KR102472314B1

KR102472314B1 - 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 최적 추출방법

Info

Publication number: KR102472314B1
Application number: KR1020200082361A
Authority: KR
Inventors: 전소영; 권태균; 김범수; 이준녕; 하윤석
Original assignee: 경북대학교병원
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-11-30
Also published as: KR20220004477A

Abstract

본 발명은 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질을 추출하는 방법으로, (a) 인체로부터 분리된 신장주변 지방조직을 세절하는 단계; (b) 상기 세절된 신장주변 지방조직을 건조시키는 단계; (c) 상기 건조된 신장주변 지방조직을 탈지질시키는 단계; 및 (d) 상기 탈지질된 신장주변 지방조직을 탈세포화시키는 단계를 포함하는 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 최적 추출방법에 관한 것이다.

Description

인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 최적 추출방법{THE OPTIMAL EXTRACTION METHOD FOR EXTRACELLULAR MATRIX IN HUMAN-DERIVED PERIRENAL ADIPOSE TISSUE}

본 발명은 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 최적 추출방법에 관한 것이다.

세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌 등이 포함되어 있는 생체 적합적인 고분자 물질로 상해 조직 또는 기관을 재생하는데 필요하다. 그동안 인체 유래 세포외기질은 주로 지방 흡입술로 얻은 피하 지방조직에서 추출하였다. 신장주변 지방조직은 신장을 감싸고 있는 내장 지방조직의 한 종류로, 최근 신장이식 건수가 증가함에 따라 이식 후 다량 얻어지고 있으나 의료 폐기물로 간주되어 전량 소각되고 있다. 현재까지 신장주변 지방조직을 인체 유래 세포외기질 공급원으로 사용하는 것에 대한 보고는 없었다.

본 발명은 신장주변 지방조직을 새로운 인체 유래 세포외기질 공급원으로 활용하고자 한다. 인체 유래 신장주변 지방조직이 지닌 장점은 1) 동종 조직이므로 이식 시 생체 적합성과 안전성이 높고, 2) 한번에 얻을 수 있는 조직 양이 피하지방과 유사할 정도로 충분하며, 3) 조직 내에 지방세포, 섬유아세포, 줄기세포, 염증세포, 면역세포, 내피세포, 신경세포 등 여러 종류의 세포가 있어 이들 세포가 분비하는 다양한 종류의 세포외기질이 포함되어 있다.

본 발명은 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질을 추출하기 위한 최적 방법을 확립한 것으로, 세포외기질을 추출하는 방법으로, (a) 인체로부터 분리된 신장주변 지방조직을 세절(細切)하는 단계; (b) 상기 세절된 신장주변 지방조직을 건조시키는 단계; (c) 상기 건조된 신장주변 지방조직을 탈지질시키는 단계; 및 (d) 상기 탈지질된 신장주변 지방조직을 탈세포화시키는 단계를 포함하는 신장주변 지방조직으로부터 추출된 세포외기질의 최적 추출방법 등을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 (a) 인체로부터 분리된 신장주변 지방조직을 세절하는 단계; (b) 상기 세절된 신장주변 지방조직을 건조시키는 단계; (c) 상기 건조된 신장주변 지방조직을 탈지질시키는 단계; 및 (d) 상기 탈지질된 신장주변 지방조직을 탈세포화시키는 단계를 포함하는 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 추출방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 세절된 신장주변 지방조직 내 콜라겐의 농도, 피브로넥틴의 농도 및 라미닌의 농도는 각각 2 μg/mL 이상, 0.15 μg/mL 이상 및 0.12 pg/mL 이상일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 건조는 0.4 m/sec 내지 1.0 m/sec의 풍속 조건으로 설정된 흄후드 하에 10시간 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.

상기 (c) 단계에서 탈지질은 아세톤, 에테르 및 에테르/메탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탈지질용매를 사용하여 수행되고, 이에 따라, 상기 탈지질 효율은 50% 이상이고, 상기 추출된 세포외기질 내 콜라겐의 농도는 20 μg/g 이상일 수 있다.

상기 (c) 단계에서 탈지질은 20분 내지 60분 동안 수행될 수 있다.

상기 (d) 단계에서 탈세포화는 화학적 처리를 통해 수행될 수 있다.

상기 화학적 처리는 0.1-10% Triton X-100 용액을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 추출된 세포외기질을 제공한다.

본 발명에 따르면, 세절 단계, 건조 단계, 탈지질 단계 및 탈세포화 단계를 통해 인체유래 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질을 최적 조건으로 추출할 수 있어, 최종 추출된 세포외기질에는 세포 성분 및 지질의 잔류 없이, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 및 점액다당류 (Glycosaminoglycan, GAG) 등은 잘 보존되는 이점이 있다.

특히, 탈지질 단계에서 최적 탈지질 용매(바람직하게, 아세톤)를 사용함으로써, 탈지질 효율을 높이고, 최종 세포외기질 중 특히 콜라겐을 높은 농도로 잘 보존할 수 있으며, 최종 세포외기질은 다공성(기공 크기, 50-200 μm)을 지닌 3차원 구조를 가질 뿐만 아니라, 높은 세포 생존율과 증식율을 유지할 수 있다.

도 1은 인체 신장주변 지방조직에서 세포외기질 추출 방법의 개념을 나타낸 것으로, 추출 공정은 각각 단계에서 결과를 비교하고 선택함으로써 최적화되었다: 세포외기질 추출 양을 증가시키기 위한 조직의 세절, 지질을 완전하게 제거 하기 위한 조직의 건조, 최적 탈지질 용매 선정을 위한 12가지 용매 비교, 적절한 탈지질 시간을 결정하기 위한 시간에 따른 탈지질 효율 측정, 최적 탈세포화를 선택하기 위한 3가지 방법의 비교, 및 상기 방법을 통해 제조된 세포외기질의 물리적 및 생화학적 특성.
도 2는 조직 세절 효과를 나타낸 것이다: (a) 공정의 대표적인 이미지로서, 인체 신장주변 지방조직을 2개로 나눈 다음, 세절 또는 덩어리로 절단하였고, 아세톤으로 탈지질하였고, Triton X-100으로 탈세포화하고, 후드에서 공기 건조하였고, 알칼리를 이용하여 세포외기질 단백질을 추출함, (b) 최종 추출된 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌의 정량적 비교를 위한 효소면역측정(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). 세절된 조직; 덩어리로 절단된 조직(*, p<0.05; **, p<0.01).
도 3은 조직 건조 효과를 나타낸 것이다: 건조 또는 습윤 인체 신장주변 지방조직을 아세톤으로 탈지질하는 동안 (a) 조직의 형태적 변화 이미지 및 (b) 조직내 잔류 지질 검출을 위한 오일 레드 O 염색.
도 4는 최적 탈지질 용매를 선정하기 위해 용매 별 탈지질 효율과 세포외기질 보존을 나타낸 것이다: (a) 각각 탈지질 용매에 처리된 인체 신장주변 지방조직의 이미지, (b) 탈지질 후 탈수된 지방조직, (c) 각각 탈지질 용매 처리에 따른 탈지질-탈수 효율, (d) 탈지질된 지방조직의 잔류 지질 검출을 위한 오일 레드 O 염색, (e) 보존된 콜라겐 I형(Col1), 라미닌 및 GAG 검출을 위한 면역조직화학 염색, (f) 세포 제거 및 세포외기질 보존을 확인 하기 위한 헤마톡실린 및 에오신 염색(Hematoxylin-Eosin　staining. H&E), (g) 보존된 콜라겐(화살표) 식별을 위한 매슨　삼색염색 (Masson　trichrome stain), (h) 효소면역측정법을 이용한 콜라겐의 정량과 추출된 세포외기질 용액 이미지, (i) 잔존한 세포외기질의 네트워크 구조 및 기공 크기를 평가하기 위한 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM), (Hitachi S 4800 FE SEM; Hitachi, Tokyo, Japan) 이미지(× 1,000, 스케일 바, 10 μm), (j) 각 세포외기질과 공배양된 세포 형태 비교를 위한 도립현미경(라이카 DMIL, Tokyo, Japan) 이미지(x40), (k) 각 세포외기질과 공배양된 세포의 생존율 및 증식율의 분석을 위한 3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetra zolium bromide (MTT)　분석.
도 5는 건조된 인체 신장주변 지방조직의 시간에 따른 지질 제거율을 나타낸 것이다: (a) 5분 간격으로 60분간 추출된 지질, (B) 추출된 지질을 정량 (Lipid Assay Kit, Abcam, Cambridge, MA, USA)하여 시간에 따른 지질 제거율을 산정. Ctrl(+), 조직에서 삼출된 지질; Ctrl(-), 순수 아세톤.
도 6는 3가지 다른 탈세포화 방법의 비교를 나타낸 것이다: (a) 물리적(동결/해동), 화학적(Triton X-100) 및 효소적(트립신) 처리된 신장주변 지방조직의 이미지, (b) 잔류 세포 성분(화살표) 검출을 위한 H&E 염색, (C) 잔류 핵(화살표) 검출을 위한 DAPI 염색. H&E, 헤마톡실린 및 에오신; DAPI, 4', 6-다이아미디노-2-페닐인돌 다이하이드로클로라이드; 스케일 바, 50 μm.
도 7은 최적 방법에 따라 제조된 세포외기질의 물리적 및 생화학적 특성을 나타낸 것이다: (a) 동결-건조된 연질 다공성 스펀지 형태의 세포외기질, (b) 20-200 μm 기공 크기를 가진 다공성 네트워크 구조를 가진 세포외기질의 SEM 이미지(배율, x500; 스케일 바, 100 μm), (c) 완전한 탈지질을 보여주는 오일 레드 O 염색, (d) 보존된 콜라겐(화살표) 식별을 위한 매슨 삼색염색, (e) 보존된 Col1, Col4 및 GAG의 식별을 위한 면역조직화학적 염색, (f) MTT 방법을 이용한 세포 성장율 분석. 데이터는 평균±표준 편차로 표시됨, (g) 대조군 및 실험군에서 배양된 세포의 형태적 비교 (3일차). SEM, 주사 전자 현미경; Col, 콜라겐; GAG, 글라이코사미노글라이칸; 대조군, 무처치군; 세포외기질, 최적 방법에 따라 제조된 세포외기질 처리군; 스케일 바, 50 μm; 광학 현미경 이미지 확대 배율, 200x.

