CN116218871A - 调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA、病毒质粒、重组转化体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA、病毒质粒、重组转化体和应用。本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA，所述基因PeNGA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明通过基因工程的手段培育得到叶片可以快速生长的蝴蝶兰，从而加快了蝴蝶兰的生长进程，使其具有更快的生长速度优势，为今后定向改良蝴蝶兰品种提供理论依据和新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA、病毒质粒、重组转化体和应用，涉及基因工程技术领域。
背景技术
蝴蝶兰在热带兰中素有“兰中皇后”的美誉，以其高贵典雅、花期长的特点颇受人们喜爱，适于美化客厅、卧室，有很高的观赏价值，畅销国内外市场。基于分子生物学对蝴蝶兰进行育种，培育出快速生长的蝴蝶兰受到了广大科研工作者的关注。
发明内容
本发明提供一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA，通过基因工程的手段加快蝴蝶兰叶片的生长，从而加快的蝴蝶兰的生长进程，为今后改良蝴蝶兰品提供了理论依据和新的思路。
本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA，所述基因PeNGA具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明第二方面提供一种病毒质粒，所述病毒质粒包括上述基因PeNGA。
进一步地，所述病毒质粒为包括所述基因PeNGA的pCymMv病毒质粒。
本发明第三方面提供一种重组转化体，所述重组转化体包括上述病毒质粒。
进一步地，所述重组转化体为包括所述病毒质粒的根瘤农杆菌EHA105。
本发明第四方面提供上述基因PeNGA在调控蝴蝶兰叶片生长中的应用。
本发明第五方面提供一种调控蝴蝶兰叶片生长的方法，包括下调所述蝴蝶兰叶片中基因PeNGA的表达。
进一步地，下调所述蝴蝶兰叶片中基因PeNGA的表达，具体包括：
将基因PeNGA连接到pCymMv病毒质粒上，构建得到病毒质粒；
将所述病毒质粒转化至根瘤农杆菌EHA105中，得到重组转化体；
使用所述重组转化体侵染蝴蝶兰叶片，培养得到基因PeNGA表达下调的蝴蝶兰。
进一步地，所述蝴蝶兰为小金桔蝴蝶兰。
进一步地，所述培养包括：将蝴蝶兰遮光处理12h后恢复光照，并在23℃下进行培养，观察叶片生长情况。
本发明通过基因工程的手段培育得到叶片可以快速生长的蝴蝶兰，从而加快了蝴蝶兰的生长进程，使其具有更快的生长速度优势，为今后定向改良蝴蝶兰品种提供理论依据和新的思路。
附图说明
图1a为不同发育时期的蝴蝶兰叶片；
图1b为不同发育时期的蝴蝶兰叶片中基因PeNGA的表达量；
图2a为pCymMv-PeNGA的VIGS载体转入蝴蝶兰后叶片生长速度的观察结果；
图2b为pCymMv-PeNGA的VIGS载体转入蝴蝶兰后叶片生长速度的折线图；
图3a为对照组(CK)和基因沉默组(pCymMv-PeNGA)蝴蝶兰的表皮细胞观察图；
图3b为对照组(CK)和基因沉默组(pCymMv-PeNGA)蝴蝶兰的表皮细胞数量；
图4为对照组(CK)和基因沉默组(pCymMv-PeNGA)蝴蝶兰内基因PeNGA的表达量；
图5为对照组(CK)和基因沉默组(pCymMv-PeNGA)蝴蝶兰内细胞周期蛋白的表达量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Labortary Press，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
实施例1蝴蝶兰基因PeNGA的提取
使用试剂盒RNAplant(市售)提取小兰屿蝴蝶兰叶片总RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；根据转录组测序结果设计引物(5’→3’F(SEQ ID NO.3)：ATGGAGGCTTCGATCCACTC；3’→5’R(SEQ ID NO.4)：TCAGTTAGCAGGCCTAGGTT)，采用RT-PCR方法从cDNA中扩增出一条855bp的条带。PCR产物回收，获取基因PeNGA，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由284个氨基酸残基组成。分子量为32.364千道尔顿。
实施例2基因PeNGA在小兰屿蝴蝶兰的叶片不同发育时期的表达谱验证
