-2中的一種或多種，且 其中經處理的該組織包含膠原蛋白Iα-1鏈、膠原蛋白α-2(I) 鏈、膠原蛋白α-3(VI) 鏈、基膜聚醣、膠原蛋白α-1(VI)鏈、膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈、皮連蛋白、膠原蛋白α-1(III) 鏈、膠原蛋白α-3(V) 鏈、角蛋白、II型細胞骨架1、小纖維蛋白-1、核心蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(XVI) 鏈、玻璃黏連蛋白、膠原蛋白α-1(XXXI)鏈、髓磷脂蛋白P0、膠原蛋白α-2(VI)鏈、膠原蛋白α-1(VIII)鏈、膠原蛋白α-1(V)鏈、無孢蛋白聚醣、prolargin、雙醣鏈蛋白聚醣、膠原蛋白α-1(II)鏈、髓磷脂P2蛋白、骨膜素、膠原蛋白α-1(XIV)鏈、α-水晶體蛋白B鏈或膠原蛋白α-1(XII)鏈中的一種或多種。
49. 如請求項48記載的方法，其中該組織為神經組織。

Images