인체 신장주변 지방조직은 건강한 신장 기증자에서 분리되며 세포외기질과 같은 유용한 기질을 포함하지만, 그 가치가 인식되지 못하여 그동안 신장 이식 후 전량 폐기되었다. 본 발명자들은 신장주변 지방조직을 인체 유래 세포외기질을 획득 할 수 있는 조직원으로 활용하고자 추출 공정을 최적화하였다. 세포외기질 추출에 대한 이러한 기술의 유효성을 검증하기 위해, 본 발명자들은 여러 단계로 제품을 비교하였다.

신장주변 지방조직의 표면적을 넓혀 용매와의 반응율을 증가시킬 수 있는 세절 효과를 검증하기 위해, 세절된 조직과 덩어리로 준비된 조직에서 추출된 세포외기질의 양을 비교 하였다. 빠르고 완전한 탈지질을 위한 조직 건조 효과를 검증하기 위해, 건조 또는 젖은 상태의 조직을 비교하였고, 잔류 지질을 오일-레드-O 염색으로 시각화하였다. 최적 탈지질 용매 선정을 위해 12종의 용매를 시험 하였고, 추출된 세포외기질의 종류와 양을 비교 하였다. 적절한 탈지질 시간을 선정하기 위해 추출된 지질 농도를 각각 시점에서 회수하여 정량화하였다. 최적 탈세포화 방법을 선택하기 위해, 조직을 물리적, 화학적 또는 효소적 방법으로 처리하였고, 세포 성분의 잔류 유무를 확인하였다. 이후 상기 최적화된 방법으로 추출된 세포외기질의 물리적 및 생화학적 특성을 분석 하였다.

조직을 세절하여 세포외기질을 추출하는 방법은 덩어리로 처리하는 방법에 비해 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴의 양이 유의적으로 증가되었음을 보여주었다. 건조 조직은 습윤 조직에 비해 빠르고 완전한 지질 제거를 보여주었다. 최적 탈지질 용매를 선정하기 위해 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 에테르, 에탄올, 이소프로판올, 물, 클로로포름/메탄올, 에탄올/헵탄, 에테르/메탄올, 헥산/에탄올 및 부탄올/메탄올 용매의 탈지질 효율을 평가 한 결과, 아세톤을 처리된 조직이 단위 시간 당 탈지질 효율이 가장 높았고 보존된 세포외기질 양이 가장 많았다. 건조된 지방조직 2 g에 아세톤 1 mL에 넣고 용매를 5분 마다 교환하였을 때, 완전한 탈지질에 걸리는 시간은 45 분 이였다. 최적 탈세포 방법은 비용과 효율면에서 1% Triton X-100을 이용한 화학적 방법을 선정하였다. 상기 선정된 최적 방법에 따라 제조된 세포외기질의 물리적 및 생화학적 분석 결과, 동결건조된 최종산물은 다공성을 지닌 스펀지 형으로, 잔류하는 세포 성분 또는 지질은 없었고, 세포외기질이 잘 보존 되었으며, 세포 생존율 및 증식율이 높아 세포친화적임을 밝혔다.

따라서, 조직의 세절, 건조, 아세톤을 이용한 탈지질, 45 분 간의 처리, 및 Triton X-100을 이용한 탈세포로 확립된 공정은 인체 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질 추출을 위한 최적 방법일 수 있다. 이러한 기술을 사용하면 신장주변 지방조직은 조직재생에 유용한 인체 유래 세포외기질 공급원이 될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 최적 추출방법

먼저, 본 발명에 따른 추출방법은 인체로부터 분리된 신장주변 지방조직을 세절하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

상기 지방조직은 인체 신장주변(perirenal) 지방조직일 수 있는데, 신장 이식 수술을 받는 과정에서 외과적으로 절제되어 폐기되는 것을 사용할 수 있다. 이러한 신장주변 지방조직은 내장 지방조직의 한 종류로, 종래 세포외기질 공급원으로 사용되던 피하 지방조직과 비교하여, Col1a1을 제외한 다른 세포외기질(예를 들어, Col4a1, 라미닌c1, 피브로넥틴1)이 오히려 더 많은 것을 특징으로 한다.

상기 세절된 신장주변 지방조직은 균질분획기를 통해 세절된 상태로서, 상기 세절된 신장주변 지방조직 내 콜라겐의 농도, 피브로넥틴의 농도 및 라미닌의 농도는 각각 2 μg/mL 이상(바람직하게, 3 μg/mL 내지 5 μg/mL), 0.15 μg/mL 이상(바람직하게, 0.15 μg/mL 내지 0.2 μg/mL) 및 0.12 pg/mL 이상(바람직하게, 0.12 pg/mL 내지 0.15 pg/mL)일 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 추출방법은 상기 세절된 신장주변 지방조직을 건조시키는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

상기 건조는 0.4 m/sec 내지 1.0 m/sec의 풍속 조건으로 설정된 흄후드 하에 10시간 내지 50시간 동안 수행될 수 있는데, 이러한 탈지질 전 건조 단계를 통해, 후술하는 탈지질 효율을 높일 수 있는 이점을 가진다.

다음으로, 본 발명에 따른 추출방법은 상기 건조된 신장주변 지방조직을 탈지질시키는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

상기 탈지질은 다양한 탈지질 용매를 사용하여 수행될 수 있는데, 인체 지방조직을 구성하는 지질은 에너지 저장과 세포막을 구성하는 비극성 지질로 구성되어 있으므로, 탈지질 용매로 비극성 용매 단독 및 비극성 기반 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 탈지질은 아세톤, 에테르 및 에테르/메탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탈지질 용매를 사용하여 수행될 수 있고, 특히, 아세톤을 사용하여 수행되는 것이 가장 바람직하다. 이에 따라, 상기 탈지질 효율은 50% 이상(바람직하게, 80% 이상)이고, 상기 추출된 세포외기질 내 콜라겐의 농도는 20 μg/g 이상(바람직하게, 40 μg/g 내지 50 μg/g)일 수 있다. 또한, 상기 추출된 세포외기질은 동결건조 시 다공성(기공 크기, 50-200 μm) 3차원 구조를 가질 뿐만 아니라, 높은 세포생존율 및 세포 증식율을 가질 수 있다.

상기 탈지질은 상기 건조된 신장주변 지방조직 2 g을 기준으로, 탈지질 용매 0.1 mL 내지 10 mL(바람직하게, 0.5 mL 내지 5 mL)을 첨가하고, 탈지질 용매를 1 분 내지 10분 마다 교환하는 조건에서 수행될 수 있고, 상기 탈지질은 20분 내지 60분 동안 수행될 수 있고, 특히, 45분 내지 60분 동안 수행됨으로써, 지질은 완전히 제거 될 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 추출방법은 상기 탈지질된 신장주변 지방조직을 탈세포화시키는 단계[(d) 단계]를 포함한다.

상기 탈세포화는 물리적, 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수행될 수 있지만, 물리적 처리로 냉동-해동을 번갈아 하는 방법은 지방조직의 탈세포 효율이 낮았으며, 효소적 처리인 경우 탈세포 효율은 높으나 다량의 조직을 처리할 경우 효소가 고가인 점을 감안하면, 화학적 처리를 통해 수행되는 것이 가장 바람직하다. 이때, 상기 화학적 처리를 위해 비이온성 세제를 사용할 수 있는데, 0.1-10% Triton X-100 용액을 사용함으로써, DNA-단백질, 지질-단백질 및 지질-지질 상호 작용을 방해하여 세포성분 제거를 촉진하는 반면, 단백질-단백질 상호 작용은 보존하여 세포외기질은 보존 하게하는 이점을 가진다.