选取如图1a所示的不同发育时期的小兰屿蝴蝶兰叶片，分别编号为S0-S4，根据小兰屿蝴蝶兰基因PeNGA的CDS序列设计q-PCR引物(5’→3’F(SEQ ID NO.5):CAAGGCAAAGAAGTTGCTTGAGACT；3’→5’R(SE Q ID NO.6):GCTCTTACAACTCCTGCGACAAT)，提取小兰屿蝴蝶兰叶片不同发育时期的RNA，反转录成cDNA，以此为模板进行q-PCR验证基因PeNGA在不同发育时期叶片上的表达。
验证结果如图1b所示，在小兰屿蝴蝶兰叶片不同发育时期，基因PeNGA的表达量呈升高趋势，其中，在S0时期表达最低，随着发育表达量不断增高，在S3，S4时期，基因PeNGA的表达量最高，表明该基因调控小兰屿蝴蝶兰叶片的发育。
实施例3利用pCymMv病毒诱导基因PeNGA沉默
(1)以基因PeNGA为模板，设计VIGS引物(5’→3’F(SEQ ID NO.7)：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGACTTAGTGGTGGGTGG A；3’→5’R(SEQ ID NO.8)：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG GGTAGGCCTAGGTTTGCTTTGCT)，并将此部分序列连接到pCymMv病毒质粒上，形成病毒质粒。
(2)以病毒质粒转入根瘤农杆菌EHA105，培养获得菌液，利用注射叶片的方式将菌液注射进小金桔蝴蝶兰(335品种)叶片中，通过病毒诱导基因沉默(Virus induced genesilence,VIGS)方式沉默基因PeNGA，同时，设置对照组pCymMv空载菌液进行注射，即将不包括基因PeNGA的病毒pCymMv载体转化到根瘤农杆菌EHA105中。
(3)进行叶片侵染后，将蝴蝶兰遮光处理12h后恢复正常光照，处于23℃环境下进行培养。
(4)观察新生叶的生长情况，每七天进行一次观察，观察结果如图2a所示，生长速率折线图如图2b所示，可以看出，实验组pCymMv-PeNGA的植株相对于对照组CK植株在第二周时，生长率出现显著性增高。
(5)对pCymMv-PeNGA基因沉默株系和CK株系进行显微镜下表皮细胞的观察，观察结果如图3a所示，细胞数目统计结果图3b所示，pCymMv-PeNGA植株相比于CK植株表皮细胞的数目无显著性变化，但是面积在相同时间内实验组是变化更大的(生长速度加快)。
(6)对pCymMv-PeNGA沉默株系进行定量分析，分析结果如图4所示，基因PeNGA在侵染植株中表达量被显著性下调。
实施例4对基因PeNGA沉默株系中细胞周期蛋白进行分析
对基因PeNGA沉默株系和对照株系中的细胞周期蛋白PeCYCA3-1、PeCYCD1、PeCYCP3-1、PeCYCP48的表达量进行分析，分析结果如图5所示，在pCymMv-PeNGA沉默株系中四种细胞周期蛋白的表达量均被显著上调。
综上，蝴蝶兰植株中基因PeNGA在沉默情况下，叶片的细胞增殖加快，叶片出现快速生长状况，为今后定向改良蝴蝶兰品种提供理论依据和新的思路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种调控蝴蝶兰叶片生长的基因PeNGA，其特征在于，所述基因PeNGA具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一种病毒质粒，其特征在于，所述病毒质粒包括权利要求1所述的基因PeNGA。
3.根据权利要求2所述的病毒质粒，其特征在于，所述病毒质粒为包括所述基因PeNGA的pCymMv病毒质粒。
4.一种重组转化体，其特征在于，所述重组转化体包括权利要求2-3任一项所述病毒质粒。
5.根据权利要求4所述的重组转化体，其特征在于，所述重组转化体为包括所述病毒质粒的根瘤农杆菌EHA105。
6.权利要求1所述的基因PeNGA在调控蝴蝶兰叶片生长中的应用。
7.一种调控蝴蝶兰叶片生长的方法，其特征在于，包括下调所述蝴蝶兰叶片中基因PeNGA的表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，下调所述蝴蝶兰叶片中基因PeNGA的表达，具体包括：
将基因PeNGA连接到pCymMv病毒质粒上，构建得到病毒质粒；
将所述病毒质粒转化至根瘤农杆菌EHA105中，得到重组转化体；
使用所述重组转化体侵染蝴蝶兰叶片，培养得到基因PeNGA表达下调的蝴蝶兰。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述蝴蝶兰为小金桔蝴蝶兰。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养包括：
将蝴蝶兰遮光处理12h后恢复光照，并在23℃下进行培养，观察叶片生长情况。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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