신장주변 지방조직으로부터 추출된 세포외기질

또한, 본 발명은 인체 유래 신장주변 지방조직으로부터 추출된 세포외기질을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 세포외기질을 추출하기 위한 공급원으로 사용되는 지방조직은 인체 신장주변(perirenal) 지방조직일 수 있는데, 신장 이식 수술을 받는 과정에서 외과적으로 절제되어 폐기되는 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포외기질은 상기 추출방법에 따라 추출될 수 있는데, 구체적인 추출방법에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.

이에 따라, 본 발명에 따른 세포외기질은 세포 성분 및 지질 잔류 없이, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 및 점액다당류 (Glycosaminoglycan, GAG) 등을 높은 농도로 보존할 수 있는 이점이 있다. 특히, 본 발명에 따른 세포외기질은 콜라겐을 높은 농도로 추출할 수 있는데, 상기 세포외기질 내 콜라겐의 농도는 20 μg/g 이상일 수 있고, 40 μg/g 내지 50 μg/g 인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 세포외기질은 동결건조 시 다공성(기공 크기, 50-200 μm)을 지닌 3차원 구조를 가질 뿐만 아니라, 높은 세포생존율 및 세포 증식율을 가지고 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시계는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인체 신장주변(perirenal) 지방조직의 준비

경북대학교병원 임상연구 윤리 심의위원회의 승인(IRB# KNUCH 2018-08-008-003)을 얻은 후, 경북대학교병원에서 신장 기증을 위해 적출술을 받은 20~40세 건강한 사람으로부터 인체 신장주변 지방조직을 얻었다. 일반적인 수술 절차로는 본 발명에 사용된 신장주변 지방조직은 전량 폐기된다. 조직 적출 후 멸균 인산염 완충 식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)가 든 무균 용기에 담아 얼음위에 둔채로 1 시간 이내에 실험실로 전달하였고, 액체 질소 내에서 급속-냉동(flash-frozen)하여 조직의 자가분해를 억제하였으며, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 2: 인체 신장주변 지방조직으로부터 세포외기질 추출의 최적화

<2-1> 조직 세절 효과의 비교: 세절 vs 덩어리

초기 조직 입자 크기에 따른 추출된 세포외기질의 양을 비교하기 위해, 세절 및 덩어리 조직을 준비하였다. 세절 조직 준비를 위해 조직 100g에 증류수(MilliQ-UV Plus, Millipore, Billerica, MA, USA) 500 mL을 넣고, 균질세절기(Omni Tip ™Homogenizing Kit, Omni International, Kennesaw, GA, USA)를 35000 rpm으로 30 초 동안 반복적으로 처리 하였다. 다음, 4℃로 세팅된 원심분리기를 이용하여 1200 rpm으로 15 분간 원심 분리하였고, 상층을 수집하였다. 덩어리 조직 준비를 위해 조직 100g을 메스를 이용하여 손으로 1×1×1 cm³ 크기로 잘랐다. 조직을 원추형 튜브에 넣고, 아세톤을 넣어 (용매 대 조직 비, 5:1; 최종 부피, 50 mL), 1 시간 동안 300 rpm으로 교반하여 지질을 제거하였으며 이 과정은 흄후드 (0.4 m/sec 이상의 풍속 조건)에서 실시하였다. 아세톤은 5 분마다 교환하였다. 교반 후, 아세톤을 증발시켰고, 탈지질된 조직을 증류수로 5회 세척한 다음, 1% Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액으로 4℃에서 5일 동안 탈세포화시켰으며, 6 시간 마다 용매를 교환하였다. 세포가 제거된 조직을 증류수로 5 회 세척하였고 24 시간 동안 흄후드에서 건조시켰다. 건조된 조직(1.0 g)을 80℃로 유지된 10 N NaOH(Sigma-Aldrich) 1 mL에 24 시간 동안 침지 하였고, 4 시간 마다 NaOH 용액을 교환하였다. 수집된 알칼리 용액을 염산(12N, Sigma-Aldrich)으로 pH 7.0으로 중화시켰다. 콜라겐 정량화에는 서콜산(Sircol acid)/펩신-가용성 콜라겐 분석 키트(Koma Biotech, Inc., Seoul, Korea)를 사용하였다. 라미닌 및 피브로넥틴은 ELISA 분석 키트(Koma Biotech, Inc.)를 통해 정량화하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 모든 분석을 수행하였다.

도 2(a)에 나타난 바와 같이, 인체 신장주변 지방조직의 원래 형태는 지방 및 혈관을 보이는 황색 덩어리였다. 세절군은 세절 후 위로 지방층이 뜨고 아래는 작게 갈린 조직이 보였으며, 덩어리군은 혈관 및 평활근이 잘린 단면에 보였다. 아세톤을 처리하면 지질이 조직으로부터 녹아 나와 아세톤 색상이 투명한 색에서 점차 노란색으로 변하였다. 1% Triton X-100으로 탈세포화 된 조직은 회백색을 나타내었다. 탈수 후 잔존 조직의 중량은 원래 조직의 약 10%로 감소 하였다. 알칼리로 녹인 용액은 세절군이 덩어리 군에 비해 진한 갈색을 보였다. 도 2(b)에 나타난 바와 같이, 용액에서 세포외기질 함량을 비교할 때, 콜라겐은 덩어리 군(1.45 ± 0.19 μg/mL)에 비해 세절군(3.70 ± 0.36 μg/mL)에서 유의적으로 높았다(p<0.01). 피브로넥틴 및 라미닌의 양 역시 덩어리 군(각각, 0.126 ± 0.019 ㎍/mL, 0.113 ± 0.004 pg/mL)에 비해 세절군(각각, 0.18 ± 0.03 μg/mL, 0.127 ± 0.007 pg/mL)에서 높았다.

<2-2> 조직 건조 효과의 비교: 건조 vs 습윤 조직

지질을 효과적으로 제거하기 위한 조직의 건조 효과를 평가하기 위해, 건조 및 습윤 상태의 조직(각 2g)을 비교하였다. 건조 조직 군을 위해, 조직을 절단한 다음(5x5x1 mm³), 페트리 디쉬 위에 두고 24 시간 동안 흄후드에서 공기 건조시켰고, 건조 동안, 삼출된 지질을 제거하였다. 습윤 조직 군은 조직을 1 분 동안 페이퍼 타월에 두어 과도한 물을 제거하고 사용하였다. 각 조직을 원추형 튜브에 넣고 탈지질을 위해 아세톤을 첨가하여 최종 부피 50 mL로 맞추고, 흄후드 하에서 100 rpm 속도로 교반 하였다. 조직을 5 분마다 하나씩 꺼내고 공기 건조시켰다. 각 시점에서 사진을 촬영한 후, 샘플을 동결절편으로 만들어, 3 분 동안 오일 레드 O 용액(Abcam)으로 처리하였고, 증류수로 세척하고 커버 글라스를 덮어 잔존 지질을 비교 하였다.

탈지질 효율을 높이기 위해, 본 발명자들은 탈지질 단계 이전에서 조직 건조 효과를 분석하였다. 도 3(a)에 나타난 바와 같이, 공기 건조 24 시간 후, 지방조직은 불투명 노란 조직상에서 반투명 갈색으로 변하였다. 아세톤으로 탈지질을 실시 하였을 때, 건조 조직은 15 분 차에서 뚜렷하게 흰색 스펀지형으로 변하였다. 습윤 조직은 물렁한 연한 황색 조직상에서 아세톤 처리에 의해 딱딱한 적황색 조직상으로 변하였고, 30 분 경과 후 색상이 점차 옅은 빨간색으로 변하고 단단함이 증가하였다. 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 오일 레드 O 염색에서, 건조 조직은 0 분에서 이미 지질이 삼출되어 조직내 지질양이 유의적으로 감소된 반면, 습윤조직은 지질 방울이 다량 함유된 전형적인 지방 세포의 조직학적 상을 보여주었다. 건조 조직 군의 지질은 15 분 처리로 70% 이상 제거되는 반면, 습윤 조직 군은 60 분 처리 후에도 잔류 지질을 보였다.

<2-3> 탈지질 용매의 비교

지방조직 5 g을 탈지질 용매 50 mL를 함유하는 원뿔형 튜브에 담았고, 지질을 제거하기 위한 용매 대 조직 비는 10:1이었다. 준비된 용매는 클로로포름, 메탄올, 에테르, 아세톤, 에탄올, 이소프로판올, 클로로포름/메탄올(C/M), 에탄올/헵탄(E/H), 에테르/메탄올(E/M), 헥산/에탄올(H/E), 부탄올/메탄올(B/M)(v/v%, Sigma-Aldrich), 및 물(대조군)이었다. 조직/용매 혼합물을 4℃에서 300 rpm 으로 24 시간 동안 교반시켰고, 용매를 3 시간마다 교환하였다.

각각의 용매에 의한 탈지질 정도를 확인하기 위해, 조직을 OCT compond로 동결시키고 냉동조직 절편기(Leica, Lakewood Ranch, FL, USA)를 사용하여 8 μm 두께로 절단하였고, 3 분 동안 오일 레드 O 용액으로 염색한 다음, 커버슬립으로 눌렀다. 오일 레드 O 염색을 통해 잔류 지질을 빨간색으로 가시화하였다.

도 4(a)에 나타난 바와 같이, 탈지질 공정 동안, 용매의 색은 지방 삼출으로 인해 투명한 색에서 노란색으로 변하였고, 물-처리된 군은 적혈구 파열로 붉은 색을 나타내었다. 조직의 색은 메탄올, 에탄올, C/M, E/M, H/E 및 B/M 처리군은 황색에서 점차 희미한 노란색이 되었고, 클로로포름, 에테르 및 아세톤으로 처리된 조직은 약간 붉게 변하였으며, 물로 처리된 조직은 지방 덩어리의 원래색인 황색을 유지하였다.

그 다음, 탈지질된 조직을 흄후드에서 24 시간 동안 건조시켰다. 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 메탄올-, 에탄올-, C/M-, E/M- 및 B/M- 으로 처리된 조직은 희미한 황색을 나타내었다. 클로로포름-, 에테르-, 아세톤-, 이소프로판올-, E/H- 및 H/E- 처리된 조직은 주황-빨간색을 나타내었다. 물-처리된 조직은 노란색이고 윤택을 보였다.

제거된 지질 및 수분의 정량화를 위해, 탈지질/탈수된 조직의 중량을 측정하였다. 측정 값을 각각 신선한 조직의 중량에서 빼고, 제거 효율을 백분율로 표시하였다. 도 4(c)에 나타난 바와 같이, 제거 효율은 아세톤-처리된 조직에서 가장 높았고(93.05%), 다음으로, C/M(92.17%), E/M(91.89%), 이소프로판올(90.67%), 에테르 (89.84%), 클로로포름(82.05%), H/E(68.14%), E/H(65.17%), 및 B/M(53.99%)으로 처리된 조직이였다. 물-처리된 조직은 47.21% 제거 효율을 보였고, 에탄올- 및 메탄올-처리 조직은 각각 44.19% 및 43.85% 제거 효율을 보였으며, 이 값들은 유의적으로 낮았다(P <0.05).

잔류하는 지질을 오일 레드 O 염색으로 가시화하였다. 도 4(d)에 나타난 바와 같이, 메탄올-, 에탄올-, 물-, E/H-, H/E-, 및 B/M- 처리된 조직은 빨간색 양성 염색을 보여 다량의 지질이 조직에 남아 있음을 보여 주었고, 반면, 아세톤-, 클로로포름-, 에테르-, 이소프로판올-, C/M- 및 E/M- 처리된 조직은 음성으로 완전한 탈지질을 보여주었다.

세포외기질 성분중 조직재생에 필요한 Col1, 라미닌 및 GAG의 보존을 확인하기 위해 면역조직화학 염색을 수행하였다(Abcam, 1:100). 각 용매로 탈지질된 조직을 24 시간 동안 파라핀에 침지하고, 5 μm로 잘린 단편을 1차 항체로 4 ℃에서 24시간 처리하였고, 2차 항체(Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA)로 실온에서 1 시간 동안 처리한 다음, 핵을 DAPI로 대조 염색하였다.

탈지질 후, 면역조직화학 염색을 통해 세포외기질 성분중 Col1, 라미닌 및 GAG가 보존되어 있음을 확인하였다. 도 4(e)에 나타난 바와 같이, 보존된 Col1의 양은 대부분의 군에서 유사했으며, 분포 또한 균일하였다. 보존된 라미닌의 양은 Col1의 양에 비해 상대적으로 적었고, 특히, 클로로포름- 및 이소프로판올-처리된 조직은 상대적으로 더 낮은 보존을 보였다. 또한, GAG는 물-처리된 군을 제외한 모든 군에서 보존된 것으로 나타났다.

완전한 탈세포화를 확인하기 위해, Triton X-100 용액으로 처리한 후 H&E 염색을 수행하였다. 조직의 일부(1×1×1 mm³)를 24 시간 동안 4% 파라포름 알데하이드 용액에 고정시켰고, 파라핀에 침지하였고, 5 ㎛ 두께로 절편을 만들었으며, 일반적인 H&E 염색 공정을 실시하였다. 잔류 세포 성분인 핵을 DAPI 염색으로 재확인하였다. 잔류 DNA 함량을 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)로 측정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 프로테이나제 K (Qiagen)를 24 시간 처리하고, DNA 농도(μg/mg 건조 중량 세포외기질)를 NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 측정하였고, 탈세포 이전 샘플의 초기 건조 중량에서 추출된 DNA 농도를 대조군으로 하였다.

도 4(f)에 나타난 바와 같이, H&E 염색으로 완전한 탈세포화를 확인하였다. 어떠한 조직도 헤마톡실린 양성 핵을 나타내지 않았다. 에오신 염색은 벌집 구조를 가진 지방조직 특유의 구조를 나타내었다. 탈세포화 조직에서 잔류 DNA 함량을 정량화하였다. 모든 잔류 DNA 함량은 허용 범위(<50 ng/mg 건조 중량)에 비해 유의적으로 낮았고(표 1), 이는 세포 및 DNA가 1% Triton X-100 용액에 의해 효과적으로 제거되었음을 나타낸다.

용매	ng/mg
아세톤	2.90 ± 0.08
메탄올	0.56 ± 0.06
에테르	1.81 ± 0.05
클로로포름	1.61 ± 0.42
에탄올	2.88 ± 0.52
이소프로판올	1.82 ± 0.77
물	1.31 ± 0.05
클로로포름/메탄올	1.85 ± 0.50
에탄올/헵탄	2.14 ± 0.19
에테르/메탄올	2.41 ± 0.09
헥산/에탄올	1.06 ± 0.27
부탄올/메탄올	0.21 ± 0.03
무처치 대조군	381.25 ± 0.38

탈세포된 조직의 콜라겐 구조 및 분포는 매슨 삼색염색 키트 (Abcam)로 제조사의 프로토콜에 따라 분석 되었다. 콜라겐 함량은 콜라겐 분석 키트(Abcam)로 측정하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 총 콜라겐을 추출하였다. 구체적으로, 조직(10 mg)을 증류수 100 μL에서 균질화하였고, 10N NaOH 100 μL를 첨가하였으며, 혼합물을 80℃에서 1 시간 동안 처리하였다. 알칼리로 가수분해 후, 세포외기질을 함유한 튜브를 얼음 상에 놓았고 12 N 염산 100 μL를 첨가하여 중화시켰다. 볼텍스 혼합 후, 튜브를 10,000 x g에서 5 분 동안 원심분리하였고, 불용성 부유 잔해를 버렸으며, 상층액을 수집하였다. 마이크로 플레이트 분광광도계(PowerWave XS, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 파장 560 nm로 콜라겐, 구체적으로 히드록시프롤린 농도를 측정하였다.

도 4(g)에 나타난 바와 같이, 매슨 삼색염색은 탈지질 용매의 종류에 따라 콜라겐 보존량이 다르다는 것을 보여주었다. 콜라겐은 아세톤-, 에테르-및 E/M- 처리된 조직에서 풍부한 반면, 메탄올-, 에탄올-, H/E- 및 B/M- 처리된 조직에서는 상대적으로 낮았다.

도 4(h)에 나타난 바와 같이, 보존된 콜라겐의 정량화(μg/g) 결과, 아세톤-처리된 조직(42.49 ± 0.05)에서 콜라겐 농도가 가장 농도가 높았고, 다음으로, E/M-(29.37 ± 0.03), 에테르-(28.32 ± 0.22), 클로로포름-(21.87 ± 0.07), E/H-(21.62 ± 0.08) 및 이소프로판올-(18.84 ± 0.11) 처리 조직 순으로 나타났다. 나머지 군은 대조군인 물-처리 군(17.86 ± 0.12) 보다 낮은 농도를 보였다. 추출된 콜라겐은 갈색이였고, 색상 강도는 대체로 콜라겐 농도에 비례하였다(이소프로판올-처리군은 예외).

SEM을 이용하여 미세구조를 분석하였다. 동결 건조된 세포외기질을 1 시간 동안 0.1M 카코딜레이트 완충액 내 2.5% 글루타르알데하이드에 고정시켰고, 에탄올 시리즈로 탈수시킨 다음, 임계점 건조 및 백금 코팅을 수행하였다.

도 4(i)에 나타난 바와 같이, 조직은 다공성(기공 크기, 50-200 μm)을 지닌 3 차원 구조를 가짐을 보여 주었다. 그러나, 용매의 유형에 따라 미세구조와 표면 특성이 달랐다; 아세톤-, 에테르-, 클로로포름-, C/M-, E/H, E/M, H/E, B/M-처리된 조직은 풍부한 미세 섬유 네트워크를 보였고, 이소프로판올- 처리된 조직은 미세섬유가 드물었으며, 메탄올-, 에탄올- 및 물-처리된 조직은 미세섬유가 없는 매끄럽고 선명한 표면을 보였다.

각 탈지질 용매를 처리한 세포외기질의 세포독성을 평가 하기 위해 인체 신장 근위 세관 상피 세포(#CC-2553, Lonza, Basel, Switzerland)를 구입하여, 인큐베이터(37℃, 5% CO₂)에서 성장 배지(# CC-3190, Lonza)로 배양 하였으며, 4회 계대된 세포를 사용되었다. 세포독성 분석을 위해, 96-구 조직배양기에 한 구당 1x10⁴ 세포를 세포외기질(5x5x1 mm³) 위에 직접 두었고, 같은 조건을 3세트(triple)로 하였다. 세포 생존율은 세포 도입 5 시간 후에 측정하였고, 세포 증식율은 5 일차에 측정하였다. MTT 분석 키트(Roche, Switzerland, Basel)를 사용하여 분석하였고, MTT 시약을 각각의 시점에 첨가하였고, 파장 440 nm에서 광학 밀도(optical density, OD)를 측정하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차로 보고되었다. DNA, RNA, 및 MTT 자료에서 유의성 검정은 Bonferroni 사후 테스트로 일원 분산 분석을 수행하였다. 차이는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. SPSS 16.0 소프트웨어 패키지(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

도 4(j)에 나타난 바와 같이, 아세톤-, 에테르-, 에탄올- 및 물-처리된 조직으로 배양된 세포는 배양기 표면에 펼쳐진 세포 형태를 보인 반면, 그 외 다른군은 둥근 세포 형태와 일부 세포는 부유된 모습을 나타내었다.

도 4(k)에 나타난 바와 같이, 세포 생존율에 대한 MTT 분석에서, 아세톤-, 에탄올-, 이소프로판올-, 물- 및 B/M- 처리된 군에서 평균 OD 값이 상대적으로 높았다. 세포 증식율 분석에서, 아세톤-, C/M-, E/H- 및 B/M- 처리된 조직은 유의적으로 증가된 세포 증식을 나타내었다(막대위의 문자가 다른 경우 P <0.01 수준으로 다른 군임을 의미).

<2-4> 시간에 따른 지질 제거율의 분석

적정 탈지질 용매 처리 시간을 결정하기 위해, 시간에 따른 지질 제거율을 측정하였다. 건조된 조직(0.2 g)을 입방체(5x5x1 mm³)로 절단하여 유리병에 넣었고, 아세톤 1 mL를 첨가하여, 100 rpm 으로 교반 하였다. 새로운 용매를 5 분 마다 교환하여 수집하였고 60분간 실시하였다. 이러한 공정은 흄후드 하에 수행하였다. 지질 분석 키트(Abcam)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 지질 농도를 측정하였다. 대조군으로 순수 아세톤 및 지방조직 건조 시 삼출된 지질을 사용하였고, 이들 농도에 대한 상대적 %로 지질 제거 효율을 표현하였다.

도 5(a)는 시간에 따라 추출된 지질의 농도를 시각화 한것이다. 건조 조직으로부터 삼출된 지질은 진한 갈색이였으며[Ctrl(+)], 아세톤으로 처리 5 분에 채취한 샘플은 옅은 갈색이었다. 10 분 이후, 색상은 점차 노랗게 변하고 점진적으로 투명해졌다. 25 분 후, 색상은 육안으로 구분되지 않는 순수 아세톤과 유사한 투명성을 유지하였다[Ctrl(-)].

도 5(b)에 나타난 바와 같이, 지질 제거율을 정량화하였다. 아세톤 처리 5 분이 경과하면 지질의 43%가 조직으로부터 제거되었고, 25 분이 경과 하면 지질의 90% 이상이 조직으로부터 제거되었으며, 아세톤 처리 45 분이 되면 지질이 조직에서 완전히 제거되었다.

<2-5> 탈세포화 방법의 비교: 물리적 vs. 화학적 vs. 효소적

탈세포화 방법을 최적화하기 위해, 물리적(동결/해동), 화학적(Triton X-100) 및 효소적(트립신) 처리를 비교하였다. 탈세포 비교 실험을 위해, 지질 조직을 세절하여 건조하였고, 아세톤으로 탈지질 하였으며, 증류수로 5회 세척하였다. 물리적 처리를 위해, 조직(1.0 g)을 10 분 동안 액체 질소로 동결시켰고, 즉시 37℃ 수조에서 10 분 간 해동시켰으며, 이러한 과정을 10 회 반복하였다. 화학적 처리를 위해, 동량의 조직을 1% Triton X-100 용액에 담궜고, 4 ℃에서 24 시간 동안 600rpm으로 교반하였으며, 3 시간마다 용액을 교환하였다. 효소적 처리를 위해, 0.05% 트립신[에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 0.53 mM 포함, Gibco, Burlington, Canada]을 첨가하였고, 조직을 37 ℃ 수조에서 12 시간 동안 100 rpm의 속도로 교반하였다.

완전한 탈세포화를 입증하기 위해, H&E 염색, DAPI 염색 및 잔류 DNA 양을 측정하였다. 조직 일부(1x1x1 mm³)를 떼어 24 시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 고정시킨 다음, 파라핀에 침지하였고, 5 μm 두께로 절단하여 일반적인 H&E 염색 공정을 수행하였다. 잔류 세포의 핵은 DAPI를 이용한 형광 염색으로 검출하여 청색 점으로 시각화 하였다. 잔류 DNA 추출은 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따랐다. NanoDrop(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 DNA 농도(ng/mg 건조 중량 세포외기질)를 정량 하였다.

도 6(a)에 나타난 바와 같이, 탈세포화 방법을 비교할 때, 물리적 탈세포화는 10 회 동결-해동 주기 후에 탁한 흰색 조직상을 보인 반면, 화학적 및 효소적 처리는 공정의 끝에 반투명한 흰색 조직상을 나타내었다.

도 6(b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, H&E 및 DAPI 염색으로 세포 잔류물 및 핵을 확인하였다. 물리적으로 처리된 세포외기질은 핵(화살표)이 많이 잔류함을 보였다. 1% Triton X-100 및 트립신으로 처리된 조직은 핵이 보이지 않았다. DAPI 염색에서, 화학적과 효소적 처리에서 보이는 광범위한 밝은 청색은 핵이 아닌 살아있는 유기체가 보이는 자발적 형광이다. H&E 염색으로 시각화된 세포외기질의 패턴에서, 동결-해동 처리된 조직은 조밀하고 말린 섬유상을 보였고, Triton X-100으로 처리된 조직은 잘 퍼진 섬유상을 보였으며, 트립신-처리된 조직은 일부 산재된 두꺼운 섬유다발을 보였다(도 6(b)). 잔류하는 이중가닥(double strand, ds) DNA의 정량화는 완전한 탈세포화를 입증하는 척도이다. 무처치 지방조직(대조군)의 DNA 함량은 381.25 ± 0.38 ng/mg 건조 중량이었다. Triton X-100 및 트립신-처리된 세포외기질의 DNA 함량은 각각 2.09 ± 0.002 및 2.86 ± 0.002 ng/mg 건조 중량이었다. 이러한 농도는 탈세포된 세포외기질에서 dsDNA의 완전한 제거를 나타내면서, 허용 기준치인 50 ng/mg 보다 현저히 낮았다. 이러한 결과는 동결-해동 방법이 지방조직으로부터 완전히 탈세포화 세포외기질을 얻는데 충분하지 않다는 것을 시사하고; Triton X-100 및 트립신 처리는 지방조직 탈세포화에 모두 적합함을 보여준다. 본 발명자들은 산업화를 고려하여 고가인 효소를 대신하여 비용이 낮은 Triton X-100을 최적 공정으로 선택하였다.

<2-6> 제조된 세포외기질의 특성 평가

세절, 건조, 탈지질 및 탈세포화된 세포외기질의 완전한 면역원성 제거를 위해 DNAse I 및 RNAse(각 20 ng/mL, Sigma Aldrich)를 37℃에서 4 시간 동안 100 rpm으로 처리 하였다. 증류수로 5 회 세척한 후, 콜라겐 섬유의 풀어진 말단 면역원을 제거하기 위해 펩신(0.1%, w/v)을 4℃에서 24 시간 동안 300 rpm으로 처리 하였다. 증류수로 5 회 세척한 후, 세포외기질을 진공 동결-건조시켰다. 최종산물의 미세 구조, 잔류 지질, DNA, 단백질 성분 및 세포독성을 평가하였다.

SEM을 이용하여 미세 구조를 분석하였다. SEM 이미징을 위해, 세포외기질을 1 시간 동안 0.1M 카코딜레이트 완충액에 2.5% 글루 타르알데하이드로 고정시켰고, 연속 에탄올로 탈수시킨 다음, 임계점-건조 후 백금 코팅하여 절단 표면을 분석하였다. 오일 레드 O 염색 키트(Abcam)로 잔류 지질을 평가하였고, Massson 트라이 크롬 염색 키트(Abcam)로 콜라겐 섬유 분포를 확인하였으며, 모두 제조사의 프로토콜에 따랐다. 세포외기질 성분을 분석하기 위해 면역조직화학 염색을 수행하였다. 조직이 붙은 슬라이드를 항원 복원을 위해 95℃ 시트레이트 완충액(Biogenex, Fremont, CA)에 10 분간 두었다. 내인성 퍼옥시 다아제 활성을 막기 위해 퍼옥사이드 (Innogenex, San Ramon, CA)를 처리하였고, 비특이적 결합은 탈지유 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 차단하였다. 1차 항체인 Col1, Col4 및 GAG (모두 Abcam, 희석액 1:100)을 4℃에서 24시간 처리한 다음, HRP-표지된 항-토끼 2차 항체(Sigma-Aldrich)를 실온에서 1 시간 동안 처리하였다. 생체외 세포독성 평가를 위해, 인체 신장 근위 세관 상피 세포를 구입하여(#CC-2553, Lonza, Basel, Switzerland), 5% CO₂ 하에 37℃에서 성장 배지(#CC-3190, Lonza)에서 증식시켰으며, 4회 계대된 세포를 사용 하였다. 세포 독성 평가를 위해, 96-구 세포배양기에 세포외기질(5x5x1 mm³)을 두고 세포 1x10⁴를 직접 세포외기질 위에 두었으며, 같은 조건을 3회 반복되도록 하였다. 세포외기질을 넣지 않은 조건을 대조군으로서 사용하였다. 세포 증식율 비교는 3 일차에 실시하였고 MTT 분석 키트(Roche)을 사용하였다.

제조된 세포외기질의 특성 분석 결과는 다음과 같다. 도 7(a)에 나타난 바와 같이, 형태학적 관찰에서, 세포외기질은 3차원 구조의 연질 다공성 스펀지로 나타났다. 도 7(b)에 나타난 바와 같이, SEM 이미지는 네트워크 구조로 다공성을 지니고 표면적이 넓음을 보여준다. 기공 크기는 20-200 μm이고, 내부 기공은 서로 연결되어 있었다. 도 7(c)에 나타난 바와 같이, 오일 레드 O 염색은 지질이 잔류하지 않음을 보여 주었다. 도 7(d)에 나타난 바와 같이, 매슨 삼색염색은 세포외기질의 주요 성분인 콜라겐(화살표)이 다량 보존됨을 보여주었다. 도 7(e)에 나타난 바와 같이, 면역조직화학적 염색은 Col1, Col4 및 GAG가 세포외기질에 보존 되어 있고, Col1 단백질이 상대적으로 풍부함을 보여준다. 도 7(f)에 나타난 바와 같이, 세포 증식율은 3 일째 무처치 대조군과 유사하여 제조된 세포외기질이 세포독성이 없음을 보여준다(95.77%). 도 7(g)에 나타난 바와 같이, 표현형 형태는 세포외기질 처리군에서 증식된 세포가 현탁 또는 응집 없이 배양기 표면에 퍼진 섬유아세포 유사 형태를 보였다.

<2-7> 통계학적 분석

결과는 평균 ± 표준 편차로 보고되었다. 군 간 임의의 유의적인 변화를 확인하기 위해 스튜던트 t- 검정을 적용하였다. 차이는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. SPSS 16.0 소프트웨어 패키지(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

본 발명자들은 신장 이식 수술 후 전량 폐기되는 신장주변 지방조직에서 세포외기질을 분리하는 독보적인 방법을 개발하였다. 세절된 조직은 덩어리 조직에 비해 유의적으로 더 많은 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴 추출을 나타내었다. 건조 조직은 습윤 조직에 비해 빠르고 완전한 지질 제거를 나타내었다. 최적 탈지질 용매는 아세톤 이었고, 아세톤 처리 45분이 경과하면 완전한 탈지질화가 이루어졌다. 최적 탈세포화 방법은 1% Triton X-100을 이용한 화학적 처리였고, 이는 콜라겐 섬유를 잘 보존 하였다. 상기의 방법으로 추출된 세포외기질은 동결건조를 통해 3차원 구조를 가진 연질 다공성 스펀지로 제조 할 수 있고, 세포외기질인 Col1, Col4 및 GAG가 잘 보존 되었으며, 잔류 세포 성분 또는 지질이 없었고, 높은 세포 증식율 및 정상 세포 형태를 나타내었다. 이러한 결과는 인체에서 유래하는 세포외기질 확보라는 큰 의미가 있다.

추출되는 세포외기질의 양을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 프로토콜의 첫번째 단계에서 조직의 세절화를 수행하였다. 세절화는 덩어리를 사용하는 방법에 비해 탈지질 효율을 높여 이후 탈세포 과정을 통해 세포외기질 추출양을 유의적으로 증가 시켰다. 그 원리로, 세절화에 의한 조직 표면적 증가는 용매와의 접촉 면적 증가로 탈지질 효율을 향상시키고 탈세포화가 잘 이루어 지도록 한다. 또한, 지방조직이 세절될 때 세포가 파괴되면 세포내에 있던 리파아제가 방출되며, 이 효소는 지질 가수분해를 유발하여 지질 제거를 촉진한다. 이러한 탈지질 효과는 추출되는 세포외기질 양의 증가를 가져온다. 최종 제품에서 유의적으로 많이 보존된 콜라겐, 피브리노겐 및 라미닌은 조직 재생에 유용할 수 있다. 이러한 세포외기질 단백질은 세포 부착 및 분자 신호 전달을 촉진하는 역할을 한다. 콜라겐은 세포외기질의 주요 성분이고 줄기 세포 특성 유지에 필요하다. 피브리노겐은 Col1과 밀접한 관련이 있는 세포 형태 및 수축을 결정하는 주요 세포외기질이다. 라미닌은 기저층에 상피 세포의 부착을 촉진하고, 혈관 구조를 지지하며, 이들 세포의 이동과 성장에 관여한다. 따라서, 프로토콜의 시작 단계에서 세절화는 세포외기질 수획율 증가에 중요한 한 요소이다.

다음으로, 본 발명자들은 탈지질 효율을 향상시키기 위해 건조 단계를 시험하였다. 조직건조는 해양 및 바이오연료 산업에서 생선과 조류(algae)로부터 경제적으로 지질을 수집하는 방법으로 사용되고 있다. 현재까지 인체 지방조직으로부터 세포외기질 추출 과정에서 건조 단계를 적용한 예는 보고된 바 없다. 본 발명자들은 이러한 건조방법을 적용하여 지질을 효과적으로 제거하였는데, 다량의 지질이 건조 단계에서 삼출되었다. 건조된 조직은 용매를 이용한 탈지질 단계에서 빠르고 완전한 지질 제거를 보인 반면, 습윤 조직은 60분간 탈지질 처리 이후에도 지질이 잔류 하였다. 이러한 결과가 나타난 원인은 지방세포의 물리적 구조 및 구성지질의 화학적 특성 때문이다. 지방세포는 큰 하나의 지질 방울로 된 간단한 구조를 가지고 있다. 이러한 구조적 특성으로 건조와 같은 단순한 물리적 변화에 의해서도 지질이 쉽게 삼출된다. 또한, 지방세포는 중성지방 및 유리 지방산으로 구성되고 이는 물에 녹지 않는다. 따라서, 물이 조직 내에 잔류하면 지질과 용매 사이의 직접적인 접촉을 방해하는 장벽으로 작용하여 지질 제거 효율이 감소된다. 이러한 근거에 기반하여, 조직 건조는 지질 제거를 향상시키기 위한 효과적인 단계일 수 있다.

적절한 탈지질 용매를 선택하기 위해, 본 발명자들은 지질 극성과 세포외기질 보존의 두 가지 요소를 고려하였다. 지방조직은 지방 80%, 물 10% 및 세포 성분 10%로 구성되어 있다. 지방의 주요 성분은 지방산, 중성지방, 인지질 및 콜레스테롤이다. 지방산은 매우 비극성인 탄화수소 사슬에 부착된 카르복실기로 구성된다. 중성지방은 글리세롤 및 매우 비극성인 3개 지방산으로 구성된다. 인지질은 2개 지방산 및 인산기로 구성되고, 지방산은 비극성이고 인산기는 극성이므로; 인지질은 양친매성이다. 콜레스테롤은 매우 비극성이나, 물이 있는 환경에서는 수산화기에 의해 부분 극성을 나타낸다. 비극성 용질은 일반적으로 비극성 용매에 잘 녹으며, 극성 용질은 극성 용매에 잘 녹는다. 따라서, 비극성 용매가 비극성인 지방조직의 탈지질에 적합함을 알 수 있다. 이를 증명하기 위해 극성, 비극성 용매 단독 또는 혼합 용매를 시험 하였다. 본 발명자들은 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 에테르, 에탄올, 이소프로판올, 물, 클로로포름/메탄올, 에탄올/헵탄, 에테르/메탄올, 헥산/에탄올, 및 부탄올/메탄올을 포함한, 12개 용매를 평가하였다. 탈지질 효율 분석은 이러한 지질 극성에 관한 개념이 옳음을 증명하였다. 지질 제거 효율은 용매의 극성과 일치 하였다. 효율은 아세톤-처리된 조직에서 가장 높았고, 다음으로, C/M, E/M, 이소프로판올, 에테르, 클로로포름, H/E, E/H, B/M, 물, 에탄올 및 메탄올로 처리된 조직에서 높았다. 아세톤, 에테르, 클로로포름 및 헥산은 비극성 용매이고, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, 부탄올 및 물은 극성 용매이다. 비극성 용매 단독 및 비극성 기반 혼합용매는 높은 제거 효율을 나타냈다. 비극성 용매는 지질을 잘 녹이는 효과와 더불어 세포막의 인지질도 잘 녹이는 효과가 있다. 비극성 용매는 세포막을 쉽게 분해하여 세포막에 포획 된 지질의 방출을 촉진하면서, 지질 및 세포 구조 사이의 연관도 느슨하게 하여 탈지질 효율을 증가 시켰다. 이외 흥미로운 결과로, 물-처리된 조직도 약 50%의 지질 제거 효과를 나타내었다. 이는 삼투압에 기인한 것으로 여겨지며, 저장성 환경이 세포막의 투과성을 증가시켜, 물의 유입으로 세포 부피가 커지고 이는 세포 구조 약화와 최종적으로 세포 터짐을 유발하므로, 물-처리에 의한 지질 제거 효과를 설명할 수 있다.

오일 레드 O 염색으로 탈지질을 가시화하였다. 메탄올-, 에탄올-, 물-, E/H-, H/E- 및 B/M- 처리된 조직은 조직에서 잔류 지질을 나타내는 빨간색 양성 염색을 보인 반면, 아세톤-, 클로로포름-, 에테르-, 이소프로판올-, C/M- 및 E/M- 처리된 조직은 투명한 이미지로 완전한 지질 제거를 보여 주었다. 체내이식 된 세포외기질에 지질이 잔류하면 조직 재생이 방해받음을 고려하면, 아세톤, 클로로포름, 에테르, 이소프로판올, E/M 및 C/M이 올바른 지질 제거 용매로 간주될 수 있다.

지질 및 수분이 제거된 세포외기질의 Col1, 라미닌 및 GAG의 보존은 면역조직화학 염색으로 확인되었다. Col1은 가장 풍부한 세포외기질이었고, 조직에 고르게 분포하였다. 콜라겐은 세포 접착과 성장을 촉진하기 때문에 생체 재료로 널리 사용된다. 그동안 인체 유래 콜라겐은 사체, 태반 및 유산 된 태아에서 추출되었다. 본 방법에 의해 신장주변 지방조직에서 분리된 콜라겐은 인체 도입 시 안전성과 생체 적합성이 높을 것이다. 라미닌 또한 높은 수준으로 보존 되었다. 라미닌은 상피 세포의 부착, 이동 및 성장과 관련이 있다. 라미닌의 보존은 이식된 세포외기질 내로 숙주 상피 세포의 재증식을 촉진할 수 있다. 클로로포름- 및 이소프로판올-처리된 조직은 라미닌 보존 양이 유의적으로 낮았다. 기존의 탈지질/탈세포 용매로 이소프로판올을 주로 사용하였음을 고려할 때, 본 결과는 종래의 방법이 개선되어야 함을 시사한다. GAG는 생활성 분자 전달 및 세포 성장 인자와 관련이 있다. GAG의 양은 다른 세포외기질에 비해 상대적으로 적었고 물-처리된 조직에서는 거의 검출되지 않았다. 이러한 결과는 보존된 세포외기질 종류 및 양이 용매에 따라 다르므로, 필요로 하는 세포외기질의 종류에 따라 적절한 용매를 선택해야 함을 의미한다.

그다음, 탈지질된 조직을 1% Triton X-100 용액으로 탈세포화하였다. 지방조직의 주요 세포 성분은 지방 세포이고, 일부 섬유아세포, 평활근 세포, 내피 세포, 및 면역 세포(백혈구 및 대 식세포)가 포함되어 있다. 세포 표면에 존재하는 여러 수용체들은 항원으로 작용하여 염증 반응 또는 면역-매개 거부를 초래하기 때문에 세포 성분은 제거되어야 한다. 탈세포화에는 물리적, 화학적 및 효소적 처리가 사용되어 왔고, 화학적 세제가 주로 사용된다. 세제는 소수성 물질을 방출하고 성장 인자, 비-콜라겐성 단백질, 및 콜라겐을 흡착한다. 가장 많이 사용되는 세제는 이온성인 도데실　황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 이었으나, 이 세제는 세포외기질의 고유한 삼차원 구조를 변형 시키고, 이식 시 지지체로 세포 이주를 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 단백질-단백질 상호 작용은 그대로 두고 지질-지질 및 지질-단백질 상호 작용을 억제 할 수 있는 비이온성 세제인 Triton X-100으로 대체하였다. 결과에 나타난 바와 같이, 1% Triton X-100 처리는 완전한 탈세포화 및 높은 세포 생존율을 보였다.

탈세포화 후, 보존된 세포외기질을 매슨 삼색염색으로 콜라겐을 식별하였다. 콜라겐은 아세톤-, 에테르- 및 E/M- 처리된 조직에서 보존되었지만, 메탄올-, 에탄올-, H/E- 및 B/M- 처리된 조직에서는 상대적으로 드물었다. 아세톤 군에서 가장 많은 양의 콜라겐이 보존된 이유로, 아세톤에 의한 콜라겐의 가역적 변성으로 물에 대한 용해도가 낮아졌기 때문이다. 탈지질 공정에서 아세톤은 콜라겐에 탈수를 일으켜 구조적 변성을 초래했고, 변성된 콜라겐은 표면에 소수성 사슬이 노출되어 물에 대한 용해도가 감소하였다. 따라서, 콜라겐은 탈세포화 및 물로 세척하는 단계 동안 잘 보존될 수 있다.

동결-건조 후 촬영된 SEM 이미지는 탈세포화 지방조직이 다공성(기공 크기, 50-200 μm) 3 차원 구조를 가짐을 보여 주었다. 동결-건조법은 물을 제거하고 다공성 구조를 생성하는 일반적인 방법이다. 공극은 적절한 온도(-15 ~ -80℃)에서 냉동될 때 얼음 결정으로 만들어진다. 공극 크기는 얼음 결정 크기에 의존하므로, 공극률은 동결 온도에 의해 조절 될 수 있어; 동결 온도가 감소함에 따라 기공 크기는 감소한다. 본 연구에서는 미세 다공성 공극을 위해 -80℃로 세포외기질을 처리 하였다. 이소프로판올-, 메탄올-, 에탄올- 및 물- 처리된 군을 제외한 대부분의 군에서 미세섬유를 가진 다공성 내부 구조가 잘 발달되어, 제조된 세포외기질이 세포 증식을 지지하기에 충분한 표면적을 가짐을 시사한다. 이소프로판올-처리된 조직은 상대적으로 감소된 미세섬유를 보였다. 메탄올-, 에탄올- 및 물- 처리된 조직은 광택이 있는 매끄러운 표면을 가져 이는 지질이 잔류한 것으로 여겨진다.

생체외 세포독성 분석은 세포외기질의 생체 적합성을 평가하는데 필수적인 항목이다. 세포 생존율 및 세포 증식율은 세포를 세포외기질에 직접 노출시켜 평가하였고 MTT로 정량화 하였다. 세포 생존율 분석에서, 아세톤-, 에탄올-, 이소프로판올-, 물- 및 B/M- 처리된 세포외기질은 상대적으로 높은 OD 값을 나타내었다. 세포가 생존하려면 세포외기질에 효과적으로 부착해야 하므로 세포 생존율을 통해 세포외기질의 표면 특성을 알 수 있다. 세포 표면과 세포외기질이 지닌 부착 분자와 수용체 사이의 협력적인 상호 작용을 통해 세포는 세포외기질에 부착될 수 있고, 이후 세포내 신호전달 경로는 세포 모양 및 운동성을 조절한다. Col1은 세포 표면에 있는 인테그린과 상호 작용하는 아르기닌-글라이신-아스파르트산(RGD) 부위를 노출시켜 세포 부착을 향상시킨다. 성공적으로 부착된 세포는 증식할 수 있다. 세포 증식율 분석에서, 아세톤-, C/M-, E/H- 및 B/M- 처리된 세포외기질은 상대적으로 높은 OD 값을 나타냈다. 세포 증식은 다공성, 콜라겐 유형, 프로테오글라이칸 및 기타 분자 성분과 같은 세포외기질의 물리적 및 생화학적 특성에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명자들은 아세톤-처리된 세포외기질이 인체 신장 근위세관 상피세포 증식에 적합한 미세환경을 제공할 수 있다고 판단하였다.

지질 추출 수율, 세포외기질 보존 및 세포 비독성은 탈지질 공정에서 아세톤 처리에 의해 유의적으로 향상되었다. 따라서, 본 발명은 아세톤의 사용이 조직 재건을 위한 인체유래 세포외기질을 얻기 위해 신장주변 지방조직으로부터 지질을 제거하기 위한 용매로서 강력하게 고려될 수 있음을 나타낼 것이다. 그 동안의 보고들은 지방조직의 탈지질과 탈세포화를 위해 이소프로판올을 주로 사용하였으나, 이소프로판올은 극성 용매이기 때문에 지방조직의 탈지질에 적절하지 않은 것으로 판단된다. 따라서, 본 발명자들은 지방조직 탈지질에 가장 적합한 용매로 아세톤을 제시하였다.

지질 제거 효율은 조직 및 용매의 특성에 따라 크게 달라지기 때문에, 본 발명자들은 탈지질 조건을 고정한 다음 탈지질 효율을 측정하였다. 이러한 실험을 위해, 건조 입방체(5x5x1 mm³) 지방조직 2.0 g을 사용하였고, 용매로 아세톤 1 mL로 처리하였으며, 5 분 마다 용매를 교체하였다. 이러한 조건 하에, 25 분 내에 지질의 90 % 이상이 제거되었고, 45 분 내에 완전 제거를 달성하였다. 따라서, 탈지질 시간은 실험에서 45 분으로 설정되었다. 이러한 탈지질 시간은 조직 크기, 건조도, 용매 유형, 교체 주기, 부피 및 조직 대 용매 비율에 따라 달라질 수 있다.

세포 부산물이 잔류하면 면역 거부 반응을 유도하는 항원으로 작용하기 때문에 탈세포화 과정은 세포외기질 준비에서 필수적인 단계이다. 대표적인 탈세포화 방법은 물리적(동결-해동, 압력, 초음파 처리, 교반 등), 화학적(세제, 산, 알칼리 등) 또는 효소적(트립신, EDTA 등) 처리이다. 이러한 방법들은 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 탈세포 효율은 조직 크기, 두께, 모양, 밀도 또는 성분 등 조직의 특성에 따라 달라진다. 적절한 탈세포화 방법을 선정하기 위해서는, 세포성분의 제거와 세포외기질 성분의 보존 사이의 균형을 고려해야 한다. 각각 탈세포 방법은 세포외기질의 기계적/재료적/기능적 특성, 미세 구조, 세포 거동 또는 숙주 반응에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명자들은 열 스트레스, 삼투압 충격 및 얼음 결정이 세포막을 쉽게 파괴할 수 있기 때문에, 반복적인 동결-해동 과정에 의해 지방조직이 쉽게 파괴될 수 있다고 생각하였다. 그러나 10번의 동결-해동 처리 후에도 많은 세포들이 남아 있었다. 이러한 결과는 지방조직이 물리적 처치에 대해 높은 저항성을 가지기 때문으로, 동결-해동 방법은 신장주변 지방조직 탈세포화에 적합하지 않음을 시사한다. H&E 및 DAPI 염색을 통한 조직학적 분석은 효소적 및 화학적 처리가 지방조직의 탈세포화에 효과적임을 보여주었다. 효소적 방법은 세포외기질에 대한 형태학적 손상을 덜 유발시킬 수 있다. 트립신은 콜라겐을 분해하지 않기 때문에 콜라겐을 분리하기 위해 일반적으로 사용되는 단백질 분해 효소이다. 그러나, 지방조직에는 많은 비-콜라겐성 단백질이 포함되어 있기 때문에 트립신은 콜라겐을 제외한 다른 세포외기질 성분의 손상을 유발 할 수 있다. 또한, 트립신과 같은 효소는 화학적 방법에 사용되는 시약에 비해 상대적으로 고가이다. 따라서, 산업화를 고려할 때, 효소적 방법은 비용적인 측면에서 적절하지 않다. 화학적 탈세포화 방법으로 세제, 산 또는 알칼리 처리가 알려져 있다. 세제는 가장 자주 사용되는 화학 물질이다. 세제는 이온성, 비이온성 및 양쪽성 이온의 세가지 유형으로 세분된다. 대표적인 이온 용액은 SDS이고, 이는 세포 및 핵 막을 완전히 녹이지만. 단백질 변성을 초래하여 생체 적합성이 낮기 때문에 이식체 제조에는 잘 사용하지 않는다. 전형적인 양쪽성 세제는 3-[(3-콜라 미도프로필) 디메틸암모니올-1-프로판설포네이트(CHAPS)로, 세포 성분의 완전 제거 효과는 낮은 것으로 알려져 있다. 대표적인 비이온성 세제는 Triton X-100이고; 이는 DNA-단백질, 지질-단백질 및 지질-지질 상호 작용을 방해하여 세포성분 제거를 촉진하는 반면, 단백질-단백질 상호 작용은 보존하여 세포외기질은 잔존하게 하는 이점이 있다. 이러한 특성에 기반하여, 본 발명자들은 Triton X-100을 적절한 탈세포화 세제로 선택하였다. 0.1% Triton X-100-처리된 신장주변 지방조직은 세포 성분의 완전한 제거 및 높은 세포외기질 보존을 보였다. 본 발명자들은 탈세포화 효율을 향상시키기 위해 두가지 보조 기술을 포함시켰다. 화학적 탈세포화를 기계적 교반과 조합하여 세제 확산, 세포막 용해 및 세포질 해리를 향상시켰다. 또한, PBS 완충액 대신 각각의 탈세포 단계에서 증류수를 사용하였다. 증류수는 저장성 용액이므로 세포막의 팽창을 통한 터짐을 유발할 수 있고, 세제의 침투를 쉽게하고, 잔류하는 세포성 물질, 수용성 지질 및 세제 단편을 제거하는데 도움이 된다.

SEM 이미지는 제조된 세포외기질의 형태가 기공 크기가 20-200 μm 범위이고, 내부 기공이 연결되어 있으며, 적절한 기계적 물성을 가진 다공성 스펀지의 형태라는 것을 보여준다. 다공성이 유지된 3 차원 미세 구조는 영양분 및 대사 산물의 확산이 가능하고, 세포 이동과 부착을 위한 표면을 제공하며, 내부 장기가 주는 물리적 압력을 견딜 수 있다. 오일 레드 O 염색에서, 제조된 세포외기질은 지질이 완전히 제거되었음을 보여주었다. 세포외기질에 남아있는 지질 또는 세포 부산물은 체내 이식 시 면역 반응을 유발 할 수 있다. 매슨 삼색염색은 콜라겐 섬유가 세포외기질의 주요 성분임을 보여주었다. 면역조직화학적 염색은 Col1, Col4 및 GAG가 보존되어 있음을 입증하였다. Col1은 지방조직 세포외기질의 주요 성분으로, 삼중-나선 꼬인 섬유 구조를 형성하며, 아디포카인 분비에 관여한다. Col4는 기저층의 주요 성분으로 비-섬유성 지방조직-특이적 세포외기질이고, 세포 고정에 관여하는 다양한 결합 부위를 함유하고, 지방세포의 생존을 유지 시키는 역할을 한다. GAG는 다당류로 성장 인자와 결합하여 이들의 활성을 유지 시키는 역할을 한다. 탈세포화 후, 면역원으로 작용하는 핵산은 DNA 분해효소와 RNA 분해효소를 처리하여 제거 하였고, 콜라겐 말단의 비나선형 부위는 펩신을 처리하여 제거하였다. 제조된 세포외기질은 MTT 분석 및 세포의 형태적 관찰을 통해 세포-친화적이고 독성을 가지지 않은 생체 적합적 물질임을 입증 하였다.

결론적으로, 세절, 건조, 아세톤을 이용한 탈지질 및 Triton X-100를 이용한 탈세포화는 인체 신장주변 지방조직에서 세포외기질 추출을 위한 최적의 방법으로, 최종산물은 세포 성분 및 지질의 잔류 없이 세포외기질 성분을 효과적으로 보존하였다.

Claims

(a) 인체로부터 분리된 신장주변 지방조직을 세절하는 단계;
(b) 상기 세절된 신장주변 지방조직을 건조시키는 단계;
(c) 상기 건조된 신장주변 지방조직을 탈지질시키는 단계; 및
(d) 상기 탈지질된 신장주변 지방조직을 탈세포화시키는 단계를 포함하는
신장주변 지방조직으로부터 세포외기질의 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 세절된 신장주변 지방조직 내 콜라겐의 농도, 피브로넥틴의 농도 및 라미닌의 농도는 각각 2 μg/mL 이상, 0.15 μg/mL 이상 및 0.12 pg/mL 이상인 것을 특징으로 하는, 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 건조는 0.4 m/sec 내지 1.0 m/sec의 풍속 조건으로 설정된 흄후드 하에 10시간 내지 50시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 탈지질은 아세톤, 에테르 및 에테르/메탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 탈지질용매를 사용하여 수행되고, 이에 따라, 상기 탈지질 효율은 50% 이상이고, 상기 추출된 세포외기질 내 콜라겐의 농도는 20 μg/g 이상인 것을 특징으로 하는, 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 탈지질은 20분 내지 60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 추출방법.
제1항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 탈세포화는 화학적 처리를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 추출방법.
제6항에 있어서,
상기 화학적 처리는 0.1-10% Triton X-100 용액을 사용한 것을 특징으로 하는, 추출방법.
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